土牛膝及其药用价值

1 1 前言 1 1 土牛膝及其药用价值简介 土牛膝 别名倒扣草 倒扣簕 倒钩草 粗毛牛膝 鸡掇鼻 鸡骨癀 为苋科 植物粗毛牛膝 Achyranthes aspera L 牛膝A bidentata B1 野生种的根 1 产于福建 广西 广东 四川 云南 河南 湖南等地 秋季采挖 洗净 晒干 生用 亦用 鲜品 中国药典汇编 对土牛膝有如下记载 a 药理 1 人体体内显抗肿瘤的治疗作用 2 毛牛膝煎剂在动物体内能中和白喉杆菌毒素 并有预防白喉的作用 3 土牛膝煎剂或醇提取液对醉犬 猎 兔作静脉注射 均有短暂的降压作用 4 土牛膝煎剂静脉注射于麻醉家兔 有轻微利尿作用 腹腔注射于已用醋酸 产生扭转的小鼠呈一定的止痛作用 5 土牛膝煎剂对动物离体肠管有轻度抑制作用 6 土牛膝煎剂和流浸膏对家兔离体子宫不论已孕 末孕都能使之收缩 对收缩无 力的小鼠离体子宫则有加强其收缩的作用 b 药性 苦 凉 归肺 脾 肝 膀胱经 c 药效 败毒抗癌 逐淤除痹 消炎利尿 随着对土牛膝的研究不断深入 它的药用价值也与日俱增 临床应用方面 早 在1958年上半年 佛山专区召开了 土牛膝疗法治疗白喉经验交流会议 2 会上黄华 庭老中医作了 我对用土牛膝复方治疗白喉的经验和体会 的发言 详细介绍了土牛膝 治疗白喉的发掘的经过及治疗78例白喉的系统情况许多单验方中将土牛膝煎服或捣 烂取汁含漱 对治疗扁桃体炎具有明显效果 近年来 人们开始了对土牛膝在降低 糖尿病患者血糖浓度方面的功效的研究 在探讨其治疗2型糖尿病有效成分研究方面 已拉开了序幕 1 2 中药微量元素与药效的关系 生物体内的微量元素是指含量占生物体总质量 0 01 以下的元素 微量元素在人体内 的含量分少 但在生命活动中的作用却是十分重要的 对中药发挥疗效的物质基础的研究 除了其有机成分外 微量元素所起的作用也日益受到人们的重视 特别是中药中具有毒性 的重金属 如砷 汞等 对人体的健康有极大的影响 因此 中药中微量元素含量的测定 有着重要的意义 2 1 3 关于微量元素砷和汞 砷 又名砒 是一种广泛分布于自然界的一种金属 在土壤 水 矿物 植物中都能 检 测出微量的砷 正常人体组织中也含有微量的砷 本来单质砷因不溶解于水 是没有毒性 的 但是砷化物 特别是三氧化二砷 却是剧毒的 通常说的砷中毒 实际上是砷化物 主要是三氧化二砷中毒 三氧化二砷 又名砒霜 纯砒霜 色白 无味 易溶于水 溶解 度可高达 30 砷化物的毒性主要是与人体中酶系统的巯基结合 致使酶功能发生障碍 影 响细胞正常代谢 3 汞 又名水银 是人体的一种非必须元素 FAO WHO 将汞定为优先研究的有害金属 之一 汞及汞化合物都可以透过皮肤进入人体 危及人体健康 4 1 4 论文相关的研究动态及理论和实践意义 目前 药材重金属研究主要有以下5个方面 1 单味中药材重金属含量的测定 2 同一功效 不同药材重金属含量的研究 3 不同产地 同一药材重金属含量的研究 4 同种药材不同药用部位重金属的研究 5 原生药材与炮制品重金属比较研究 当前 国际和国家对中药材及中成药的重金属含量都有了严格的控制 国家有关 部门已经把中药材重金属研究列入重点研究项目 开展中药材重金属研究是适应国际 国内形式发展的需要和中医药发展的要求 土牛膝是一种常见的野生中药材 来源简单易得 并且广泛用于医药中 药理作 用强 与人们生活关系密切 这使得对土牛膝的研究更具有价值和现实意义 不少的 研究者选择牛膝作为样品进行研究 郑州大学的吴拥军 李建军 孙武勇等利用火焰 原子吸收光谱法测定了牛膝中的铜 锌 铁的含量 5 梅全喜 吴惠妃等对广东土牛 膝的药用历史及现代研究状况进行了深入的研究 6 中国中医研究院中药研究所的李 先端 胡世林采用薄层色谱法对不同产地土牛膝的齐墩果酸含量测定进行了研究 7 随着研究的深入 对土牛膝的认识也更深刻 利用氢化发生原子吸收光谱法在测定微 量元素的含量 具有谱线简单 灵敏度高 检出限低 选择性好 适用范围宽 适用 于多元素同时分析等优点 国内的研究者外虽然对土牛膝做了大量的研究 但对其微量元素的研究甚少 特 别是对土牛膝中砷和汞的研究 所以 研究土牛膝中砷和汞的含量有着重要的意义 2 实验部分 3 2 1 实验试剂与仪器 WFX 130A型原子吸收分光光度计 北京瑞利分析仪器公司 WHG 103A氢化物发 生器 北京瑞利分析仪器公司 AY 220型电子天平 Sdimadzu corporation Japan JRY X350型消解器 SZ 93型自动三重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 三氧化二砷 二氯化汞 硫脲 抗坏血酸 重铬酸钾 硼氰化钾 氢氧化钠 硝酸 高氯酸为优级纯 其余试剂均为分析纯 实验用水为三次蒸馏水 土牛膝 分别采于北京 成都 长沙 郴州郊外 2 2 仪器的工作条件及测量参数 为了探索出最佳的仪器条件和测量条件 研究过程中进行了一系列的摸索实验 从仪器的灵敏度及其测量时的分析信号图来看 本文得出了测量砷和汞的仪器工作条 件见表1 砷和汞的测量参数见表2 表1 仪器工作条件 Table 1 Working conditions of equipment 元素波长 nm 载气流量 nm min 1 灯电流 mA元素灯 狭缝宽 nm计算方法 As Hg 253 7 193 7 100 100 5 3 HCL HCL 0 4 0 4 峰面积 峰面积 表 2 测量参数 Table 2 The measure parameter 元素 分析信号阻尼常数 读数时间 s 测量方式 As Hg 峰面积 峰面积 1 24 1 24 工作曲线法 工作曲线法 2 3 样品采集与处理 2 3 1 样品采集与预处理 本研究实验所用样品为北京产土牛膝 成都产土牛膝 郴州产土牛膝和长沙产土 牛膝的根 均为野生土牛膝 于七月份分别采于北京郊区 成都郊区 郴州苏仙岭和 长沙岳麓山 将其茎叶去除 只留下根 并将泥沙洗净 晒干 样品晒干后 把它 剪碎 置于恒温干燥箱中干燥 恒温温度为105 每间隔一个小时用电子天平称量 样品 直至前后两次质量基本不变 方可取出 将其用硝酸浸泡并清洗过的研钵碾碎 2 3 2 样品消解 4 试样的前处理是确保分析结果准确可靠的先决条件 对于中药的微量元素含量的 测定来说 尤为重要 由于中药药材样品具有复杂 结构各异 测定元素多面性及含 量相差悬殊的特点 现在多采用消化法进行处理 8 中药中主要成分为碳水化合物 因而可用酸氧化分解 经消化处理后微量元素均以离子存在 可以比较全面的进行测 定 9 本实验采用湿法消解 化 土牛膝样品 即 精确称取四个不同产地的土牛膝样 品粉末各1 000 g 分别置于贴好标签的50 mL消解管中 往四个消解管中各加入10 mL 混合酸 4体积硝酸与1体积高氯酸的混合酸 4HNO3 1HClO4 混匀 浸泡过夜 同法制备一份空白液 样品液与空白液同时置于智能消解器上加热消解 先设置消解 器温度为45 缓慢加热至起泡 此时保持45 恒温10 min 然后升温至65 使酸 回流清洗试管壁 保持30 min 再升温至135 直至样品消解完全 若溶液不透明 冷却后再加入4HNO3 1HClO4混合酸适量 持续加热至溶液澄明后 升温至160 赶酸至2 mL左右 10 15 冷却 转入100 mL容量瓶中 用5 的硝酸溶液洗涤容器 洗 涤液合并于容量瓶中 并定容至刻度线 摇匀 从5个容量瓶中分别取20 mL溶液放入 5个贴好标签的100 mL的容量瓶中 加入5 的硫脲和5 的抗坏血酸混合液5 mL 用 5 的硝酸定容至刻度线 再从原来的5个容量瓶中分别取20 mL溶液放入另外5个贴好 标签的100 mL容量瓶中 分别加入5 的重铬酸钾溶液5 mL 用5 的硝酸定容至刻 度线 摇匀 得到不同产地土牛膝的供试液 贴好标签 备用 本消解实验所用玻璃仪器均经过5 的硝酸溶液浸泡 清洗 2 4 标准溶液的配制及校准曲线的绘制 样品中砷和汞含量的测定 2 4 1 砷标准储备液的配制 称取1 3203 g经105 干燥过的分析纯三氧化二砷 As2O3 于小烧杯中 加入30 mL氢氧化钠 40 g L 1 加热溶解 冷却后加入 1 1 盐酸10 mL 移入1000 mL容 量瓶中 用二次蒸馏水定容至刻度 摇匀 此溶液为1 00 g L 1的砷标准储备液 2 4 2 砷标准母液的配制 移取1 00 g L 1的储备液1 00 mL于100 mL的容量瓶中 加5 的硫脲和5 的抗坏 血酸的混合液5 mL 再用5 的硝酸溶液定容至刻度线 摇匀 得到10 mg L 1的砷标 准液 再移取1 00 mL 10 mg L 1的砷标准液于100 mL容量瓶中 加5 的硫脲和5 的抗 坏血酸的混合液5 mL 再用5 的硝酸溶液定容至刻度线 摇匀 得到100 g L 1的砷 母液 2 4 3 砷标准系列的配制 分别取0 2 4 6 8 10 mL砷母液于6个100 mL容量瓶中 每个容量瓶加入5 的 5 硫脲和5 的抗坏血酸的混合液5 mL 再用5 的硝酸溶液定容至刻度线 得 0 2 4 6 8 10 g L 1的砷标准系列 2 4 4 汞标准储备液的配制 称取二氯化汞 分析纯 0 1354 g 用0 5 mol L 1硫酸溶解并稀释至100 mL 此溶 液1 00 mL等于1 00 mg汞 即的1 00 g L 1的汞标准储备液 2 4 5 汞标准母液的配制 移取1 00 g L 1的汞储备液1 00 mL于100 mL的容量瓶中 加5 重铬酸钾溶液5 mL 再用5 的硝酸溶液定容至刻度线 摇匀 得到10 mg L 1的汞标准液 再移取1 00 mL 10 mg L 1的汞标准液于100 mL容量瓶中 加5 重铬酸钾溶液5 mL 再用 5 的硝酸溶液定容至刻度线 摇匀 得到100 g L 1的汞母液 2 4 6 汞标准系列的配制 分别取0 2 4 6 8 10 mL汞母液于6个100 mL容量瓶中 每个容量瓶加入5 重 铬酸钾溶液5 mL 再用5 的硝酸溶液定容至刻度线 得0 2 4 6 8 10 g L 1的 汞标准系列 2 4 7 标准曲线的绘制 在测定好的最佳仪器工作条件下 进行标准系列的测定 其结果见图1 图2 从图可知 砷和汞的标液浓度与其吸光度呈良好的线性关系 信号图令人满意 砷 的线性回归方程A 0 1753C 0 7238 相关系数R 0 9999 汞的线性回归方程 A 0 0637C 0 0093 相关系数R 0 9993 符合研究实验要求 6 图1 汞的标准曲线 Figure 1 The standard curve for Hg 图2 砷的标准曲线 Figure 2 The standard curve for As 2 4 8 样品中汞含量的测定 设置好最佳仪器条件后 以硼氰化钾作为还原剂 用1 的盐酸作为载体 16 依 次进样 空白样品测20次 不同产地土牛膝样品进样10次 利用汞标准系列测得的吸 收度制成的标准曲线 根据样品的吸收度经过换算可的样品中汞的浓度 16 其结果见 表3 表3 样品中汞的量 Table 3 The amount of mercury in the sample 样品名ABSS D R S D 浓度 g kg 1 S 0 000 0 06020 00132 87120 0081 S 2 000 0 14690 00432 93012 0473 S 4 000 0 24230 00291 18333 9834 S 6 000 0 33690 00932 74735 9030 S 8 000 0 44300 00451 01368 0547 S 10 000 0 53950 00631 175810 0116 样品空白0 06530 00182 6939196 1740 成都土牛膝0 06680 00233 5961211 4003 7 长沙土牛膝0 07450 00283 8077289 0937 郴州土牛膝0 07010 00142 0185244 4386 北京土牛膝0 08190 00202 4587364 4999 2 4 9 样品中砷含量的测定 设置好最佳仪器条件后 调节流动注射氢化物发生器 设置温度在80 左右 以 硼氰化钾作为还原剂 用1 的盐酸作为载体 16 17 依次进样 空白样品测20次 不同 产地土牛膝样品进样10次 利用砷标准系列测得的吸收度制成的标准曲线 根据样品 的吸收度经过换算可的样品中砷的浓度 其结果见表4 表4 样品中砷的含量 Table 4 The content of arsenic in samples 样品名ABSS D R S D 浓度 g kg 1 S 0 000 0 71700 03745 2816 0 0386 S 2 000 1 07420 00392 06231 9992 S 4 000 1 43240 01640 36144 0413 S 6 000 1 78280 05211 14346 0424 S 8 000 2 12260 01532 92037 9815 S 10 000 2 47150 02400 72009 9722 样品空白0 70800 01950 9695 45 0083 成都土牛膝0 80160 01362 7518222 0127 长沙土牛膝1 16420 01681 70111256 5094 郴州土牛膝1 09810 02302 09841068 0549 北京土牛膝1 08840 02051 88421040 1415 2 5 检出限试验 检出限试验 对试剂空白溶液测定 20 次 计算其吸光值 ABS 标准偏差 以 其 3 倍标准偏差为检出限 因此 该实验中砷 汞的检出限分别为 0 0585 g L 1 0 0094 g L 1 结果见表 5 2 6 精密度试验 精密度 精密度是指在确定的条件下 将测定方法实施多次所得结果之间的一致 程度 影响测试结果的随机误差小 测试的精密度越高 度量精密度有两种方法一种 是重复性 另一种是再现性 本实验采取重复性方法 按实验方案 对土牛膝样品溶液连续进样10次 即平 行测定10次 测定结果的 RSD 即为此实验方法的精密度 不同产地砷元素的 精密度结果见表6 汞元素的精密度结果见表7 8 表 5 As 和 Hg 的检出限 Table 5 The detection limit of As and Hg AsHg 测量ID ABS测量ID ABS 10 738010 0623 20 702620 0654 30 713330 0635 40 730040 0631 50 703850 0642 60 781560 0652 70 759070 0654 80 719980 0657 90 695590 0659 100 7037100 0667 110 6941110 0659 120 7018120 0669 120 6984130 0648 140 6935140 0658 150 7125150 0647 160 7003160 0653 170 7601170 0643 180 6984180 0657 190 6692190 0650 200 7166200 0659 平均值0 7080平均值0 0644 S D 0 0195S D 0 0032 R S D 2 7518R S D 1 0067 表6 As元素精密度结果 Table 6 The accuracy result of As 长沙产成都产郴州产北京产 测量IDABS测量IDABS测量IDABS测量IDABS 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 1 1628 1 1786 1 1798 1 1450 1 1520 1 1645 1 1868 1 1779 1 1600 1 1347 1 1642 0 0168 1 4471 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 0 8240 0 7992 0 8078 0 7912 0 8015 0 8020 0 8063 0 8011 0 8027 0 7713 0 8016 0 0136 1 7011 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 1 0666 1 0737 1 0865 1 0921 1 1290 1 1248 1 1047 1 0750 1 1036 1 1254 1 0981 0 0230 2 0984 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 1 1168 1 1126 1 0625 1 0893 1 0679 1 0612 1 0844 1 1118 1 0872 1 0901 1 0884 0 0205 1 8842 表7 Hg元素精密度结果 Table 7 The accuracy result of Hg 长沙产成都产郴州产北京产 测量IDABS测量IDABS测量IDABS测量IDABS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 0 5422 0 5362 0 5534 0 5415 0 5338 0 5269 0 5427 0 5370 0 5389 0 5391 0 5395 0 0063 1 1758 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 0 4462 0 4399 0 4435 0 4590 0 4445 0 4461 0 4394 0 4344 0 4428 0 4422 0 4430 0 0045 1 1036 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 0 6424 0 6291 0 6423 0 6518 0 6369 0 6425 0 6358 0 6435 0 6691 0 6423 0 6471 0 0023 2 0365 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 S D R S D 0 6289 0 6240 0 6351 0 6402 0 6233 0 6259 0 6407 0 6348 0 6521 0 6203 0 6287 0 0132 1 0826 2 7 回收率试验 2 7 1 原理 回收率是衡量准确度的一个指标 它是反应待测物在样品分析过程中的损失的程 度 损失少 回收率越高 因而说明此测定方法较好 数据就更加接近真实值 回收率包括绝对回收率和相对回收率 绝对回收率考察的是经过样品处理后能用 于分析的待测样的比例 相对回收率严格来说有两种 一种是回收试验法 一种是加 10 标样回收试验法 前者是在空白基质中加入待测物 标准曲线也是同此 这种测定用 得较多 但有标准曲线重复测定的嫌疑 第二种是在已知浓度样品中加入标样 相对 回收率主要考察准确度 18 其计算方法为 回收率 加标混合样品浓度 样品 供试液浓度 加入的标液浓度 本文采用加标回收率试验法验证此方法的准确度 2 7 2 具体操作 取已知含量的四个不同产地的土牛膝样品供试液各三份于50 mL容量瓶中 每份 5 mL 贴好标签 1 2 3 按长沙产土牛膝1 2 3 郴州产土牛膝 1 2 3 北京产土牛膝1 2 3 成都产土牛膝1 2 3 的顺序依次分别准 确加入砷 汞的标准溶液 10 g L 1 0 10 0 20 0 30 mL 0 10 0 20 0 30 mL 用5 的硝酸溶液稀释定容至刻度线 摇匀 得到加标混合样品 同样品测定方 法进行测定 结果见表8 表9 表8 As的回收率结果 Table 8 The results of the recovery of As 样品名称加标样品量 ng加标混合样品量 ng回收率 平均回收率 011 100 0 112 05095 0 213 120101 成都土牛膝 0 314 04098 98 062 825 0 163 78596 0 264 845101 长沙土牛膝 0 365 915103 100 053 400 0 154 450105 0 255 38099 郴州土牛膝 0 356 460102 102 052 005 0 153 015101 0 253 94597 北京土牛膝 0 354 85595 97 7 表9 Hg的回收率结果 Table 9 The results of the recovery of Hg 样品名称加标样品量 ng加标混合样品量 ng回收率 平均回收率 010 570 0 111 570100 0 212 620102 5 成都土牛膝 0 313 48097 99 8 014 450 长沙土牛膝 0 115 43598 5 100 2 11 0 216 510103 0 317 42099 012 215 0 113 21199 6 0 214 09594 郴州土牛膝 0 315 275102 98 5 018 245 0 119 19595 0 220 275101 5 北京土牛膝 0 321 18598 98 2 2 8 结果与讨论 1 本文建立的经硝酸一高氯酸混酸 4 1 消化 氢化发生原子吸收法测定四个不 同产地土牛膝中砷和汞含量的方法 该方法所用仪器设备简单 具有准确度高 操作 步骤简便的特点 方法加标回收率在97 102 RSD在0 5 5 0 之间 方法简 便可行 是研究中药材微量元素含量的有效方法 2 样品采集和处理极大地影响分析结果的准确性 规范地采集和处理是研究成功的 保证 文献报道中药不同部位的微量元素含量不尽相同 由于土牛膝作为一种中药材 主要以其根入药 因此本文取其根来进行研究 具有一定的实际意义 3 我国 药用植物及制剂进出口绿色行业标准 限量指标 重金属总量应 20 0 mg kg 1 铅 Pb 5 0 mg kg 1 镉 Cd 0 2 mg kg 1 汞 Hg 0 3 mg kg 1 铜 Cu 20 0 mg kg 1 砷 As 2 0 mg kg 1 用此法测定的结果显示砷的含量北京为 1 040 mg kg 1 成都为0 222 mg kg 1 郴州为1 068 mg kg 1 长沙为1 256 mg kg 1均小于2 0 mg kg 1 含量符合标准 汞的含量北京为0 364 mg kg 1 成都为0 211 mg kg 1 郴州为 0 244 mg kg 1 长沙为0 289 mg kg 1 除北京产土牛膝外 其它均小于0 3 mg kg 1 含量 符合标准 4 经样品分析 我们可知 长沙产土牛膝与郴州产土牛膝根部的砷和汞的含量比北 京产地与成都产地的高一些 究其原因 主要是因为四个品种的生长环境不尽相同 然而 影响其砷和汞含量有差异的具体因素还有待进一步研究 12 参考文献 1 中医药学刊 1995 03 2 佛山专区土牛膝疗法治疗白喉经验交流会议总结 初稿 J 广东中医 1958 7 36 3 王懿萍 张小荣杨巧艳 王盛民中药微量元素与药效的关系 陕西中医 2006 年第 27 卷第 12 期 1573 4 袁爱萍 微量元素与健康 1988 14 2 56 5 郑吴拥军 李建军等 州大学学报 医学版 牛膝中铜 锌 铁的火焰原子吸收光谱法测定 6 梅全喜 吴惠妃 广州中医药大学附属中山