8基因治疗原理与研究进展

1 第十三章基因治疗原理与研究进展 主讲 曾赵军分子生物学研究中心 2 根据靶细胞不同 基因治疗分为 体细胞 somaticcell 基因治疗生殖细胞 germline 基因治疗 只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代 3 基因治疗的概念 将某个遗传物质转移到患者细胞内 使其在体内发挥作用 以达到治疗疾病目的方法 4 1 基因治疗的策略 内容提要 2 基因转移技术 4 治疗基因的受控表达 3 基因干预 5 基因治疗的应用研究 6基因治疗的问题与展望 5 第一节基因治疗的策略 6 一 基因置换 genereplacement 定义 指将特定的目的基因导入特定细胞 通过定位重组 导入的正常基因 以置换基因组内原有的缺陷基因 目的 将缺陷基因的异常序列进行校正 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复 不涉及基因组的任何改变 7 定向整合的条件 转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列 带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点 进行部分基因序列的交换 使基因置换这一治疗策略得以实现 基因同源重组技术又称为基因打靶 genetargeting 基因同源重组技术 8 缺陷基因 正常基因 重组载体 正常基因 定位重组技术 染色体 9 二 基因添加 geneaugmentation 定义 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因 类型 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因 而细胞内的缺陷基因并未除去 通过导入正常基因的表达产物 补偿缺陷基因的功能 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因 利用其表达产物达到治疗疾病的目的 10 定义 采用特定的方式抑制某个基因的表达 或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达 以达到治疗疾病的目的 例如反义核酸 核酶或干扰RNA技术等 三 基因干预 geneinterference 11 为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一 原理 将 自杀 基因导入宿主细胞中 这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物 诱导靶细胞产生 自杀 效应 从而达到清除肿瘤细胞的目的 四 自杀基因治疗 12 自杀基因的作用机制 13 TK GCV 单纯疱疹病毒 herpssimplexvirus HSV 型胸苷激酶 thymidinekinase tk 基因编码胸苷激酶 特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷 ganciclovir GCV 转变成毒性GCV三磷酸核苷 后者能抑制DNA聚合酶活性 导致细胞死亡 一 自杀基因系统 14 CD 5 FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 cytosinedeaminase CD 基因 在细胞内将无毒性5 氟胞嘧啶 5 FC 转变成毒性产物5 氟尿嘧啶 5 FU 一 自杀基因系统 15 旁观者效应 自杀基因 导入后 不仅使导入了 自杀基因 的肿瘤细胞在用药后被杀死 而且与其相邻或远处的未转导 自杀基因 的肿瘤细胞也被杀死 其明显增强了自杀基因的肿瘤杀伤作用 二 旁观者效应 16 五 基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织 以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应 17 第二节基因转移技术 18 基因治疗的两种方式 invivo exvivo 靶细胞 将目的基因直接输入体内 将目的基因导入患者靶细胞 体外培养 将重组靶细胞回输体内 19 基因治疗的方式 直接体内疗法 invivo 是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官 使其进入相应的细胞并进行表达 2 间接体内疗法 exvivo 是指在体外将目的基因导入靶细胞 经过筛选和增殖后将细胞回输给患者 使该基因在体内有效地表达相应产物 以达到治疗的目的 20 一 病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高 因此它也是使用最多的基因治疗载体 据统计 有72 的临床实验计划和71 的病例使用了病毒载体 其中用得最多的是逆转录病毒载体 21 一 逆转录病毒 Retrovirus 载体 人类免疫缺陷病毒 HIV 22 逆转录病毒的生活周期 23 逆转录病毒的生活周期 24 逆转录病毒的生活周期 25 1 两端各有一长末端重复序列LTR 1 逆转录病毒前病毒的结构特点 2 LTR由U3 R和U5三部分组成 U3内有增强子和启动子 U3和U5两端分别有病毒整合序列 IS 在R内还有poly A 加尾信号 26 1 逆转录病毒前病毒的结构特点 3 病毒有三个结构基因 gag pol和env基因 4 5 端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列 及剪接供体位点 SD 和剪接受体位点 SA 27 2 逆转录病毒介导的基因转移系统 1 逆转录病毒载体 保留病毒颗粒的包装信号 而缺失病毒颗粒包装蛋白基因 它可以克隆并表达外源基因 但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒 28 2 逆转录病毒介导的基因转移系统 2 辅助细胞株它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建而成 该细胞株能合成包装蛋白 用于逆转录病毒载体包装 由于缺乏包装型号 本身不能被包装成病毒颗粒 29 Retroviralpackagingsystem 30 逆转录病毒结构基因gag env和pol的缺失不影响其他部分的活性 包装好的假病毒颗粒易于分离制备 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞 前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中 有利于外源基因在靶细胞中的永久表达 3 逆转录病毒载体的特点 31 4 逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合 有插入突变 激活癌基因的潜在危险 逆转录病毒载体的容量较小 只能容纳7kb以下的外源基因 32 二 腺病毒 adenovirus AV 载体 33 二 腺病毒 adenovirus AV 载体 腺病毒是一种大分子 36kb 双链无包膜DNA病毒 它通过受体介导的内吞作用进入细胞内 然后腺病毒基因组转移至细胞核内 保持在染色体外 不整合进入宿主细胞基因组中 34 腺病毒的优点 1 基因导入效率高 2 宿主范围广 3 基因转导与细胞分裂无关 4 重组腺病毒可通过口服经肠道吸收 或喷雾吸入或气管内滴注 5 腺病毒载体容量较大 可插入7 5kb外源基因 35 腺病毒载体缺点 2 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂 3 有两个环节可能产生复制型腺病毒 载体与辅助细胞或患者体内野生型病毒发生重组 4 靶向性差 1 不能整合到靶细胞的基因组DNA中 治疗基因表达时间相对较短 36 三 腺病毒相关病毒载体 AAVVirusParticle 腺病毒相关病毒 adenovirusassociatedvirus AAV 是一类单链线状DNA缺陷型病毒 其基因组DNA小于5kb 无包膜 外形为裸露的20面体颗粒 AAV不能独立复制 只有在辅助病毒 如腺病毒 单纯疱疹病毒 痘苗病毒 存在时 才能进行复制和溶细胞性感染 否则只能建立溶源性潜伏感染 37 StructureofAAVVirusGenomicDNA REP 病毒复制基因 CAP 编码衣壳蛋白的基因 ITR 反向末端重复序列 38 AAV的特点 以潜伏感染为主 AAV可以高效定点整合至人染色体中 可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性 而且外源基因可以持续稳定表达 39 AAV载体的缺陷 40 常用基因治疗载体 7 5kb 41 二 非病毒载体介导的基因转移系统 一 脂质体介导的基因转移技术基本原理 利用阳离子脂质体单体与DNA混合后 可以自动形成包埋外源DNA的脂质体 然后与细胞一起孵育 即可通过细胞内吞作用将外源DNA 即目的基因 转移至细胞内 并进行表达 42 脂质体介导的基因转移示意图 43 二 受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联 可使DNA具有靶向性 44 受体介导转移技术示意图 45 三 基因直接注射技术如 肌内注射凝血因子 基因 可产生血友病所需的凝血因子 46 第三节基因干预 一 反义RNA二 RNA干扰三 核酶 47 一 反义RNA 一 反义RNA与基因表达调控主要指能与特定基因mRNA互补结合的一类RNA 可抑制一些有害基因的翻译 48 反义RNA的关键技术问题 反义RNA进入靶细胞前的降解问题 专一性转移问题 解决举例 将脱唾液酸血清类粘蛋白 ASGP 与多聚赖氨酸 PL 共价连接 得到ASGP PL复合物 成为运载核酸的工具 可以专一性地使反义RNA特异进入肝细胞 49 二 受体介导反义RNA技转移术 受体介导的RNA转移十分专一 而且效率高 被转移的RNA是被保护的 与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用 借助前述的受体介导基因转移方法 可以实现受体介导的反义RNA转移 50 三 反义RNA的应用前景 l 安全性高 2 反义RNA设计和制备方便 3 具有剂量调节效应 4 能直接作用于一些RNA病毒 51 二 RNA干扰 RNAinterference RNAi 由双链RNA介导的细胞内特异性mRNA降解过程 导致靶基因的表达沉默 52 一 RNA干扰机制示意图 53 二 RNA干扰的应用前景 1 研究基因功能的新工具 2 肿瘤的基因治疗 3 病毒性疾病的基因治疗 54 三 核酶 ribozyme 具有酶活性的RNA 可降解特异的mRNA序列 与靶序列互补的区域保守区域 构成酶活性的结构域 55 核酶的作用机制 56 二 核酶的应用 与一般的反义RNA相比 核酶具有较稳定的空间结构 不易受到RNA酶的攻击 更重要的是 核酶在切断mRNA后 又可从杂交链上解脱下来 重新结合和切割其它的mRNA分子 57 第四节治疗基因的受控表达 治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间 空间和水平三个方面 其策略大致有以下几种 基因内部调节机制 基因外部调节机制 利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等 58 使用正常细胞的组织特异性启动子 增强子元件 例如酪氨酸酶基因 使用病变细胞的组织特异性启动子 增强子元件 如甲胎蛋白 AFP 基因 一 基因内部的调节机制 59 二 基因外部的调节机制 除利用基因内部的调节机制以外 还可通过施加外部刺激 比如对病灶局部进行热处理或电离辐射等 促进治疗基因在特定细胞或组织中表达 60 三 利用病灶微环境使治疗基因特异性表达 病灶微环境与正常时往往不同 因此可利用这些变化控制治疗基因的表达 比如 肿瘤组织往往会出现葡萄糖缺乏或缺氧等微环境 炎症组织特殊微环境等 61 四 治疗基因的诱导表达为了防止其表达不再受外界控制 所以有必要开发和完善一些可诱导性基因表达系统 这种系统的必要成分 一种是转录激活剂 它与DNA结合的活性受某种诱导药物控制 另一种则是特异性基因表达调控元件 仅对这种转录激活剂有所响应 62 四环素抗性操纵子系统原理 四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控 无四环素存在时 阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达 四环素存在时 阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性 造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除 使四环素抗性基因的转录得以进行 63 Tet Off系统中 Tet控制的转录活化子 tTA 是野生型Tet阻遏蛋白 TetR 与一活化蛋白 AD 的融合体 64 Tet On系统中 TetR中四个氨基酸变化使其结合特性变为方向 rTetR 65 第五节基因治疗的应用研究 66 1 腺苷脱氨酶 ADA 和嘌呤核苷磷酸化酶 PNP 缺乏症2 珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病3 血友病和其他血浆蛋白缺乏症4 苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病5 莱 纳 Lesch Nyhan 综合征6 家族性高胆固醇血症7 囊性纤维化病 一 遗传病的基因治疗研究 67 第一例基因治疗 腺苷脱氨酶缺乏症 生理 腺苷脱氨酶是一种细胞内酶 在核酸代谢中起重要作用 使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷 最后代谢为尿酸 排出体外 病理 腺苷脱氨酶缺乏 脱氧腺苷不能脱氨 脱氧腺细胞内堆积 淋巴细胞死亡 机体免疫功能缺乏 68 治疗基础 腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂1983年腺苷脱氨酶基因被克隆应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达 69 ADA缺乏症 FrenchAnderson NIH September14 1990 70 基因治疗的临床应用 AshantideSilva Ashantiwasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy Injectionsrepeated7timesinfirst10 5months ADA 1 25 71 治疗步骤 抽取病人骨髓 分离淋巴细胞将病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒载体混合培养 使腺苷脱氨酶进入淋巴细胞清洗淋巴细胞 去除多余病毒载体 应用抗性基因等方法选择阳性细胞 检测细胞内外腺苷脱氨酶含量 72 治疗步骤 确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后 将带有此基因的淋巴细胞输回患者体内密切观察病人各项免疫指标的变化 必要时加以调整和重复经如上治疗后 患病女童免疫功能基本恢复 以后又连续进行了多次输入 73 乙型血友病 薛京伦 复旦大学 1991 皮肤成纤维细胞 FactorIX 5 74 逆转录病毒载体 F cDNA重组体5 LTRF neoSVPSOLTR3 导入仓鼠细胞 CHO F 表达 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞 体外培养 F 表达 91年 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞 体外培养 回植病人皮下 F 基因表达 F 基表达水平达正常人的5 是我国基因治疗成功的例子 75 二 恶性肿瘤基因治疗研究 常用基因