生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增dna片段学案（人教版）

精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 1 / 13生物选修一 5.2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段学案（人教版）m 课题 2多聚酶链式反应扩增 DNA 片段问题导学一、PcR 的原理活动与探究 11细胞内 DNA 复制需要的基本条件有哪些？该条件在 DNA复制中起何作用？2什么是引物？它有什么特点？用于 PcR 的引物一般长度是多少？3讨论：DNA 合成的方向有什么特点？两条子链的合成起始于 DNA 的同一端吗？4PcR 技术中，高温能使 DNA 双链解旋，但也会导致 DNA聚合酶失活，如何解决？迁移与应用 1PcR 过程中起催化作用的酶是（） 。A解旋酶 BRNA 聚合酶cTaqDNA 聚合酶 DDNA 连接酶细胞内 DNA 复制与 PcR 技术的比较细胞内 DNA 复制 PcR精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 2 / 13不同点解旋解旋酶催化，部分解旋解链 95高温解旋解链，双链完全分开酶解旋酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶 TaqDNA 聚合酶能量 ATP 不加温度体内温和条件 955572特点整个 DNA 复制，只在分裂间期复制一次目的基因片段，按需要无限扩增相同点需 DNA 模板；需脱氧核苷酸作原料；子链延伸方向都是从 5端到 3端；都遵循碱基互补配对原则，半保留复制注：解旋酶的作用是使 DNA 两条链的氢键断开，而 DNA 聚合酶都是催化形成磷酸二酯键的。二、PcR 的反应过程活动与探究 21PcR 一般要经历 30 多次循环，每次循环可以分为哪几步？2PcR 循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？3PcR 循环过程中，变性温度设置 94，时间设置 30s 的原因是什么？精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 3 / 134PcR 缓冲液相当于细胞内的什么成分？5当 PcR 反应体系的温度由变性后缓慢冷却到 50左右时，引物与模板可结合，而解开的两个 DNA 模板链能够重新结合吗？为什么？6PcR 过程中的 DNA 聚合酶能对最初的 DNA 模板进行完整的复制吗？为什么？7决定 PcR 反应特异性的原因有哪些？迁移与应用 2利用 PcR 技术扩增某 DNA 片段得到下图所示产物，则该产物至少经过几次循环才能产生？（）A1 次 B2 次c3 次 D4 次1PcR 反应过程图解（1）变性：当温度上升到 90以上时，双链 DNA 解旋为单链，如下图：（2）复性：系统温度下降至 55时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合，如下图：（3）延伸：当系统温度上升至 72左右时，溶液中的四种精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 4 / 13脱氧核苷酸（A、T、G、c）在 DNA 聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链，如下图：2PcR 过程的温度条件和时间控制变性复性延伸预变性 94，5min30 次 94，30s55，30s72，1min最后一次 94，1min55，30s72，1min三、PcR 实验操作和结果分析评价活动与探究 31讨论 PcR 实验过程中有哪些注意事项。2如何判断 DNA 扩增成功？迁移与应用 3PcR 实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（） 。A反复洗涤 B用酒精擦洗c高压灭菌 D在20下储存1PcR 体外扩增 DNA 片段的实验流程准备按照 PcR 反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 5 / 13移液用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分混合盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁离心将微量离心管放在离心机上，离心约 10s。目的是使反应液集中在离心管底部反应将离心管放入 PcR 仪中，设置程序进行反应：变性复性延伸2实验中 DNA 含量的测定DNA 在 260nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与 DNA 的含量有关。可以利用 DNA 这一特点进行 DNA 含量的测定，具体方法如下：（1）稀释：2LPcR 反应液，加入 98L 蒸馏水，即将样品进行 50 倍稀释（2）对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长 260nm 处，将紫外分光光度计的读数调节至零（3）测定：取 DNA 稀释液 100L 至比色杯中，测定 260nm精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 6 / 13处的光吸收值（4）计算：DNA 含量（g/mL）50（260nm 的读数）稀释倍数3几种 PcR 方法有反转录 PcR、扩增未知序列的 PcR、致突变 PcR、定量PcR、免疫 PcR 等方法，PcR 还可与其他方法联合使用，有很多新的联合法。（1）反转录 PcR反转录 PcR 就是把 RNA 提取后反转录成互补 DNA，并以此互补 DNA 链为模板进行的 PcR 反应。通常用于检测某种 RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平。（2）实时荧光定量 PcR所谓的实时荧光定量 PcR 就是通过对 PcR 扩增反应中每一个循环产物的荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PcR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PcR 的进行，PcR 产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。（3）免疫 PcR免疫 PcR 是利用抗原抗体反应的特异性和 PcR 扩增反应的精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 7 / 13极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。答案：课前预习导学【预习导引】一、1体外DNADNA 拷贝2解旋DNA 母链脱氧核苷酸DNA 聚合预习交流 1：提示：DNA 聚合酶不能从头合成 DNA，只能从3端延伸 DNA 链。因此，DNA 复制需要引物，DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。380100双螺旋双链变性降低双链4缓冲DNA两条模板链引物脱氧核苷酸TaqDNA聚合温度二、1变性90解旋952复性50两种碱基互补配对553延伸72TaqDNA 聚合酶预习交流 2：（1）提示：DNA 分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解开的每一段母链为模板，在 DNA 聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一段子链，随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也不断延伸，同时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。（2）提示：PcR 在高温条件下（90100）解旋，而细胞内的 DNA 在解旋酶的作用下解旋。精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 8 / 13三、1温度3恒温水浴锅2塑料管0.5mL3微量移液器四、1外源 DNA高压灭菌2分装成小份203枪头更换预习交流 3：提示：是用塑料加工制作的。课堂合作探究【问题导学】活动与探究 1：1提示：细胞内 DNA 复制需要的基本条件和作用分别是：（1）解旋酶：打开 DNA 双链。 （2）DNA 母链：提供 DNA 复制的模板。 （3）4 种脱氧核苷酸：合成子链的原料。 （4）DNA 聚合酶：催化合成 DNA 子链。 （5）引物：使 DNA 聚合酶能够从引物的 3端开始连接脱氧核苷酸。2提示：引物是一小段 DNA 或 RNA，它能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对。用于 PcR 的引物长度通常为 2030个核苷酸。3提示：（1）DNA 的羟基末端称为 3端，磷酸基团的末端称为 5端，且 DNA 的一条链为 35，另一条互补链为 53，即 DNA 的两条链是反向的。 （2）DNA 合成的方向总是从子链的 5端向 3端延伸（即沿母链的精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 9 / 1335） ，所以两条子链的合成分别起始于 DNA 的两端。4提示：寻找和使用耐高温的 DNA 聚合酶。迁移与应用 1：c解析：PcR 技术解旋过程是利用了 95高温使 DNA 变性解旋；RNA 聚合酶是转录过程所需的酶；DNA 连接酶是基因工程和 DNA 体内复制所需的酶；PcR 技术延伸中所用的酶是 TaqDNA 聚合酶。活动与探究 2：1提示：每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。2提示：预变性的目的是增加大分子模板 DNA 彻底变性的概率。3提示：变性温度过低，解链不完全导致 DNA 不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。4提示：由于缓冲液为 DNA 的复制提供场所，相当于细胞内 DNA 复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。5提示：不能。 （1）模板 DNA 链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。 （2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于两个 DNA 模板链之间的碰撞机会。 （3）加入的引物的量较大，而模板数量少。6提示：不能。第一次循环时，只能从引用结合的部位开始。由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，进行DNA 的延伸，由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 10 / 13进行 DNA 的延伸之后，DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。7提示：（1）待扩增 DNA 片段的特异性。 （2）引物与模板特异性地结合。 （3）碱基互补配对原则。 （4）耐高温的TaqDNA 聚合酶的催化作用具有专一性。迁移与应用 2：B解析：PcR 技术中，第一次循环产生两个 DNA 分子，每个 DNA 分子只有一条链具有引物。第二次循环产生四个 DNA 分子，其中两个 DNA 分子只有一条链具有引物，另两个 DNA 分子两条链都具有引物。活动与探究 3：1提示：（1）避免外源 DNA 污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌。（2）缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。2提示：（1）教材中的方法，可以通过计算 DNA 含量来评价扩增的效果。（2）电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察 DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。迁移与应用 3：c解析：为了避免外源 DNA 等因素的污染，PcR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 11 / 13在使用前必须进行高压灭菌。PcR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20下储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。当堂检测1下列有关 PcR 的描述，不正确的是（） 。A是一种酶促反应B引物决定扩增的特异性c扩增的对象是氨基酸序列D扩增的对象是 DNA 序列答案：c解析：PcR 是特异扩增两个引物间的脱氧核苷酸序列，而不是氨基酸序列。2引物长度通常为 2030 个核苷酸的一段（） 。ADNABRNAcDNA 或 RNAD双链 DNA答案：c解析：DNA 复制过程均需要引物的参与，引物是一小段 RNA 或 DNA。3PcR 利用了 DNA 的什么原理，来控制 DNA 的解聚与结合？（）A特异性 B稳定性c热变性 D多样性答案：c解析：PcR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 12 / 134PcR 过程中的复性是指（） 。A在 90以上时，两条 DNA 单链通过碱基互补配对形成DNA 双螺旋B在 50左右，两条 DNA 单链通过碱基互补配对形成 DNA双螺旋c在 90以上时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合D在 50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合答案：D解析：PcR 过程中的复性发生在 50左右的低温条件下，指引物与单链 DNA 的结合，不是两条单链 DNA 的结合。5标准的 PcR 过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（） 。A94、55、