免疫缺陷动物模型

第十章 免疫缺陷动物模型及应用免疫缺陷 (immunodeficiency)是指 机体免疫系统中任 何 一个成分缺少、缺失或功能不全的现象。免疫缺陷病 (immunodeficiencydiseases)则是 一种由于人体免疫系统发育缺陷或免疫反应障碍导致的人体抗感染能力低下，临床表现主要为反复感染或严重感染性疾病 ，它是机体免疫功能不全所出现的临床综合征。免疫缺陷病通常可分为 先天遗传性 及 后天继发性 两大类，这两类疾病均会导致机体 免疫功能低下或缺失 ，并易发生 严重感染或肿瘤 。第一节 概述特异性免疫缺陷T细胞缺陷T和 B细胞缺陷B细胞缺陷 占先天性免疫缺陷病的 50% 70%。其缺陷发生在 B淋巴细胞祖细胞阶段，特征为免疫球蛋白水平的降低或缺失 。占先天性免疫缺陷病的 5% 10%。因先天性胸腺发育不全导致机体内 T细胞数目减少， 或 因某些酶或膜糖蛋白等分子缺乏而导致 T细胞功能障碍。体液 和 细胞免疫同时有严重缺陷的疾病，一般 T细胞缺陷更为突出。可能与干细胞分化为 T、 B细胞发生障碍或胸腺及法氏囊相应结构发育异常有关。先天遗传性免疫缺陷病非 特异性免疫缺陷补体系统 缺陷吞噬细胞缺陷 指吞噬细胞的功能障碍引起的疾病，其发病率较低，它约占先天性免疫缺陷病的 1% 2%，最多常见的为慢 性肉芽肿病。机体内补体成分的组分或它的调控蛋白发生遗传性缺陷所 引起的疾病 。先天遗传性免疫缺陷病继发性 免疫缺陷恶性肿瘤蛋白质异常感染 许多病毒、细菌、真菌及原虫感染常可引起机体免疫功能低下。患恶性肿瘤特别是淋巴组织的恶性肿瘤时，常可进行性抑制患者的免疫功能。广泛转移的癌症患者中常可出现明显的细胞免疫与体液免疫功能低下。慢性肾 脏疾病 、急慢性消化道疾病，大面积烧或烫伤时，体内蛋白质可 大量丧失 ； 慢性消耗性疾病时蛋白质消耗会增加；机体内的蛋白质合成不足。 后天继发性免疫缺陷病医源性免疫缺陷放射线损伤长期使用药物 长期使用免疫抑制剂、细胞毒药物和某些抗生素 。放射线治疗是 一种 有效手段 ， 大多数淋巴细胞对 射线十分敏感 ， 大剂量放射性损伤可造成机体永久性免疫缺陷。后天继发性免疫缺陷病 免疫缺陷动物 (immunodeficient animal)：指由于先天性遗传缺陷或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。 获得性免疫缺陷动物 （ Induced immunodeficient animal） ,又叫诱发性免疫缺陷动物，指采用人工方法干预造成其免疫功能缺陷或低下的动物。 遗传性免疫缺陷动物 （ Induced immunodeficient animal） ,又叫自发性免疫缺陷动物，指动物 自然 发生的免疫缺陷疾病或由于基因突变的异常表现，通过 定向培育而获得的免疫功能缺陷或低下的动物。第二节 免疫缺陷动物及其发展史免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物裸小鼠的发现及其意义 裸小鼠 (Nude mice)或无胸腺小鼠（ Athymic mice)是一种无被毛、无胸腺的突变种小鼠 。1962 年 ， 英国格拉斯哥鲁齐尔医院（ Ruchild hospital）病毒研究室的格里斯脱 (Grist)医生从 非近交系小鼠 中偶然发现 了 个别无毛小鼠 。1966 年，英国爱丁堡动物研究所的弗拉纳根（ Flanagan）首先确定了新生裸小鼠以 无触须为主要特征 ； 随后的遗传特性研究，发现小鼠无毛是其 11号染色体上的等位基因发生 了 突变，并发现 裸 小鼠的皮肤组织学和以往无毛小鼠不同，它的体内常染色体退化，存在着一种新的无毛基因 ； 认为这是一种 新的自发突变种小鼠 ，并提出将其命名为 “ 裸体 ” 小鼠 ，用 “ nu” 表示其 基因符号 。1968 年，佩蒂路易斯（ Pantelouris）发现裸体小鼠已 失去正常胸腺，其 原胸腺残留结构 中 ， 部分上皮样细胞呈巢状排列且部分呈外分泌腺结构，这才引起世界各国生物医学领域的高度重视。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物裸小鼠的发现及其意义20 世纪 60年代后期，裸小鼠作为 “ 活试管 ” ，在肿瘤学、免疫学等方面很快成为广为关注的研究领域 .20 世纪 70年代 以来，国际 上先后召开了很多 届 “ 免疫功能缺陷动物实验 ” 国际讨论会 ， 以裸小鼠为代表的各类免疫功能缺陷动物引起了生命科学领域的广泛关注，至今方兴未艾。 目前 国际上发现和培育了以 B细胞功能缺陷 为特征 ，来源于 CBA/N小鼠 的 Xid小鼠 ， 自然杀伤（ NK）细胞功能缺陷 的 Beige小鼠 、 巨噬细胞机能异常 的 P/J小鼠 等各类免疫缺陷动物模型。 借助生物遗传工程的研究手段，应用基因导入等育种技术，将不同类型的基因异常整合在同一动物体上，人工建立了 许多 联合免疫功能缺陷动物 （ Combined Immunodeficiency Model）。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物裸大鼠的发现及其意义1953 年 ， 裸大鼠 （ Nude rats）由英国阿伯丁的 Rowett研究所在实验大鼠种群中所发现， 基因符号为 rnu，属 染色体隐性遗传 ，因难于饲养繁殖，当时仅维持至 60年代初。1975 年 ， 该研究所在大鼠种群中再次发现了 纯合子裸大鼠 （ rnu/run）。1977 年 ， 英国 MRC实验动物中心首次在世界上建立了 裸大鼠种子群 。1978 年 ， Festing通过研究首次 详细描述了裸大鼠的免疫学特征 ，并在世界上首先报道了采用裸大鼠开展人癌异种移植的实验结果。 rnu裸大鼠先后被分别 引入欧洲大陆及美国及日本 等国，并于 1983年 由我国科学家引入中国。 除 rnu裸大鼠以外， 1976年 5月在新西兰维多利亚大学的科研人员发现了另一种裸大鼠，为了与 rnu裸大鼠区别，他们将这种裸大鼠的 基因符号命名为 nznu。 目前绝大多数裸大鼠的研究资料均来自 rnu裸大鼠。实验诱导免疫缺陷动物免疫器官切除 免疫抑制剂大剂量激素 放射性照 射实验诱导免疫缺陷动物免疫抑制动物模型TAR小鼠TRB小鼠 联合使用胸腺切除、放射线照射和骨髓重建的方法建立的实验诱导免疫抑制动物模型 ， 即 TRB小鼠 模型。采用胸腺切除、阿拉伯胶糖嘧啶渗透加放射线照射的技术制作 的免疫缺陷 动物模型，即 TAR小鼠模型。实验诱导免疫缺陷动物T淋巴细胞功能缺陷动物裸小鼠、裸大鼠B淋巴细胞功能缺陷动物XID小鼠NK细胞缺陷动物Beige小鼠免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物SCID小鼠、 NOD-SCID小鼠、 BNX小鼠第三节 免疫缺陷动物分类按照临床上免疫缺陷疾病以 始发部位 或 所含有成分 分类的原则，根据免疫缺陷动物的实际应用现状，免疫缺陷动物的分类 并 不 可能 十分严格 ；利用 基因敲除技术 造成某些 免疫 细胞因子缺陷的 免疫缺陷小鼠 大多数 还无 特定的名称。BALB/c(nu/nu)(T cell-)BNX(T/B/NK cell-)NOD/SCID(T/B/NK cell-)SCID(T/B cell-)Nud rat(T cell-)免疫缺陷动物免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物一、 T淋巴细胞功能 缺陷动物裸小鼠（ Nude mice） 是一种全身无毛、先天性胸腺发育不良及 T淋巴细胞功能免疫缺陷的动物，其隐性突变的 裸基因（ nu）位于 11号染色体上 。 裸小鼠概况已将 nu基因成功导入不同近交系动物， 世界上 已建立了 20余种具有不同遗传背景和相同 nu基因遗传特性 的 近交系裸小鼠 ； 使用最多的裸小鼠品系是 BALB/c-nu小鼠 ，其它来源的裸小鼠如 NIH-nu小鼠、 NC-nu小鼠、 Swiss-nu小鼠、 C3H-nu和 C57BL-nu小鼠 等品系 也有较多应用。 生物学特征裸小鼠的主要特征表现为无毛和无胸腺，随着鼠龄增加，其皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。 不同品系的裸小鼠具有不同的生物学特征。如 BALB/C裸小鼠 皮肤为 浅红色，白眼 ； C3H裸小鼠 皮肤为 灰白色，黑眼 ； C57BL裸小鼠 皮肤为 黑灰色至黑色 。CD-(ICR)裸鼠 NU/NU裸鼠免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物一、 T淋巴细胞功能 缺陷动物 免疫学特征胸腺缺损，可见少量胸腺痕迹或异常上皮，但胸腺依赖细胞明显减少或缺失，故不能使 T细胞正常分化，缺乏成熟 T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，所以其细胞免疫力低下。体内 B淋巴细胞数正常，但功能欠正常，免疫球蛋白主要是 IgM，只含少量 IgG。 6 8周龄以上的成年裸小鼠较普通小鼠有较高水平的 NK细胞活性， 3 4周龄的幼龄裸小鼠则 NK细胞的活性相对低下 ； 随着裸小鼠年龄增长或其他因素的影响（如微生物感染），其体内正常 T细胞数会增加， NK细胞活性也会代偿性增高。 应用领域已广泛应用于肿瘤学、免疫学、微生物、遗传学、寄生虫、临床医学等专业领域。CD-(ICR)裸鼠 NU/NU裸鼠免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物一、 T淋巴细胞功能 缺陷动物裸大鼠（ Nude rat） 是一种全身无毛、先天性胸腺发育不良及 T淋巴细胞功能免疫缺陷的动物，其基因符号为 rnu，属染色体隐性遗传。 生物学特征主要特征类似于裸小鼠，但其躯干部仍有稀少被毛，并非如裸小鼠那样基本无毛，其头部及四肢毛更多。 2 6周龄期间其皮肤上有棕色鳞片状物，随鼠龄增长出现稀少被毛直至终身。 免疫 学特征与裸小鼠极为相似， 可 见胸腺残体 ； 其体内 T细胞功能缺陷， B细胞功能基本正常 ， NK细胞活力增强。对结核菌素无迟发性变态反应，血中未测出 IgM及 IgG，淋巴细胞转化试验为阴性。肿瘤移植 实验 中，裸大鼠具有移植瘤大、取血量多、可行某些外科手术之优 点 。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物二、 B淋巴细胞功能 缺陷动物XID（ X-linked immunodeficiency）小鼠 为 B淋巴细胞功能缺陷疾病模型，临床常表现为免疫球蛋白缺失，但细胞免疫正常。来源于CBA/N小鼠，为 X-染色体隐性遗传， 其突变基因位于 Pgk-1与 Plp基因之间， 基因符号为 xid。该基因使小鼠脾脏 B淋巴细胞数目减少并有缺陷，导致体内成熟 B细胞缺少，从而对某些 B细胞抗原缺乏免疫应答反应。目前已培育出 B细胞缺陷的小鼠已不少于 15个品系 。 免疫学特征纯和型雌鼠 (xid/xid)和 杂合型雄鼠 (xid/y)对 型抗原 (非胸腺依赖性抗原 )以及双链 DNA等没有反应，对胸腺依赖性抗原缺乏抗体反应；血清中 IgG3、 IgM低下。其 免疫学特征与人类性联丙种球蛋白缺乏症（ Bruton型） 和 湿疹 -血小板减少性紫癜 (Wiskott-Aldisch氏 )综合症相似。 应用领域免疫学领域，它是 研究 B淋巴细胞的发生 和 功能理想的动物模型。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物三、 NK淋巴细胞功能 缺陷动物Beige小鼠 为 NK细胞功能缺陷疾病模型，它是隐性基因突变系， bg基因为13号常染色体隐性突变基因，它起源于 C57BL/6品系。 它是 经射线辐射的小鼠生产的仔鼠中出现的变异动物，这种动物被称为 Beige (bg/bg)小鼠。 生物学特征Beige小鼠表现为明显的黑色素体减少 ，外观 很难 与其他白色小鼠 鉴别。其外观表现为毛色变浅 ， 但被毛完整 ， 耳廓和尾尖色素减少，出生时眼睛颜色很浅，成年后眼睛全变黑。 免疫学 特 征Beige小鼠内源性 NK细胞发育和功能缺陷，血液凝固和巨噬细胞活性也有缺陷；其免疫抗肿瘤杀伤作用出现较晚 ， 缺乏细胞毒性 T细胞功能 ， 对同种、异种肿瘤细胞的体液免疫功能减弱，欠缺巨噬细胞的抗肿瘤活性、杀伤细胞活性等。 应用领域应用于免疫学领域，它是 人类齐希二氏综合症 的良好动物模型。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物四、联合免疫 缺陷动物SCID（ Severecombinedimmunodeficiency,SCIDmice）小鼠 是先天性 T和 B淋巴细胞免疫缺陷动物 ， 即重度联合免疫缺陷小鼠， 1983年由美国学者 Bomsa在 C.B-17突变小鼠中发现。 SCID小鼠的免疫球蛋白缺乏具有遗传性特征，由位于小鼠第 16对染色体 被称为 scid的单个隐性突变基因 所导致，表现为 T、 B淋巴细胞免疫功能缺陷 。生物学特征SCID小鼠外观与普通 BABC/c小鼠无差异，体重发育基本正常，体表有毛呈白色；其淋巴器官发育有缺陷，胸腺相对重量仅为同龄正常小鼠的6%左右，脾脏相对重量仅为同龄正常小鼠的 30%，淋巴结极小，常散在分布于脂肪组织中，难以用肉眼看见。饲养繁殖SCID小鼠极易感染，在高度洁净的 SPF环境下可存活 1年以上。采用纯合子两性交配均可生育，但其繁殖能力较弱，窝产仔数平均为 3 5只，雌性小鼠生产两胎后其繁殖能力即明显下降。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物四、联合免疫 缺陷动物 组织学特征主要表现为淋巴细胞显著缺陷，其外周淋巴细胞组分减少，淋巴细胞仅占白细胞总数的 10 20%。胸腺多被脂肪组织包围，无皮质结构仅保留残存髓质，且主要由类上皮细胞和成纤维细胞构成，边缘偶见灶状淋巴细胞群。脾脏白髓不明显，红髓正常，脾小体无淋巴细胞聚集，主要由网状细胞构成。淋巴结无明显皮质区，副皮质区缺失，呈淋巴细胞脱空状，由网状细胞占据。 免疫学特征所有 T和 B淋巴细胞的功能测试中均为阴性，对外源性抗原无抗体和细胞免疫反应，细胞免疫和体液免疫功能缺陷，但巨噬细胞和 NK细胞功能未受影响。存在渗漏现象，少数 SCID小鼠在青年期可出现一定程度的免疫功能恢复 ； 渗漏现象不遗传，但与小鼠的年龄、品系、饲养环境有关。 应用领域已在肿瘤学、免疫学、微生物学 、生殖医学 等领域 研究中 得到广泛应用。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物四、联合免疫 缺陷动物BNX（为 bg、 nu、 xid三个基因首字母的缩写）小鼠 是 NIH-Beige-Nude-XID小鼠的简称 ， 亦称为 NIH- 小鼠，它是由美国（ NIH）培育成功的一种 T、 B、 NK细胞联合免疫缺陷小鼠，即重度联合免疫缺陷小鼠，基因型为 NIH-bg/bg-xid/xid-nu/nu(雌性 )和 IH-bg/bg-xid/y-nu/nu(雄性 )。 外观特征外观与裸小鼠相似，呈裸体外表，先天性胸腺发育缺陷。从出生到成年，外观均为黑色裸体外表 ； 随年龄增长， 其 皮肤颜色逐渐减弱变淡，至老年时仅有肩部和尾椎等局部呈黑色，其余部位的颜色为灰色或浅黑色。 饲养繁殖BNX小鼠的繁殖培育与裸小鼠 、 SCID小鼠明显不同，后两者是由天然突变通过人工选育而培育成功的；而 BNX小鼠则是将源于不同品系小鼠的突变基因导入到某一个品系的小鼠体内而获得的。有效的繁殖方式为 杂合子雌性 (NIH-bg/bg-xid/xid-nu/ )与 纯合子雄性 (NIH-bg/bg-xid/y-nu/nu)进行交配 , 所产后代有一半为纯合子，即为 BNX 小鼠。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物四、联合免疫 缺陷动物 生物学特征BNX小鼠在实验中有着裸小鼠和 SCID小 鼠 无法比拟的优势。它既兼有裸小鼠 无毛、易观察、相对易饲养 和 SCID小鼠重度免疫缺陷 等优点，又克服了裸小鼠免疫缺陷程度不深、接受抗原刺激免疫机能易恢复以及 SCID小鼠有毛、不利于实验观察、难饲养、存在免疫渗漏等缺点。 实验优势应用 BNX小鼠建立肿瘤动物模型具有以下优点：1、成瘤率高，通常可达到 100%成瘤率；2、成瘤时间早且一致性好，几乎同时成瘤；3、肿瘤个体差异小，便于实验分组；4、成瘤实验重复性好，某些即使在裸鼠和 SCID小鼠体内重复性差的肿瘤，在 BNX小鼠体内也能得到较好的重复性。 应用领域已广泛应用于血液学、肿瘤学、免疫学以及微生物学等研究领域。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物四、联合免疫 缺陷动物NOD/SCID小鼠 亦 称 非肥胖糖尿病 /严重联合免疫缺陷小鼠 (non-obese diabetes-SCID, NOD/LtSz-SCID, 简称 NOD/SCID),它是在 SCID小鼠的基础上，通过与非肥胖性糖尿病小鼠 NOD/Lt杂交 ， 由美国 Jackson实验室建系并完成的一种重度免疫缺陷动物 。 建系目的NOD/Lt鼠是一种胰岛素依赖性糖尿病小鼠 ， 它具有 T淋巴细胞介导的细胞免疫 ,但 NK细胞、抗原提呈细胞 (antigen presenting cell,APC)功能缺陷。 SCID小鼠可以成功接种各种肿瘤细胞并反映其在体内的生物学行为 ， 但 其 体内存在正常的 NK细胞 、 补体及髓系细胞的正常免疫 ， 小部分周龄较大的 SCID小鼠会发生淋巴细胞免疫功能恢复 (渗漏现象 )， 产生 T和 B细胞 ， 降低了细胞植入存活率，影响 SCID小鼠的更广泛应用。 免疫学特征既 保留了 SCID小鼠 T、 B淋巴细胞缺陷的特点 ， 还 具有 NK细胞活性很低、无循环补体、巨噬细胞和 APC 细胞功能损害 的特性 ；同时 还具有放射敏感性高、渗漏现象少、不能发生自发免疫性糖尿病的特点。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物四、联合免疫 缺陷动物 生物学特征外观与普通小鼠差别不大，有毛 、 白色 、 体重发育基本正常 ；其 免疫力低下极易感染 ； SPF环境下可存活 1.5年以上，平均寿命为 8.5个月左右。 不足之处1、 仍残留低水平的 NK细胞活性 ；2、 生存时间较 SCID小鼠短 ；3、 NOD/SCID小鼠的人体移植瘤能较好地保留人体肿瘤特性 ， 但肿瘤生长的内环境与人体差异 很大，不如 SCID小鼠 ；4、 体内研究结果不一定能完全预测肿瘤在人体内的临床行为。 应用领域对人类肿瘤 学 、血液学、 组织工程、 免疫 系统 重建和干细胞研究具有重要价值 ， 目前已在生命科学的相关领域得到高度重视及广泛应用 。致癌方法研究 发病机制 及 转移机理抗肿瘤药物筛选肿瘤学研究第 四 节 免疫缺陷动物 的应用所有类型的人类肿瘤， 几乎 均已在 免疫缺陷动物 体内建立了各种 移植模型 。 目前肿瘤学 领域的研究已从单纯观察人类肿瘤的大体形态、病理组织学特性及可移植性，转而不断向 细胞及分子水平 发展。肿瘤 细胞和分子遗传学移植性肿瘤模型观察项目1234观察项目一般生物学特性组织病理学观察染色体分析肿瘤标志物检测免疫缺陷动物分类移植性肿瘤模型特点 人类肿瘤组织标本或成株细胞系 ， 均可以用免疫缺陷动物建立移植性肿瘤模型，但模型的移植成功率有 差异 。 人肿瘤细胞株生物学特性稳定，用已建株的癌细胞建立移植性肿瘤模型 ，其 移植成功率 远 高于人癌手术标本移植 。 肿瘤细胞株是目前人体肿瘤异种移植模型最主要的瘤源，很多常用肿瘤细胞株都能达到接近 100的移植成功率。 临床标本它 是异种移植肿瘤模型的重要来源，同时也是人肿瘤细胞株的主要来源，包括肿瘤原发灶及转移灶的手术（活检）标本和患者的癌性腹（胸）水。 肿瘤患者患者 的 恶性程度、年龄、转移情况、治疗与否都对移植成功率 有一定程度的影响。通常情况下患者的肿瘤恶性程度越高、年龄越小、转移越广泛且未经放疗、化疗的移植成功率越高。免疫缺陷动物分类联合免疫缺陷动物移植性肿瘤模型制备方法异位移植 （ HeterotopicTransplantation）是指将肿瘤组织（或细胞悬液）移植到与肿瘤原发部位无关的移植宿主器官组织内。肌肉内 移植皮下移植 肾包膜下移植睾丸包膜下移植脑内移植 腹腔移植异位移植移植性肿瘤模型制备方法原位移植原位移植 （ OrthotopicTransplantation）亦可称为常位移植或正位移植 ， 是指将肿瘤组织（或细胞悬液）移植到与肿瘤原发部位相对应的移植宿主器官组织内。 肿瘤移植成功率 高肿瘤 生物学特性 更接近晚期出现恶病质及广泛转移瘤组织块移植材料 优点1、获得的肿瘤生长均匀，瘤体大小 且生长速率 基本 一致，个体差异较小， 无自发缓解；2、移植成功率高， 某些人体肿瘤细胞系移植成功率接近 100%；3、 移植肿瘤仍保持原有组织的生物学特征 ；4、肿瘤 可连续传代，试验周期通常较短 。 缺点肿瘤生长迅速，与人体肿瘤情况不一致。移植性肿瘤模型优 缺 点 条件基本一致的免疫缺陷动物 同时以同一方式接种 一定量瘤细胞 可以使一群动物带有同样的肿瘤移植性肿瘤的影响因素供体（