果蝇杂交实验实验报告

1 果蝇杂交实验果蝇杂交实验 实验目的实验目的 通过实验验证分离规律 自由组合规律 伴性遗传和连锁互换规律 掌握 果蝇杂交的实验技术和基因定位的三点测验方法 在实验中熟练运用生物统计 的方法对实验数据进行分析 实验原理实验原理 1 果蝇 fruit fly 是双翅目 Diptera 昆虫 属果蝇属 genus Drosophila 约有 3000 多种 我国已发现 800 多种 大部分的物种以腐烂的水 果或植物体为食 少部分则只取用真菌 树液或花粉为其食物 以果蝇作为遗 传学研究的材料 利用突变株研究基因和性状之间的关系已近一百年 至今 各种研究遗传学的工具已达完善的地步 果蝇对今日的遗传学的发展有其不可 磨灭的贡献 从 1980 年初 Drs C Nesslein Volhard 和 E Weichaus 以果蝇作为 发育生物学的模式动物 利用其完备的遗传研究工具来探讨基因是如何调控动 物体胚胎的发育 也带动了其它模式生物 线虫 斑马鱼 小鼠和拟南芥等 的研究 且有非常具体的成果 通常用作遗传学实验材料的是黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 用果 蝇作为实验材料有许多优点 饲养容易 在常温下 以玉米粉等作饲料就可以生长 繁殖 生长迅速 十天左右就可完成一个世代 每个受精的雌蝇可产卵 400 500 个 因此在短时间内就可获得大量的子代 便于遗传学分析 染色体数少 只有 4 对 唾腺染色体制作容易 横纹清晰 是细胞学观察的好材料 突变性状多 而且多数是形态突变 便于观察 果蝇的生活史 果蝇的生活周期长短与温度有密切关系 一般来说 30 以上温度能使果 蝇不育或死亡 低温能使生活周期延长 生活力下降 饲养果蝇的最适温度为 20 25 生活周期长短与饲养温度的关系生活周期长短与饲养温度的关系 10 15 20 25 卵 幼虫 幼虫 成虫 57 天18 天 8 天 6 天 5 天 4 天 果蝇在 25 时 从卵到成蝇需 10 天左右 成虫可活 26 33 天 果蝇的生 2 活史如下 雌蝇 减数分裂 卵 受精 雄蝇 减数分裂 精子 第一批成虫 羽化 第八天 可活 26 33 天 产第一批卵 蛹 第四天 第二次蜕皮 第一批卵孵化 第二天 第零天 第一次蜕皮 幼虫 第一天 果蝇的生活周期和各发育阶段的经过时间 果蝇的性别及突变性状的鉴别 果蝇的每一体细胞有 8 个染色体 2n 8 可配成 4 对 其中 3 对在雌雄果 蝇中是一样的 称常染色体 另外一对称性染色体 在雌果蝇中是 XX 在雄 蝇中是 XY 果蝇的雌雄在幼虫期较难区别 但到了成虫期区别相当容易 雄性个体一 般较雌性个体小 腹部环纹 5 条 腹尖色深 第一对脚的跗节前端表面有黑色 鬃毛流苏 称性梳 Sex combs 雌性环纹 7 条 腹尖色浅 无性梳 实验中选用的果蝇突变性状一般都可用肉眼鉴定 例如红眼与白眼 正常 翅与残翅等 而另一些性状可在解剖镜下鉴定 如焦刚毛与直刚毛等 现列表 如下 实验中使用的果蝇突变品系实验中使用的果蝇突变品系 影响部分突变名称基因符号染色体上座位 翅 眼色 体色 刚毛 翅形 残翅 白眼 黑体 焦刚毛 小翅 vg w b sn m IIR 67 0 X 1 5 IIR 48 5 X 21 0 X 36 1 3 焦刚毛的基因座为 sn3 本文简写为 sn 2 野生型果蝇为红眼 灰身 长翅 直刚毛 与这些性状对应的突变性状 很多 其中灰身 与黑身 b 是一对相对性状 且灰身对黑身为完全显性 控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上 用具有这对相对性状的两纯合 亲本杂交 性状的遗传行为应符合分离定律 3 黑体果蝇的体色为黑色 b 与之相对应的野生型果蝇的体色为灰色 灰色对黑色为完全显性 控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上 果蝇另一突变性状为焦刚毛 sn 与之对应的野生型性状为直刚毛 控制 这对相对性状的基因位于第一号染色体上 直刚毛对焦刚毛为完全显性 用具 有这两对相对性状的纯合亲本杂交 其性状的遗传行为应符合自由组合定律 4 生物某些性状的遗传常与性别联系在一起 这种现象称为伴性遗传 sex linked inheritance 这是由于支配某些性状的基因位于性染色体上 果蝇 属 XY 型生物 共有四对染色体 第一对为性染色体 其余三对为常染色体 雌果蝇的性染色体构型为 XX 雄果蝇为 XY 控制果蝇眼色的基因位于 X 染 色体上 在 Y 染色体则没有与之相应的等位基因 将红眼 果蝇和白眼 w 果蝇杂交 其后代眼色的表现与性别有关 而且 正反交的结果不同 5 不完全连锁基因在形成配子时 随同源染色体非姊妹染色体单体之间发 生交换而交换 产生一定频度的重组型配子 在子代中表现一定比例的重组性 状 通过观察和统计测交子代各种表型的个体数 可估算出连锁基因间的交换 率 由此确定基因在染色体上的相对位置 绘制出连锁遗传图 已知果蝇 Drosophila melanogaster 的红眼 对白眼 w 是显性 直刚毛 对焦刚毛 sn 是显性 长翅 对小型翅 m 是显性 控制这三对相对性 状的基因都位于 X 染色体上 若将白眼 w 焦刚毛 sn 小型翅 m 三隐 性突变体雌蝇 Xw sn mXw sn m 与红眼 直刚毛 长翅 野生型雄 蝇 X Y 杂交 则 F1可产生三杂合体雌蝇 Xw sn mX 和三隐性雄蝇 Xw sn mY 由于 Y 染色体上不携带相应的等位基因 因而表现出 X 染色体上三个 隐性基因所控制的性状 相当于一个三隐性纯合体 用 F1代杂交 相当于测交 F2代表现出的 8 种表型及数目与 F1雌蝇产生的 8 种配子及数目一致 通过观察 和统计 F2代 相当于测交子代 8 种表型的个体数 就可估算出这三对基因间 的交换率 由此确定这三对基因其在染色体上的相对位置 绘制出连锁遗传图 实验材料实验材料 不同品系的黑腹果蝇 黑身果蝇 b 黑体 红眼 长翅 直刚毛 bb 品系 三隐果蝇 灰体 白眼 小翅 焦刚毛 ww snsn mm 品系 实验用具 药品 双筒解剖镜 镊子 解剖针 毛笔 白瓷板 吸水纸 培养箱 饲养瓶 指管 麻醉瓶 棉花 乙醚 酒精 丙酸 培养基等 4 实验操作实验操作 一 果蝇实验技术 1 麻醉 对果蝇进行检查时 用乙醚麻醉 使果蝇处于昏迷状态 使用时 将乙醚 2 3 滴 滴到麻醉瓶的棉花球上 注意不要让乙醚流进瓶内 麻醉 瓶要保持干燥 否则会粘住果蝇翅膀 影响观察 麻醉果蝇时 先将长有果蝇 的培养瓶在海棉垫上敲 使果蝇全部震落在培养瓶底部 然后迅速打开培养瓶 的棉塞 把果蝇倒入去盖的麻醉瓶中 并立即盖好麻醉瓶 待果蝇全部昏迷后 倒在白瓷板上进行观察 果蝇的麻醉程度看实验要求而定 对仍需培养的果蝇 以轻度麻醉为宜 但对不再培养 单单进行性状观察的果蝇可以深度麻醉 甚至致死也无妨 果 蝇翅膀外展 45 角 说明死亡 检查完毕后 把不需要的果蝇倒入盛有煤油或 酒精或水的瓶中 死蝇盛留器 2 果蝇交配 将雌雄果蝇放在一起培养 雌蝇的生殖器中有贮精囊 可保 留交配所得的大量精子 雌蝇一次交配所得的精子 足够它多次排出的卵受精 因此在做杂交试验时 雌蝇必须选用处女蝇 没有交配过的雌蝇 雌蝇孵出后 12 小时内不会交配 这个时间内把果蝇全部倒出 分出雌雄蝇 单独饲养 这 时收集的雌蝇是处女蝇 杂交时把所需品系的雄蝇直接放到处女蝇培养瓶中 贴好标签 注明两亲本的基因型及交配日期 进行培养 7 8 天后倒掉亲本 一定要倒干净 以免亲代和子代混淆 待 F1 成蝇羽化后开始计算 观察性 状 可靠的计数及观察是培养开始的 20 天以内 再晚 F2 也可能有了 若须继 续实验 观察 F2 可在 F1 内挑出雌雄数对 另外培养 因为这次是用 F1 作亲 本 进行个体间互交 所以这时不是处女蝇也可以 但如要把 F1 雌蝇与另一品 系雄蝇杂交时 还要严格地选取处女蝇 方法同上 3 原种培养 在作新的留种培养时 应事先检查一下果蝇有没有混杂 以防原种丢失 亲本的数目一般每瓶 5 10 对 移入新瓶时 须将培养瓶横卧 然后用毛笔将 麻醉的果蝇从白瓷板上轻轻扫入 待果蝇醒过来后再把培养瓶竖起 以防果蝇 粘在饲料上 原种每 2 4 周换一次培养基 依温度而定 10 15 约 4 周换一 次 20 25 约二周换一次 每一原种培养至少保留两套 培养瓶的标签上要 写明突变名称 培养日期等 作原种培养温度可控制在 10 15 培养时避免 日光直射 果蝇在适宜条件下会产子代 在肉眼能看到幼虫时就可把亲本倒掉 几天 以后 新的成蝇便产生 待成蝇有了足够保种的数量后 要调换培养瓶 作为 下一代的亲本 继续培养 5 原种果蝇培养遇到的麻烦是饲料发霉 发霉的原因很多 如用具没有灭菌 空气污染 亲本不及时倒掉 都会引起饲料发霉 严重的霉菌污染会影响果蝇 的生长 饲料中加丙酸可以抑制霉菌 但并不能完全制止 发现培养瓶中有少 量霉点时可用烧过的解剖针挑出 若大量霉菌污染 可把果蝇全部倒在一个消 毒过的空指管中 让它活动 2 3 小时 换一支指管 再活动 1 2 小时 而后 倒入一支新的培养瓶中继续培养 这样可以防止霉菌污染 原种保存遇到的另一个问题是混杂 几个不同品系的果蝇在一起培养 一 定要防止混杂 培养瓶的塞子要做得紧些 不使果蝇逃出 调换培养瓶时 要 防止果蝇飞散 外逃的果蝇要打死 发现了混杂的原种 要根据原种果蝇的全 部特征 挑出数对雌雄蝇饲养 进行筛选直到完全没有分离为止 这样做 费 时费力 只是在不得已时才采用 一般混杂时 只要方便 可以重新引种 将 混杂种弃去 二 果蝇杂交实验 1 果蝇的性状观察 性别鉴定及饲养 2 选取杂交亲本中所用的母本必须是处女蝇 刚羽化的雌蝇在 12h 内一 般无交配能力 在杂交前放出亲本培养瓶中的所有成蝇 每隔 10 12h 收集一 次羽化的成蝇 并将雌雄蝇分开饲养 收集处女蝇数量的多少根据需要而定 3 麻醉接种 用黑身果蝇与三隐果蝇杂交 正反交同时进行 即三隐 黑身 黑身 三隐 将所选处女蝇按品系分别麻醉 按不同杂交组合分别选取雌 雄蝇各 6 10 只移入杂交瓶中 为了防止昏迷果蝇被培养基粘住 可将培养瓶放倒 将果蝇置于瓶壁 待其苏醒后再将培养瓶直立 贴上标签 将杂交瓶放在 20 25 恒温箱内培养 4 培养 7 8d 倒掉杂交亲本 倒掉的果蝇最好处死 5 再过 4 5d F1代成蝇出现 观察 F1代性状是否和预期结果一致 6 收集 6 10 对 F1代果蝇放入一新培养瓶 在 20 25 恒温箱内继续 培养 以便观察 F2代 正反交作相同处理 7 继续培养 7 8d 后 移去 F1代 8 再 4 5d F2代成蝇出现 开始观察并统计 F2代的性状表现类型及数 目 结果统计分析结果统计分析 一 数据记录 反交 bb X X BBXw m snY 日期 姓名 正交 BBXw m snXw m sn bbX Y 日期 姓名 6 灰体黑体 正 交 合计 红 长 直 162212475614263856 白 小 焦 118511543973623098 白 长 直 30926111377760 红 小 焦 2642599996718 红 长 焦 63492217151 白 小 直 81972636240 红 小 直 311315127128881 白 长 焦 34124513175792 体色合计78032693 性别合计4176362714761217 性别合计 5652 4844 10496 灰体黑体 反 交 合计 红 长 直 3558143711534816629 白 小 焦 1459141223131494 白 长 直 462052774352 红 小 焦 731952662356 红 长 焦 41883141201 白 小 直红 小 直 15731896125696 白 长 焦 612742677438 体色合计7598270110299 7 性别合计4094350414931208 性别合计 5587 4712 二 统计分析 1 分离定律 图谱分析 P BB 灰体 bb 黑体 F1 Bb 灰体 自交 F2 BB Bb bb 灰体 黑体 理论 比值 3 1 实际 正交数量 7803 2693 比值 2 90 1 反交数量 7598 2701 比值 2 81 1 2检验 基因体色基因 B b F2表型灰体黑体合计 实得数 O7803269310496 预期数 E7872262410496 2 2 4192 正交 P n 1 0 10 0 50 0 05 差异不显著 基因体色基因 A a 表型灰体黑体合计 实得数7598270110299 预期数7724 252574 7510299 2 8 2540 反交 P n 1 0 01 差异极显著 2 自由组合定律 图谱分析 正交 P 灰体焦刚毛 BBXsnXsn 黑体直刚毛 bbX Y 8 F1 BbX Xsn BbXsnY F2 BBX Xsn BbX Xsn BBXsnXsn BbXsnXsn bbX Xsn bbXsnXsn BbX Y BBX Y BBXsnY BbXsnY bbX Y bbXsnY 灰体直刚毛 黑体直刚毛 灰体焦刚毛 黑体焦刚毛 理论 比值 3 1 3 1 实际 数量 4243 1494 3560 1199 比值 3 54 1 25 2 97 1 反交 P 黑体直刚毛 bbX X 灰体焦刚毛 BBXsnY F1 BbX Xsn BbX Y F2 BBX X BbX X BBX Xsn BbX Xsn bbX Xsn bbX X BbX Y BBX Y BBXsnY BbXsnY bbX Y bbXsnY 灰体直刚毛 黑体直刚毛 灰体焦刚毛 黑体焦刚毛 理论 比值 9 3 3 1 实际 数量 5807 2003 1791 698 比值 8 32 2 87 2 57 1 2检验 表型 灰体直刚毛黑体直刚毛灰体焦刚毛黑体焦刚毛 合计 实得数424314943560119910496 预期数393613123936131210496 2 94 8463 正 交 P n 3 0 01 差异极显著 实得数58072003179169810299 预期数5793 18751931 06251931 0625643 687510299 2 17 4544 反 交 P n 3 0 05 差异不显著 表型雌雄雌雄合计 实得数306925372583230710496 预期数262426242624262410496 2 117 2880 正 交 F2 P n 3 0 05 差异不显著 表型雌雄雌雄合计 实得数51352747 19659847 反 交 F2 预期数4923 52461 75 2461 759847 10 2 142 3761 P n 2 0 05 说明实验得到的数据与理 论的数据相差不大 支持最初的假设 但是对于反交来说 得到的 P 值 0 01 说明与孟德尔分离定律相差很大 不能够用基因的回交来说明 2 自由组合定律的验证 果蝇的