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免疫学检验 第二十一章化学发光免疫技术 1 化学发光剂的概念及常用的化学发光剂 2 化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型 3 化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技术 4 电化学发光免疫分析基本原理 5 化学发光免疫技术的临床应用 本章要点 目录 化学发光免疫技术是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的抗原抗体反应技术相结合 用于各种抗原 半抗原 抗体 激素 酶 维生素和药物等的检测分析技术 该技术具有特异性高 灵敏度高 分离简便 快速 试剂无毒 安全稳定 可自动化分析等特点 在免疫学检验中应用广泛 前言 放射免疫技术 酶免疫技术 荧光免疫技术 金免疫技术 化学发光免疫技术 标记免疫技术 第一节基本知识 一 发光 发光是指分子或原子中的电子吸收能量后 由低能级的基态跃迁到高能级的激发态 然后再返回到基态 释放出的能量表现为光的发射 根据形成激发态的激发能不同可将发光分为光照发光 生物发光和化学发光 1 光照发光 photoluminescence 发光剂 荧光素 经短波长入射光照射后进入激发态 当回复至基态时发出较长波长的可见光 2 生物发光 bioluminescence 发生在生物体内的发光现象 如萤火虫的发光 反应底物为萤火虫荧光素 在荧光素酶的催化下 利用ATP产能 生成激发态氧化型荧光素 它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来 3 化学发光 某些物质 发光剂 在化学反应时 吸收了反应过程中所产生的化学能 使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态 当电子从激发态回复到基态时 以发射光子的形式释放出能量 这一现象称为化学发光 一个化学反应要产生化学发光现象 必须满足以下条件 该反应必须提供足够的激发能 并由某一步骤单独提供 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光 要有有利的反应过程 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态 激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物 二 化学发光剂 作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下几个条件 发光的量子产率高 物理 化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性 常用的化学发光剂或发光底物有1 直接化学发光剂2 酶促反应的发光底物3 电化学发光剂 1 直接化学发光剂 在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用 直接参与发光反应 它们在化学结构上有产生发光的特有基团 可直接标记抗原或抗体 如常用的吖啶酯 acridinium AE 吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时 发出波长为470nm的光 具有很高的发光效率 其激发态产物N 甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体 2 酶促反应的发光底物 是利用标记酶的催化作用 使发光剂 底物 发光 目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶 HRP 和碱性磷酸酶 ALP HRP的常用的发光底物为鲁米诺或其衍生物 ALP的发光底物为金刚烷 AMPPD 1 鲁米诺或其衍生物 鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化 发生化学发光反应 辐射出最大发射波长为425nm的光 鲁米诺增强发光反应原理 2 AMPPD 3 2 螺旋金刚烷 4 甲氧基 4 3 磷酰氧基 苯 1 2 二氧杂环丁烷 3 电化学发光剂 电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发光的物质 如化学发光剂三联吡啶钌 Ru bpy 3 2 和电子供体三丙胺 TPA 在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应 用化学发光剂 如吖啶酯 直接标记抗体 抗原 与待测标本中相应的抗原 抗体 和磁颗粒性的抗体 抗原 发生免疫反应后 通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来 这时只需加入氧化剂 H2O2 和NaOH使成碱性环境 吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解 发光 由集光器和光电倍增管接收 记录单位时间内所产生的光子能 可从标准曲线上计算出待测抗原 抗体 的含量 第二节化学发光免疫分析 一 检测原理 化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 1 分离方法常用磁颗粒分离技术 即用抗原或抗体包被磁颗粒 与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后 最终通过在磁场中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物进行分离的技术 二 方法类型 2 常用的免疫学反应模式 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 双抗体夹心法 三 技术要点 抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离 磁颗粒分离技术 化学发光反应 化学发光酶免疫分析 CLEIA 是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶 HRP 或碱性磷酸酶 ALP 来标记抗原或抗体 在与待测标本中相应的抗体 抗原 发生免疫反应后 经洗涤将结合物与游离的酶标物分离后 加入底物 发光剂 酶催化和分解底物发光 由光量子阅读系统接收 光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大 再把它们传送至计算机数据处理系统 计算出测定物的浓度 第三节化学发光酶免疫分析 一 检测原理 碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图 1 根据标记酶不同分类可分为辣根过氧化物酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标记的化学发光酶免疫分析 前者常以鲁米诺或其衍生物作为发光底物 后者常以AMPPD作为发光底物 2 根据免疫学反应模式分类同化学发光免疫分析 主要有双抗体夹心法 双抗原夹心法和固相抗原竞争法等主要模式 所不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而不是直接标记发光剂 二 方法类型 三 技术要点 抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离 磁颗粒分离法 微粒子捕获法 包被聚苯乙烯反应珠或孔分离法 酶促发光反应 电化学发光免疫分析 ECLIA 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体 抗原 通过抗原抗体反应和磁珠分离技术 根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定量分析 它包括电化学和化学发光两个过程 第四节电化学发光免疫分析 一 检测原理 电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 电化学发光免疫测定示意图 1 分离方法常用磁颗粒分离技术2 免疫学反应模式其反应模式同发光免疫分析 主要有双抗体夹心法 双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式 所不同只是相应抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌 二 方法类型 三 技术要点 抗原抗体反应 结合物与游离物的分离 磁颗粒分离技术 电化学发光过程 第五节化学发光免疫技术的临床应用 一 化学发光免疫技术的特点 1 敏感度高 甚至超过RIA 2 精密度和准确性均可与RIA相比 3 试剂稳定 无毒害 4 测定耗时短 5 测定项目多 6 已发展成自动化测定系统 1 甲状腺激素T3 T4 hTSH FT4 FT3 抗TPO 甲状腺球蛋白 抗甲状腺球蛋白抗体等 2 生殖激素 HCG 催乳素 促卵泡激素 促黄体激素 孕酮 雌二醇 非结合雌三醇 甲胎蛋白 睾丸酮 硫酸脱氢异雄酮 3 肾上腺 垂体激素皮质醇 尿皮质醇 人生长激素 甲状旁腺素 促肾上腺皮质激素 二 化学发光免疫技术常见的检测项目 4 贫血因子维生素B12 叶酸 红细胞叶酸 铁蛋白等 5 肿瘤标记物AFP CEA PSA 游离PSA CAl9 9 CAl25 CAl5 3等 6 感染性疾病衣原体抗原 尿衣原体抗原 衣原体抗原确认 弓形体IgG抗体 弓形体IgM抗体 风疹病毒IgG抗体 风疹病毒IgM抗体 巨细胞病毒IgG抗体 巨细胞病毒IgM抗体等 二 化学发光免疫技术常见的检测项目 7 糖尿病胰岛素 C肽等 8 心血管系统肌酸激酶MB同工酶 地高辛 肌红蛋白 心肌肌钙蛋白 I等 9 病毒标记物HIVl 2Ab HBsAg HBsAg确认 HBsAb HCVAb HAVIgM HAVAb HBcAb HBclgM HBeAg HBeAb等 二 化学发光免疫技术常见的检测项目 10 骨代谢骨胶原酶 脱氧吡啶啉等 11 过敏性疾病总IgE 特异性IgE等 12 治疗药物监测