绿色荧光蛋白的基因克隆

1 绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白 GFPGFP 基因的克隆 基因的克隆 摘摘 要要 绿色荧光蛋白 GFP 是一类存在于包括水母 水螅 珊瑚等腔肠动物体内的生物 发光蛋白 提取菌落中的 pEGFP N3 质粒 用 PCR 技术扩增目的基因片段 以 PMT18 T 质粒为载体 直接与 PCR 产物相连 将重组 DNA 导入感受态细胞 进行蓝白斑筛选 再 扩大培养 再次提取质粒 用限制性内切酶将含有目的基因的片段切下 通过凝胶电泳 鉴定该片段是否含有目的基因即可 关键词关键词 GFP 荧光蛋白 基因克隆 PCR 基因重组 1 前言前言 1 11 1 绿色荧光蛋白概述绿色荧光蛋白概述 绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP 是一类存在于包括水母 水螅和珊 瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白 当受到紫外或蓝光激发时 GFP 发射绿色荧光 它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的 GFP 由 3 个外显子 组成 长 2 6kb GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 相对分子质量为 27 0kMr 其蛋白性质十分稳定 能耐受 60 处理 1996 年 GFP 的晶体结构被解出 蛋 白质中央是一个圆柱形水桶样结构 长 420 nm 宽 240 nm 由 11 个围绕中心 螺旋 的反平行 折叠组成 荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的 桶的顶部由 3 个短的 垂直片段覆盖 底部由一个短的垂直片段覆盖 对荧光活性 很重要的生色团则位于大空腔内 发色团是由其蛋白质内部 第 65 67 位的 Ser Tyr Gly 自身环化和氧化形成 1996 年 GFP 的晶体结构被解出 蛋白质中央是一个圆 柱形水桶样结构 长 420 nm 宽 240 nm 由 11 个围绕中 心 螺旋的反平行 折叠组成 荧光基团的形成就是从这 个螺旋开始的 桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖 底部由 一个短的垂直片段覆盖 对荧光活性很重要的生色团则位于 大空腔内 图 1 绿色荧光蛋 白示意图 1 21 2 应用价值应用价值 2 在生物学研究中 科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的 标记 将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上 原来不可见的部分就 变得可见了 生物学家一直利用这种标记方法 把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的 显微镜视场中 纠出来 后来 美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理 并对它进行了大刀 阔斧的化学改造 不但大大增强了它的发光效率 还发展出了红色 蓝色 黄色荧光蛋 白 使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱 供生物学家们选用 目前生物实 验室普遍使用的荧光蛋白 大部分是钱永健改造的变种 有了这些荧光蛋白 科学家们就好像在细胞内装上了 摄像头 得以实时监测各 种病毒 为非作歹 的过程 通过沙尔菲的基因克隆思路 科学家们还培育出了荧光老 鼠和荧光猪 由于沙尔菲与钱永健的突出贡献 他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共 享了今年的诺贝尔化学奖 瑞典皇家科学院将绿色荧光蛋白的发现和改造与显微镜的发明相提并论 成为当代 生物科学研究中最重要的工具之一 生物技术中的应用研究 分子标记 药物筛选 融合抗体 生物传感器 2 实验目的实验目的 通过质粒提取 PCR 扩增 电泳等技术进行绿色荧光蛋白基因的克隆 熟练掌握 相关实验技术 3 实验原理实验原理 3 13 1 质粒质粒 DNADNA 的提取的提取 SDS 为阴离子表面活性剂 它既能使细菌细胞裂解 又能使一些蛋白质变性 用 SDS 处理细菌后 会导致细菌细胞破裂 释放出质粒 DNA 和染色体 DNA 两种 DNA 在强碱环境都会变性 由于质粒和主染色体的拓扑结构不同 变性时前者虽然两条链分 离 却仍然缠绕在一起不分开 但后者完全变性分甚至出现断裂 因此 当加入 pH4 8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值 使溶液 pH 值恢复较低的近中性水平时 质粒的两条小 分子单链可迅速复性恢复双链结构 但是主染色体 DNA 则难以复性 在离心时 大部 分主染色体与细胞碎片 杂质等缠绕一起被沉淀 而可溶性的质粒 DNA 留在上清夜中 3 23 2 PCRPCR 扩增扩增 3 类似于 DNA 的 天然复制过程 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 PCR 由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 模板 DNA 的变性 模板 DNA 经加 热 至 95 左右一定时间后 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离 使之成为 单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 模板 DNA 与引物的退火 复性 模板 DNA 经加热变性成单链后 温度降至 55 左右 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结 合 引物的延伸 DNA 模板 引物结合 物在 TaqDNA 聚合酶的作用下 以 dNTP 为反应 原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板 DNA 链互补 的半保留复制链重复循环变性 退火 延伸三过程 就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新链又可成为下次循环的模板 组成 PCR 反应体系的基本成分包括 模板 DNA 特异性引物 耐热 DNA 聚合酶 dNTP 以及含 Mg2 的缓冲溶液 因此 PCR 技术实际上是在模板 DNA 引物和 4 种 dNTP 存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应 3 33 3 DNADNA 的连接与转化的连接与转化 3 3 13 3 1 pMD18 TpMD18 T VectorVector pMD18 T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物的专用载体 本载体有 EcoR V 识别位点 用 EcoR V 进行酶切反应后 再在两侧的 3 端添加 T 而成 因大部分耐热性 DNA 聚 合酶进行 PCR 反应时都有在 PCR 产物的 3 末端添加一个 A 的特性 所以使用本制品 可以大大提高 PCR 产物的连接 克隆效率 此外 本制品中的高效连接液 Solution 可以在短时间内 约 30 秒钟 完成连接反应 其连接液可以直接用于细菌的转化 大 大方便了实验操作 3 3 23 3 2 感受态细胞感受态细胞 体外连接的 DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖 为了提高受体菌摄 取外源 DNA 的能力 提高转化效率以获得更多的转化子 人们摸索出了不同的方法处 理细菌 使其处于感受态 感受态就是细菌吸收转化因子的胜利状态 只有发展为感受 态的细胞才能稳定摄取外来的 DNA 分子 转化是将外源 DNA 分子引入受体细胞 使之获得新的遗传性状的一种手段 用冰冷的 CaCl2处理对数生长期的细胞 可以诱导其产生短暂的 感受态 易于摄取外源 DNA 3 3 33 3 3 阳性克隆的检测阳性克隆的检测 DNA 片段成功插入至 pMD18 Vector 中后 一般情况下 半乳糖苷酶的表达将受到 破坏 重组克隆体在含有 X Gal IPTG Amp 的 L 琼脂平板培养基上培养时将显示白色 菌落 但有时比较短的 DNA 片段插入载体是 基因的读码框有可能正好与 LacZ 的读码 4 框相吻合 克隆体也会显示蓝色菌落 所以 当我们没有得到白色菌落时 可以试着检 测蓝色菌落 Control Insert 经克隆后的白色菌落中 有 90 以上含有 Insert DNA 片段 3 43 4 酶切反应与凝胶电泳酶切反应与凝胶电泳 3 4 13 4 1 酶切反应酶切反应 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列之内或其附近的 特异位点上 并在此切割双链 DNA 图 2 限制性酶切位点 本实验中 质粒 DNA 约 3 kb 载体 pMD18 T 约 2 7kb 基因 CHD5 约 0 4 kb 可 由此判断限制性内切酶切下含有目的基因片段约 800b 作为电泳鉴定的依据 3 4 23 4 2 凝胶电泳凝胶电泳 电泳为带电粒子在电场中泳动的现象 共价闭环超螺旋 DNA 线性 DNA 开环的双链环状 DNA 琼脂糖 Agarose 是一种多聚糖 由半乳糖及其衍生物构成的中性物质 不带电 荷 琼脂糖透明无紫外吸收 因此 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳 4 4 实验设备实验设备 5 4 14 1 质粒质粒 DNADNA 的提取的提取 BIOEASY 质粒小提试剂盒 微量移液器 离心机 紫外分光光度计 4 24 2 PCRPCR 扩增扩增 PCR 扩增仪 微量加样枪 灭菌超薄 PCR 反应管 4 34 3 DNADNA 的连接与转化的连接与转化 移液枪 微量离心管 水浴锅 振荡器 琼脂平板培养基 牙签 4 44 4 酶切反应与凝胶电泳酶切反应与凝胶电泳 微量移液器 离心机 恒温水浴箱 紫外检测仪 电泳仪 水平电泳槽 5 5 实验材料及试剂实验材料及试剂 5 15 1质粒质粒 DNADNA 的提取的提取 BIOEASY 质粒小提试剂盒 溶液 S1 细菌悬浮液 50 mmol L 葡萄糖 10 mmol L EDTA 25 mmol L Tris HCl pH 8 0 2 毫克 毫升 溶菌酶 裂解液 S2 200 mmol L NaOH 1 SDS 中和液 S3 3 mol L NaAc pH4 8 溶液 洗涤液 W 洗脱液 RNase A 100mg ml DNA 吸附柱 5 25 2 PCRPCR 扩增扩增 样品 质粒 DNA 试剂 引物 引物 1 引物 2 工作浓度为 10umol L TaKaRa Taq dNTP Mixture PCR Buffer 灭菌去离子水 5 35 3DNADNA 的连接与转化的连接与转化 pMDTM18 T Vector Insert DNA 6 灭菌蒸馏水 Solution DH5 感受态细胞 限制性内切酶 EcoR I Hind III 5 45 4酶切反应与凝胶电泳酶切反应与凝胶电泳 大肠杆菌 DH5 菌株 pMD18 T 载体 易瑞质粒小量提取试剂盒 Takara EcoRI 限制性内切酶 Takara Hind III 限制性内切酶 Takara 10 M 酶切缓冲液 BioWest 电泳琼脂糖干粉 0 5 TBE 核酸电泳缓冲液 EB 核酸荧光染料 Takara 6 电泳上样缓冲液 6 6 实验操作步骤实验操作步骤 6 16 1质粒质粒 DNADNA 的提取的提取 6 1 16 1 1 DNADNA 提取提取 1 取 1 5ml 培养物加入 Eppendorf 管中 室温离心 12000rpm 1min 弃上清 将离心 管倒置 使液体尽可能流尽 2 加入 250 l 溶液 S1 中 旋涡振荡 使细菌沉淀分散 彻底悬浮 3 加入 250 l 裂解液 S2 颠倒 4 6 次混匀 不要剧烈振荡 室温静置 3min 不超 过 5min 4 加入 350 l 中和液 S3 立即温和颠倒 6 8 次混匀 至出现白色絮状沉淀 5 室温 12000rpm 离心 10min 6 分次小心取上清液转至吸附柱中 带收集管 每次 600 l 室温 12000rpm 离心 30s 弃滤液 将吸附柱重新放回收集管中 7 向吸附柱中加入 600 l 洗涤液 W 12000rpm 离心 30s 弃滤液 8 重复步骤 7 一次 9 空柱 10000rpm 离心 2min 10 取出吸附柱 放入一个干净的离心管中 在吸附膜的中间加 50 l 56 预热的洗脱 液 室温放置 1min 12000rpm 离心 1min 收集洗脱液 即纯化的质粒 DNA 20 保 存备用 6 1 26 1 2 质粒质粒 DNADNA 定量测定定量测定 1 取 2 l 提取的质粒 DNA 加入 98 l 蒸馏水 2 混合均匀 3 用紫外分光光度计测定 A260 6 26 2 PCRPCR 扩增扩增 6 2 16 2 1 PCRPCR 反应体系的设置反应体系的设置 1 预混合液 Premix 的配置 试剂容量 TaKaRa Taq1 25U 25ul dNTP Mixture2 conc 各 0 4mM PCR Buffer2 conc 3mM Mg 2 保存温度 20 7 2 准备 PCR 反应溶液 试剂容量 Premix Taq25ul 模板 0 1ul 引物 1 10uM 2ul 引物 2 10uM 2ul 灭菌蒸馏水20 9ul 6 2 26 2 2 PCRPCR 仪上操作仪上操作 1 参数设置 PCR 的反应条件 3 Step PCR 94 30s 50 或 60 30s 72 60s 30 cycles 2 Step PCR 98 10s 68 1 min kbp 30cycles 2 预热 先不将 PCR 管插入模板 启动反应程序 3 启动反应程序 待温度升至 94 按下 Pause 键 暂停反应程序 迅速将 PCR 管插入模块 盖上盖 子 再启动反应程序 6 36 3 DNADNA 的连接与转化的连接与转化 1 在微量离心管中配置下列 DNA 溶液 全量为 5 l pMDTM18 T Vector 1 l Insert DNA 0 1 pmol 0 3 pmol dH2O up to 5 l 2 加入 5 l 等量 的 Solution 3 16 反应 30 分钟 注 室温 25 也能正常进行连接反应 但反应效率稍微降低 5 分钟也能正常进行连接反应 但反应效率稍微降低 长片段 PCR 产物 2kbp 以上 进行 DNA 克隆时 连接反应时间请延长 至 数小时 8 4 全量 10 l 加入至 100 l DH5 感受态细胞中 冰中放置 30 分钟 5 42 加热 45 秒钟后 再在冰中放置 1 分钟 6 加入 800 l LB 培养基 37 振荡培养 60 分钟 7 在含有 X Gal IPTG Amp 的 L 琼脂平板培养基上培养 形成单菌落 计数白色 蓝色菌落 8 用牙签挑选白色菌落 在 LB 培养基上进行扩大培养 16 保存 过夜 9 重复实验一 提取 pMDTM18 T Vector 质粒 10 加入限制性内切酶 EcoR I Hind III 获得含有目的基因的碱基片段 进入下 一实验 凝胶电泳 6 46 4酶切反应与凝胶电泳酶切反应与凝胶电泳 6 4 16 4 1 质粒质粒 DNADNA 的酶切分析操作的酶切分析操作 1 在一个洁净的 0 5 ml 离心管中混匀下列反应物 反应物体积 l 10 M 酶切缓冲液 2 质粒 DNA 500 1000ng 10 l 根据具体实验结果确定 Hind III1 EcoR I1 H2O 至 20 2 混合后 37 水浴 1 2h 6 4 26 4 2 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 1 凝胶准备 称 1g 琼脂糖置三角瓶中 加 0 5 TBE 100ml 微波炉加热大约 2 分钟 熔化琼脂糖 2 胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内 梳齿底端和床面有 1mm 的间隙 将胶床放在调整好的水平台上 3 铺胶 将冷却至 60 的凝胶倒入准备好的胶床内 凝胶厚度约 5 mm 4 室温下静置凝胶固化 将带凝胶的胶床置于电泳槽中 并使样品孔位于电场负极 9 5 向电泳槽中加入 0 5 TBE 电泳缓冲液 越过凝胶表面即可 6 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子 7 样品准备 向核酸样品中加入约为样品体积 1 6 的上样缓冲液 用加样器轻轻混匀 上样缓冲液 EDTA 甘油 增大溶液密度 溴酚蓝 指示剂 二甲苯胺蓝 指示剂 8 上样 用加样器吸取样品 轻轻的加入到凝胶的样品孔中 加样量为 6 l 每组上 2 个样品 1 DNA Marker 5 l 2 质粒 DNA 酶切产物 10 l 9 盖上电泳槽 接通电源 开始电泳 10 电泳条件 电压 80v 时间 25 30 分钟 11 电泳结束后 切断电源 取出凝胶 12 电泳结果分析 紫外检测仪直接观察电泳条带 13 取出凝胶 置于凝胶成像仪中观察结果 并拍照记录 7 7 结果及计算结果及计算 7 17 1 质粒提取预期实验结果质粒提取预期实验结果 标准 OD260 OD280 1 8 预期实验结果应为 1 7 1 9 7 27 2 电泳预期结果电泳预期结果 酶切产物轨道上有两道 与 marker 比较后 若一条在 bp800 左右 另一条在 bp2000 左右 则说明 GFP 的相关基因已成功导入细胞内 参 考 文 献 1 岳莉莉等 1997 绿色荧光蛋白 现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记 物 2 黄思玲 2009 绿色荧光蛋白 食品与药品 3 pMDTM18 T Vector 产品说明书 4 BIOEASY 质粒小提试剂盒