时间分辨荧光分析技术

1 1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立 起来的 自 1978 年提出以来 1 已广泛的应用于免疫分析 核酸测定 荧光显 微镜成像 细胞识别 单细胞原位测定 生物芯片等生化领域 并发展出了相 应的时间分辨荧光免疫测定法 时间分辨荧光 DNA 杂交测定法 时间分辨荧 光显微镜成像测定法 时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片 测定法等分支 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理 荧光性质 时间分辨荧光测定的 原理 时间分辨荧光免疫分析技术 时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展 等加以介绍 1 1 1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中 IIIB 族的镧系元素以及钪和钇 共 17 种元 素 其中镧系元素的外层电子结构为 4f 0 145d 0 106s 1 2 由于 5s 和 5p 电子对 4f 电子的屏蔽作用 导致这些金属及其离子的性质十分相似 图 1 1 给出了四种 三价稀土离子的基态及激发态电子能级图 2 0 10 20 15 25 30 35 5 ENERGY 103cm 1 6H5 2 4G5 2 597 nm 6H15 2 7F0 7F2 5D0 5D1 615 nm 7F6 7F5 5D4 5D3 545 nm 6H13 2 4F9 2 483 nm Sm3 Eu3 Tb3 Dy3 6H9 2 图 1 1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig 1 1 Electronic energy levels of certain lanthanide III ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的 只有 Sm3 Eu3 Tb3 和 Dy3 的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光 当 Sm3 Eu3 Tb3 和 Dy3 与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增 强 这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的 3 8 以铕 III 配合物为例 其荧光发光机理如图 1 2 所示 9 包括三线态发光机理和 单线态发光机理 当铕 III 配合物受光激发后 配体分子吸收激发光能量由基 态 S0跃迁至第一单线激发态 S1 处于此激发态的分子不稳定 可以通过辐射跃 迁的方式返回基态 发出配体荧光 S1 S0 也可以通过系间窜跃 非辐射 跃迁方式 将能量传递至配体的第一三线激发态 T1 处于 T1能级的配体分子可 以通过辐射跃迁的方式回到基态 发出配体磷光 T1 S0 当 T1能级高于 Eu3 的共振能级时 能量就可以进一步传递给 Eu3 使之激发至共振能级 并在 由共振能级跃迁回基态的过程中发出 Eu3 的特征荧光 此即三线态发光机理 而上述处于 S1激发态的配体分子如果不经过 T1激发态 直接将能量传递给 Eu3 使之激发至共振能级 然后由共振能级跃迁回基态发出 Eu3 的特征荧光 此即单线态发光机理 到目前为止 绝大多数的 Eu3 配合物的荧光发光都遵循 三线态发光机理 只有极个别的遵循单线态发光机理 Eu3 ligand T1 S1 S0 7F0 7F2 5D0 5D1 7F6 energy transfer absorption prompt ligand fluorescence phosphorescence isc thermal decay Eu3 ligand T1 S1 S0 7F0 7F2 5D0 5D1 7F6 energy transfer absorption prompt ligand fluorescence phosphorescence isc 5D3 5D2 a b 图 1 2 铕 III 配合物发光机理示意图 a 三线态发光机理 b 单线态发光机理 Fig 1 2 Schematic diagrams of the radiative processes of the chelate leading to Eu3 fluorescence by a triplet excited state mechanism and b singlet excited state mechanism 不同于有机荧光化合物 稀土配合物的荧光性质 一方面取决于有机配位 体的三重态能级 T1的位置 另一方面取决于配位体与稀土离子处于激发态时的 能量匹配程度 荧光发光的波长和强度 均随稀土离子的不同而不同 Sm3 Eu3 Tb3 Dy3 等稀土离子的配合物属于镧系元素荧光配合物中的强 荧光物质 激发这些离子所需能量较低 同时由于这些离子的激发态和基态能 量相差较大 非放射迁移较小 因此它们的荧光量子产率相对较高 由于稀土荧光配合物特殊的发光机理 使其相对于常规有机荧光化合物 像荧光素和罗丹明等而言具有以下特点 1 荧光发射的特征峰波长主要与中心离子有关 而与配位体结构关联 不大 稀土配合物发光是基于配合物内由配位体到中心金属离子的能量转移所 产生的 配位体吸收激发光能量后转移到中心稀土离子 然后再通过中心稀土 离子的 4f 轨道能量跃迁而发出荧光 即接受激发光能量和发射荧光是由不同的 部分所完成的 因此同一种稀土离子与不同配位体形成的配合物的荧光发射峰 波长基本不变 2 荧光寿命非常长 通常在 10 s Sm3 Dy3 或 100 s Eu3 Tb3 以上 这是由于稀土配合物的发光是经过配位体的三重态的能 量转移所致 所产生的荧光是延迟荧光 其寿命比配位体的磷光寿命还要长 从表 1 1 可以看出 Eu3 配合物的荧光寿命比普通荧光化合物的荧光寿命要长大 约 105倍 利用这种长荧光寿命 就可进行百微秒级的时间分辨荧光测定 3 稀土配合物所发荧光的 Stokes 位移 最大发射峰与最大吸收峰之间 的波长差 非常大 大部分在 200 nm 以上 对克服因激发光而导致的散乱光对 测定的干扰很有利 4 荧光激发谱带较宽 有利于增高激发能 而发射峰非常尖锐 半峰宽 通常在 10 15 nm 为类线性光谱 有利于降低本底 提高分辨率 稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质比较 10 12 见表 1 1 表 1 1 稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质 Tab 1 1 Fluorescence properties of lanthanide complex and conventional organic compounds Compound Lifetime ns ex max nm em max nm Stokes shift nm Quantum yields Q mol 1Lcm 1 FITC4 5492518260 857 0 x 104 RBITC3550585350 701 2 x 104 Cy5 650667170 272 5 x 105 Eu NTA 3 7 x 1053406132730 2093 6 x 104 FITC Fluorescein isothiocyanate RBITC Rhodamine B200 isothiocyanate Cy5 Cyanine dye NTA 2 naphthoyltrifluorobutanedione 1 1 2 时间分辨荧光测定原理 时间分辨荧光测定技术是利用稀土配合物具有长寿命荧光这一特点 在样 品被脉冲光激发后 荧光信号采集前 根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命 的不同引入一定的延迟时间 delay time 待短寿命的背景荧光完全淬灭后 再 对长寿命的特异性荧光信号进行测定 原理如图 1 3 所示 采用时间分辨荧光 测定技术可以有效消除来自样品 试剂 仪器等的短寿命非特异性荧光的干扰 从而极大地提高荧光检测的灵敏度 Delay time Counting time Recovery time Time s 02006001000 Fluorescence intencity Flash excitation Short lived background fluorescence Long lived lanthanide fluorescence Cycle time 1000 s 图 1 3 时间分辨荧光测定的原理 Fig 1 3 Principle of time resolved fluorescence measurement 1 1 3 时间分辨荧光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术是采用具有超长荧光寿命的稀土荧光配合物作 为标记物的时间分辨荧光生化分析技术 详细内容将在 1 2 4 5 节进行叙述 1 1 4 时间分辨荧光显微镜生物成像技术 荧光显微镜生物成像技术因其具有可视化特点 已成为不同生物环境中生 物分子的可视化及生物功能的阐述等方面的一种强有力的工具 13 14 然而对于 一些复杂生物体系来讲 体系本身的自发荧光及仪器背景荧光会对荧光成像产 生严重干扰 在过去十年中逐渐发展起来的时间分辨荧光显微镜生物成像技术 是基于长寿命稀土荧光标记物而建立起来的 目前被广泛应用于免疫组织化学 15 17 免疫细胞化学 18 原位核酸杂交 15 16 生物分子可视化和定量测定 19 20 细胞中特定离子检测 21 及环境微生物检测 22 23 等方面 该技术的最大优点是能 够在脉冲激发和荧光成像检测之间引入适当的延迟时间 从而消除常规荧光显 微镜测定时生物样品的短寿命本底荧光对测定的干扰 使得影像具有更高的灵 敏度和信噪比 1992年 Soini等以4 4 异硫氰基苯乙炔基 2 6 二 胺甲基 N N 二乙酸基 吡啶 Eu3 配合物标记的抗体或SA为探针 用于与人结肠恶性粘膜癌相关的C242 抗原 人软骨性生长II类胶原质mRNA 人宫颈扁平上皮细胞中的HPV特异基因 的时间分辨荧光显微镜成像定位 15 实验结果表明通过时间分辨荧光成像方法 可以有效消除免疫组织化学及核酸原位杂交反应中的样品自发荧光对测定的干 扰 从而实现在细胞和组织水平上的高对比度成像测定 使用Eu3 荧光标记物 的时间分辨荧光显微镜测定技术还被用于人类血清中胰岛细胞自身抗体的定量 测定 20 该方法首先在载片表面将血清和胰腺组织反应 然后载片再与铕配合 物标记的抗人IgG抗体反应 最后进行时间分辨荧光显微镜测定 该法的信噪比 要比常规测定法大12倍 1999年 Lilja等人将铕荧光配合物标记的SA用于前列 腺组织中前列腺特异抗原的免疫组织化学测定 17 比起使用过氧化物酶标记SA 的测定法 时间分辨荧光显微镜成像测定法具有高信噪比和高灵敏度的优点 可用于替代所有使用过氧化物酶标记SA的测定法 2001年 L vgren等人以铕 纳米微粒作为荧光标记物 采用时间分辨荧光成像方法实现了对单个前列腺特 异抗原分子的可视化检测 19 2004年 Piper等人报道了利用时间分辨荧光显微 镜成像技术检测浓缩水样中的病源微生物Cryptosporidium和Giardia 他们首先 将BHHST Eu3 配合物分别标记上抗Cryptosporidium单抗和羊抗鼠二次抗体 然 后分别与浓缩水样中的Cryptosporidium和经单抗预处理过的Giardia共同孵育 最后进行时间分辨荧光成像检测 结果显示水样中杂质的强背景荧光被完全消 除 检测信噪比增强了10倍 22 2007年 Nagano等开发出一种基于铕配合物的 Zn2 选择性化学传感器 将其注射进入活Hela细胞内 利用时间分辨荧光显微 镜能够监测出细胞内Zn2 浓度的变化