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膜分离和电泳Membraneseparationandelectrophoresis Chapter9 本章主要知识点 膜分离技术的概念 膜分离技术的分类 各种膜的分离特性 对于膜材料的基本要求 主要的膜组件类型 超滤和反渗透过程中渗透压的影响 超滤的基本方程了解亲和膜分离技术了解电渗析的工作原理 膜分离技术 膜分离的概念 利用膜的选择性 孔径大小 以膜的两侧存在的能量差作为推动力 由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术 膜的概念 在一种流体相间有一层薄的凝聚相物质 把流体相分隔开来成为两部分 这一薄层物质称为膜 膜本身是均一的一相或由两相以上凝聚物构成的复合体被膜分开的流体相物质是液体或气体膜的厚度应在0 5mm以下 否则不能称其为膜 膜分离技术的类型和定义 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程 近似于筛分过程 依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的 故而可以按分离粒子大小进行分类 微滤 MF 以多孔细小薄膜为过滤介质 压力差为推动力 使不溶性物质得以分离的操作 孔径分布范围在0 025 14 m之间 超滤 UF 分离介质同上 但孔径更小 为0 001 0 02 m 分离推动力仍为压力差 适合于分离酶 蛋白质等生物大分子物质 纳滤 以压力差为推动力 从溶液中分离300 1000小分子量的膜分离过程 孔径分布在平均2nm 反渗透 RO 是一种以压力差为推动力 从溶液中分离出溶剂的膜分离操作 孔径范围在0 0001 0 001 m之间 由于分离的溶剂分子往往很小 不能忽略渗透压的作用 故而成为反渗透 电渗析 以电位差为推动力 利用离子交换膜的选择透过性 从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作 水 各种膜的分离特性 膜的分类 按孔径大小 微滤膜 超滤膜 纳滤膜 反渗透膜按膜结构 对称性膜 不对称膜 复合膜 其它膜 荷电膜 即离子交换膜 液膜 微孔膜 动态膜 按材料分 合成有机聚合物膜 无机材料膜 膜材料的特性 对于不同种类的膜都有一个基本要求 耐压 膜孔径小 要保持高通量就必须施加较高的压力 一般模操作的压力范围在0 1 0 5MPa 反渗透膜的压力更高 约为1 10MPa耐高温 高通量带来的温度升高和清洗的需要耐酸碱 防止分离过程中 以及清洗过程中的水解 化学相容性 保持膜的稳定性 生物相容性 防止生物大分子的变性 成本低 各种膜材料 有机高分子膜 纤维素酯膜 缩合系聚合物 聚砜类 聚烯烃及其共聚物 脂肪族或芳香族聚酰胺类聚合物 全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物 聚碳酸酯 无机多孔膜 陶瓷膜 各种膜组件 平板式管式中空纤维螺旋卷绕式 平板式膜组件 管式膜组件 螺旋卷式膜组件 与书上图9 11组成有异 中空纤维式膜组件 膜过滤的基本概念和理论 超滤和反渗透目的 将溶质通过一层具有选择性的薄膜 从溶液中分离出来 分离时的推动力都是压强 由于被分离物质的分子量和直径大小差别及膜孔结构不同 其采用的压强大小不同 反渗透膜的操作压力高达10MPa 超滤和反渗透操作中的渗透压 由于超滤和反渗透过程都是用一种半透膜把两种不同浓度的溶液隔开 淡水或盐水 因此都存在渗透压 渗透压的大小取决于溶液的种类 浓度和温度 一般说来 无机小分子的渗透压要比有机大分子溶质的渗透压高得多 渗透与反渗透 实现超滤和反渗透的条件 超滤 需要增加流体的静压力 改变天然过程的方向 才可能发生含有低分子量化合物的溶剂流通过膜 此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差 反渗透 过程类似于超滤 只是纯溶剂通过膜 而低分子量的化合物被截留 因此 操作压力比超滤大得多 因此 超滤和反渗透通常又被称之为 强制膜分离过程 膜过滤的基础理论 膜分离过程的机理 1 超滤与微滤 毛细管流动模型 孔模型 被认为是简单的筛分过程 大于膜表面毛细孔的分子被截留 较小的分子则能通过 2 反渗透 1 溶解 扩散模型 反渗透膜的表皮层电镜下观察没有发现孔道 排除了溶液主体以滞流方式流经表皮层的可能 因此假定溶质和溶剂都能溶解在膜中 然后在化学势推动下扩散通过膜 物质渗透能力决定于 扩散系数和溶解度 适于无机盐的反渗透过程 常不适用于有机物 2 优先吸附 毛细管模型 膜表面对料液中某一组分的吸附能力较强 在膜表面始终形成一层吸附层 在压力下使其连续流经毛细孔 适于无机盐的反渗透过程 也能解释有机物的反渗透过程 纳米膜过滤技术 介于反渗透与超滤膜之间 能截留有机小分子而使大部分无机盐通过 特点 在过滤分离过程中 能截留小分子有机物 并可以同时透析除盐 集浓缩与透析为一体 操作压力低 纳滤膜的性质与特点 有多层聚合薄膜组成 滤膜为多孔性材料 平均孔径为2nm 截留分子量范围在100 200道尔顿之间 同样要求其具有良好的热稳定性 pH稳定性 有机溶剂稳定性 主要产品 MembraneproductsKiryatWeizmann MPW 以色列 DesalinationSystem 美国 SelRO DESAL 5 FT 40等系列膜 Filmtech公司 美国 明尼苏达 纳米过滤的分离机理 纳滤分离机理与反渗透膜了类似 纳滤的应用 膜亲和过滤法 膜亲和过滤法是传统膜分离技术与亲和分离技术的集成 是一种十分有效的分离方法 内容 包括两个分支亲和膜分离 制备带有亲和配基的分离膜 直接进行产物分离 亲和 错流膜过滤 将水溶性或非水溶性的高分子亲和载体与产物进行特异性反应 然后进行错流过滤 亲和膜分离技术 分离膜的改性 通过化学改性 在载体表面连接上一条 手臂链 大于三个碳原子 亲和膜制备 选用合适的配基 Ligand 与手臂链相连 构成带有亲和配基的分离介质 亲和络合 将混合物缓慢地通过膜 使要分离的物质与亲和配基产生特异性作用 形成配基与配位物 Ligate 的复合体 洗脱 改变条件 洗脱液组成 pH 离子强度 温度等 使复合物解离 亲和膜再生 洗涤 再生 平衡 以备下次操作使用 需解决的关键问题 膜表面要有足够多的并可利用的化学基团 表面积和孔径要足够大孔分布要窄而均匀 以获得高的通透量和分离效率 机械强度要高 要耐酸碱和高温 亲和膜分离操作方式 亲和超滤过程 分离目标物的同时 浓缩其他成分 微孔亲和过滤过程 仅分离目标物 亲和膜过滤纯化伴刀豆蛋白A的实验装置 电渗析技术 电渗析技术是在直流电场的作用下 由于离子交换膜的阻隔作用 实现溶液的淡化和浓缩 分离推动力是静电引力 膜分离过程在生物工程中的应用 本章作业 膜分离技术的概念 根据膜孔径大小 膜分离技术可分为哪几类 主要的膜组件有哪些 何谓反渗透膜分离过程 其特点有哪些 何谓强制膜分离过程 简述电渗析膜分离的基本原理 电泳技术Electrophoresis 本章主要知识点 电泳的概念电泳的基本原理电泳技术的分类常用的凝胶电泳技术有哪些 电泳装置的基本组成聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程 SDS PAGE电泳的基本原理及过程琼脂糖电泳的特点及其应用等电聚焦电泳的基本原理双相电泳的概念及其特点 电泳概念 ArneTiselius 物理化学家 诺贝尔奖金获得者定义 荷电的胶体粒子在电场中的移动 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层 离子尺寸越大 溶液中的离子强度越高时 电泳现象变得越明显 因此 电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用 电泳的简单原理 蛋白质 核酸 多糖等常以颗粒分散在溶液中 它们的净电荷取决于介质的H 浓度或与其它大分子的相互作用 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状 分子所带电荷或分子的生物学与化学特性 Stoke sLaw 斯托克斯定律 如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中 使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E 它们与介质的摩擦阻力f相抗衡 这种抗衡服从斯托克斯定律 f 6 rv v是介质粘度为 中半径为r的颗粒的移动速度 但实际情况中 f还取决于凝胶厚度 颗粒尺寸 甚至是介质的内渗等 电泳迁移率 电泳迁移率 mobility 在电位梯度E的影响下 带电颗粒在时间t中的迁移距离d 其单位是cm2 sec 1 V 1电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础 电泳的大致分类 依据电泳原理 现有三种形式的电泳分离系统移动界面电泳 movingboundaryelectrophoresis 区带电泳 zoneelectrophoresis 稳态电泳 steadystateelectrophoresis 其中区带电泳是目前常用的电泳系统 区带电泳的主要技术 区带电泳中的常用技术载体电泳 粉末电泳 纸电泳 凝胶电泳 聚焦电泳无载体电泳 自由电泳 毛细管电泳 凝胶电泳 作为电泳支持介质必须具有 化学惰性 不干扰大分子的电泳过程 化学稳定性好 均匀 重复性好 电内渗小等特性 凝胶电泳的支持介质 聚丙烯酰胺凝胶 polyacrylamidegel PGA 由丙烯酰胺和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下 聚合而成 琼脂糖凝胶 从琼脂中精制分离出的胶状多糖 其分子结构大部分是由1 3连接的 D吡喃半乳糖和1 4连接的3 6脱水 D吡喃半乳糖交替形成的 丙烯酰胺的聚合 丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的 通常采用过硫酸铵 过硫酸钾或核黄素 引发剂 来引发该过程 以N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 为增速剂 该引发 增速的催化系统实质是自由基催化的氧化 还原过程 丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下 产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态 经过一系列的自由基反应得到的聚合物 影响聚合的主要因素 引发剂和增速剂的浓度 浓度小易导致聚合速度慢 浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变 一般控制使聚合过程在40 60分钟内完成 系统pH值 酸性条件 碱性条件均可 但仍然存在一个最佳pH值 以获得最佳的聚合结果 温度 低温下聚合导致凝胶变脆和混浊 适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性 分子氧 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合 抽气系统纯度 金属离子会影响凝胶的聚合 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应 在使用凝胶介质的电泳中 由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力 因此不仅可以防止对流 而且可以把扩散减到最小 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷 尺寸和形状凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力 Sizesievingcapacity 这种现象被称为分子筛效应 molecularsievingeffect 分子筛效应 图中A B C均为阳离子 在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为MA MB MC 所带电荷量相同QA QB QC 琼脂糖凝胶的性能 结构与特点 其优点如下 琼脂糖凝胶孔径较大 0 075 琼脂糖的孔径为800nm 可以分析百万道尔顿分子量的大分子 但分辨率较凝胶电泳低 机械强度高 可以在浓度1 以下使用 无毒 染色 脱色程序简单 背景色较低 热可逆性 生物中性 一般不与生物材料结合 电内渗 EEO 大 对于对流电泳有益 电泳新介质 N 取代聚丙烯酰胺介质 Poly N acryl tris NAT gelN AcryloylsugarsAcryloylmorpholineHydrolinkgelsN acryloylaminoethoxyethanol AAEE 特点 具有极强的水解稳定性具有高度亲水性孔径大 电泳系统的基本组成 电泳槽 是凝胶电泳系统的核心部分 管式电泳槽 垂直板电泳槽 水平板电泳槽电源 聚丙烯酰胺凝胶电泳200 600V 载体两性电解质等电聚焦电泳1000 2000V 固相梯度等电聚焦3000 8000V外循环恒温系统 高电压会产生高热 需冷却 凝胶干燥器 用于电泳和染色后的干燥 灌胶模具 制胶 玻璃板和梳子 电泳转移装置 利用低电压 大电流的直流电场 使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上 如PVDF膜 电泳洗脱仪 回收样品凝胶扫描和摄录装置 对电泳区带进行扫描 从而给出定量的结果 垂直电泳槽及灌胶模具 电泳的一般过程 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 是多孔介质 不仅能防止对流 把扩散减少到最低 而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级 能主动参与生物分子的分离 具有分子筛效应 因此 在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时 在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度 还取决于蛋白质的尺寸和形状 PAGE可以用圆盘电泳 垂直电泳或水平电泳 电泳前的准备工作 缓冲系统的选择 保证蛋白质的溶解性能 稳定性以及生物活性的保持 电泳时间和分辨率 从理论上讲PAGE可以在任何pH进行 但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解 脱酰胺 因此 pH应限制在3 10之间 缓冲系统的选择原则 是两种标准的对立权衡如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电点 蛋白质分子所带电荷的密度大 电泳时间短 区带细而窄 如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点 则蛋白质分子之间的电荷密度差别大 分辨率就高 因此 常常选择pH8 0 9 5的缓冲 常用的缓冲液有Tris 甘氨酸 pH8 3 9 5 Tris 硼酸 pH8 3 9 3 和Tris 醋酸 pH7 2 8 5 离子强度的选择 离子强度不宜过高 此时电导率低 产热少 电泳速度快 但也不可过低 必须具有一定的缓冲能力 过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝 一般选择缓冲液的离子强度为0 01 0 1mol L之间 凝胶浓度的选择 由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度 而且取决于分子的大小 形状 因此 与凝胶的分子筛效应 即凝胶的孔径与电泳的分辨率 电泳速度 密切相关 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状 可以将凝胶分为 非排阻性凝胶 unrestrictivegel 浓度0 7 1 0 的琼脂糖凝胶 排阻性凝胶 restrictivegel 浓度大于1 的琼脂糖凝胶和常规PAGE 凝胶浓度太大 孔径小于样品分子尺寸 电泳时蛋白质分子不能进入凝胶 样品仍留在加样位置 凝胶浓度太小 孔径太大 样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进 不能得到很好的分离 凝胶浓度与分子量测定的关系 PAGE的具体操作过程 制胶 确定凝胶配方 凝胶 引发剂 增速剂的浓度和缓冲液 使用灌胶模具灌胶 样品准备 选择合适的样品缓冲液 确定合适的样品浓度 1 2mg L 考染 加样 溴酚蓝 电泳 4 6小时 待溴酚蓝前沿到达阳极底部 检测 紫外扫描或染色 考马斯亮蓝R 250 银染色 灵敏度比考染高100倍 荧光探针 照相 凝胶干燥 定量测定 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定 特点 设备简单 操作简便 测定快速 重复性高 样品无需纯化 SDS PAGE的原理 蛋白质分子的解聚SDS是一种阴离子去污剂 作为变性剂和助溶性试剂 能断裂分子内和分子间的氢键 使分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级 三级结构 而强还原剂 如二硫苏糖醇 巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂 因此 在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后 蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链 解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后 形成带负电的蛋白质 SDS胶束 所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量 消除了不同分子间的电荷差异 同时 蛋白质 SDS聚合体的形状也基本相同 这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响 蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变 未知蛋白质分子量的测定 基于上述SDS PAGE的原理介绍 我们可以利用SDS PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定 以不同分子量的标准蛋白进行SDS PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率 制作标准校正曲线 然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS PAGE电泳 测定迁移率 从标准曲线得到相应的分子量 载体两性电解质pH梯度等电聚焦 等电聚焦 isoelectrofocusing IEF利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同 在一个稳定的 连续的 线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析 利用等电聚焦技术分离 分析的对象仅限于蛋白质和两性分子 根据建立pH梯度的原理不同 梯度有分为载体两性电解质梯度 CarrierampholytespHgradient 和固相梯度 工作原理 蛋白质的等电点蛋白质最主要的特性是它的带电行为 它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电 只是在某一pH时 蛋白质的净电荷为0 此pH即为该蛋白的等电点 isoelectricpointpI 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象 是一个物理化学常数 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离 分析 载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理 载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质 通以直流电后在两极之间形成稳定 连续和线性的pH梯度 当带电的蛋白质分子进入该体系时 便会产生移动 并聚集于相当于其等电点的位置 等电聚焦分离示意图 常规PAGE和等电聚焦电泳的区别 载体两性电解质和pH梯度的形成 等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立载体两性电解质的概念 作为载体两性电解质应该具有以下特点 应该是两性的 使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置 应该可以作为 载体 两性电解质不能用于等电聚焦 只有载体两性电解质 即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦