口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK21细胞的转录组分析.doc

口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK21细胞的转录组分析 分类号Q93密级U DC编号10486博博士学位论文口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK-21细胞的转录组分析研究生姓名李佳黛指导教师姓名、职称郑从义教授专业名称微生物学研究方向病毒感染细胞生物学二一九年五月三十日Classified Number:_Q93_Secret grade:_UDC:_Thesis number:_10486_WuhanUniversity Doctorof PhilosophyThesis Transcriptomeanalysis of acutely and persistently foot-and-mouth diseasevirus infectedBHK-21Student Name:Jiadai LiName andTitle ofSupervisor:Prof.Zheng CongyiMajor:Microbiology ResearchArea:Cell Biologyof VirusInfection May30,2019论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。 除文中已经表明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已发表或撰写的研究成果。 对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者（签名）年月日论文创新点1.本研究使用转录组测序技术对FMDV急性感染晚期的BHK-21细胞转录本进行深入分析，揭示了急性感染后1162个基因表达和1195个选择性剪切事件的改变，这些基因参与到多种细胞功能中。 2.本研究首次分析比较了FMDV急性感染和持续性感染细胞系的全部转录本，发现8378个基因的表达在这两种细胞系中发生了显著性差异，并发现90%以上的核糖体和翻译相关基因在持续性感染细胞系中下调，在急性感染中却没有明显变化，说明宿主细胞的核糖体和翻译相关基因功能在持续性感染的形成中至关重要。 3.本研究发现FMDV在感染后期会激活MAPK/ERK和MAPK/p38信号通路，激活过程依赖FMDV的复制，而特异性抑制这两个通路可以抑制FMDV感染。 4.本研究发现MAPK14和Hspb1在FMDV持续性感染细胞系中的表达明显低于急性感染和正常BHK-21细胞，并通过实验证明下调这两个基因的表达能抑制FMDV的复制。 动物急性感染FMDV后会出现发烧、皮肤溃烂等症状，而急性感染期病毒清除失败还会形成持续性感染，对畜牧业造成巨大的打击。 目前对FMDV急性感染和持续性感染过程中宿主细胞功能的研究十分有限，对它们更深入的研究可以帮助我们理解FMDV的感染过程，为今后预防和治疗口蹄疫提供新的方向。 本研究利用转录组测序技术，分析了FMDV急性感染和持续性感染后BHK-21细胞的转录本，发现FMDV急性感染后细胞有1162个基因的表达发生了显著性差异，这些差异表达基因（DEGs）显著富集在细胞组分、细胞代谢、细胞周期、tRNA氨酰化、MAPK信号通路、TNF信号通路、TGF-信号通路、核糖体等细胞功能和细胞信号通路中。 除此之外，FMDV急性感染后还有1195个选择性剪切（AS）事件发生了改变，这些AS事件和基因表达的改变预示着病毒感染后宿主细胞的许多细胞应答发生了改变。 随后，我们分析比较了急性感染和持续性感染BHK-21细胞的转录本，发现这两个细胞的基因表达水平存在很大差异，它们之间共发现了8378个DEGs，这些DEGs在细胞组分、细胞代谢、生物合成、内吞作用等生物过程中显著富集。 通过对这些DEGs的深入分析，我们发现许多核糖体和翻译相关基因在持续性感染细胞中发生了显著下调，并且有更多的免疫相关基因在持续性感染细胞中被激活。 除此之外，还有157个DEGs在这两种细胞系中均发生了差异表达，但变化趋势却不相同，这些基因很可能与这两种细胞系性状的不同密切相关。 由于急性感染和持续性感染细胞的DEGs均在MAPK信号通路上发生了显著富集，因此，我们验证了该通路在FMDV感染中的作用，并发现FMDV感染后期武汉大学博士学位论文II能激活MAPK/ERK和MAPK/p38信号通路，而抑制它们会显著抑制FMDV的感染。 值得注意的是，MAPK信号通路中关键的MAPK14和Hspb1基因在持续性感染细胞中的表达量明显低于急性感染和未感染的细胞，利用shRNA干扰这两个基因的表达后细胞内FMDV非结构蛋白3D的mRNA和蛋白水平均明显下降，说明MAPK14和Hspb1在FMDV感染过程中发挥重要作用，持续性感染细胞系很可能通过下调这两个基因的表达，抑制FMDV复制。 本研究深入分析了急性感染和持续性感染细胞的转录本，揭示了它们之间基因表达的差异，并验证了MAPK信号通路和其中的关键基因在FMDV的感染中的重要作用，为持续性感染形成分子机制的研究提供方向，并为寻找抵抗FMDV的关键宿主因子提供了大量数据支持。 关键词口蹄疫病毒，持续性感染，宿主基因表达，转录组测序口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK-21细胞的转录组分析III Transcriptomeanalysis ofacutely and persistently foot-and-mouth diseasevirus infectedBHK-21Doctoral candidate:Jiadai LiDoctoral supervisor:Congyi Zheng(College ofLife Sciences,Wuhan University,430072)ABSTRACT Foot-and-mouth diseasevirus(FMDV)is asingle positive-stranded smallRNA virusand acausative agentof foot-and-mouth disease(FMD)infection incloven-hoofed animals.It isfeatured ashigh infectivity,rapid spreadingand richdiversity inspreading routes etc.Animals acutely infected with FMDV willshow symptomssuch asfever andskin ulceration.The failureof viralclearance duringacute infectionstage mayinduce persistent infection,which willresult inhuge financiallose to the localanimal husbandry.Currently,studies onhost cells acutely andpersistently infected with FMDVare farfrom enough.Further studyis ofvital significancetotheunderstanding of the infectionprocess of FMDV andmay providenew approachto preventionand treatmentofFMDin thefuture.In this study,RNA-Seq technologywas usedto analyzethe transcriptomeof BHK-21cellsacutelyandpersistently infectedwithFMDV.It wasfound that1162genes ofhost cellare differentially expressed in FMDV acuteinfection.These differentiallyexpressed genes(DEGs)were significantlyenriched incellular ponents,cellular metabolism,cell cycle,tRNA aminoacylation,MAPK signaling pathway,TNF signaling pathway,TGF-signaling pathway,ribosomal andother cellularfunctions andcell signaling pathways.In addition,1195alternative splicing(AS)events were identified followingFMDV infection.The differencesin gene expression andAS eventsindicate achange inmany hostcell responsesfollowing viralinfection.Subsequently,we analyzedand paredthe transcriptomes ofacutelyinfected andpersistently infectedBHK-21cells.It isfound that the geneexpression levels of these two cellswere significantlydifferent.A totalof8378DEGs significantlyenriched inbiological processessuch ascell metabolism,biosynthesis,and endocytosiswereidentified.In-depth analysisof theseDEGs revealsthat manyribosomal and武汉大学博士学位论文IV translation-related geneswere significantlydown-regulated in persistently infected cells.Meanwhile,more immune-related geneswere activatedin persistently infected cells.In addition,157DEGs aredifferentiallyexpressedin bothcells withdifferent variationtrends.These genesmay bethe originof thedifferent charactersbetween thetwo cells.Since DEGsare significantlyenriched inthe MAPK signalingpathwayin boththe acutelyinfected andpersistentlyinfectedBHK-21,we focuson therole ofthis pathwayinFMDV infection.It isfound thatMAPK/ERK andMAPK/p38signalingpathwaysare activatedin cellswithFMDVinfection.Inhibiting themcan significantlyinhibit FMDVinfection.It isworth notingthattheexpression levelsof MAPK14and Hspb1genes inMAPKsignalingpathway aresignificantly lowerinpersistentlyinfected cellsthan thatin acutelyinfected andmock infectedcells.Knowckdown ofthese twogenes withshRNA cansignificantly reducethe mRNAand proteinexpression levelof FMDVnon-structural protein3D.The mRNAand proteinlevelsofprotein3D decreasedsignificantly,magnifesting the important rolesMAPK14and Hspb1play inFMDVinfection.It islikely thatpersistentlyinfectedcell linesmay inhibitFMDV replicationvia down-regulating theexpression ofthesetwogenes.This studyprovides anin-depth analysisofthetranscriptomesofacutelyinfectedandpersistentlyinfectedcells,revealing thevariation ingeneexpressionbetween themand validatingtheimportantrole ofthe MAPKsignalingpathway.Further,thisstudymay providea novelroute tothe researchon molecularmechanisms ofpersistent infectionand providesubstantial datafor searchingfor thekey hostfactor inthe fighttingagainst FMDV.Keywords:FMDV,persistentinfection,host geneexpression,RNA-Seq口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK-21细胞的转录组分析1第一章前言1.1口蹄疫病毒1.1.1口蹄疫及口蹄疫病毒背景介绍口蹄疫（Foot-and-mouth desease,FMD）的历史十分悠久，最早的书面记录可以追溯到1546年，一位僧侣Hieronymous Fracastorius描述了发生在意大利维罗纳附近的一种牛的流行病(Fracastoro,1546)。 这种疾病在随后的几个世纪中因为对养牛业的长期威胁而臭名昭著。 十九世纪末，Loeffler和Frosch从FMD引起的囊泡中取出淋巴液，希望通过细菌过滤材料去除感染性物质，留下能够赋予动物免疫力的抗毒素。 令人惊讶的是，这些感染性物质并不能被过滤掉，它们能够通过滤器，并在受感染的动物中繁殖。 因此，FMD被发现是由一种亚微观的、可过滤的传染因子引起，并且比任何已知的细菌都要小(Loeffler andFrosch,1897,1898)。 口蹄疫病毒（Foot-and-mouth deseasevirus,FMDV）是继烟草花叶病毒发现后第一个被发现的脊椎动物病毒，但在Beijerinck提出可滤性病毒的概念以前，它被称之为传染性流体(Beijerinck,1898;Ivanovskii,1950)。 由于缺乏可以被利用的动物模型，在被发现后的很多年里，对FMDV的研究仍然受到了很大的制约。 人们尝试使用小鼠、大鼠和兔子，发现它们并不能作为研究FMDV理想的动物模型。 直到1920年，Waldmann和Pape发现豚鼠通过皮内接种后垫后会对FMDV敏感，这为FMDV以及其他许多病毒的研究提供了一个重要的模型(Waldmann andPape,1920)。 1.1.2口蹄疫病毒的分类及基因组结构FMDV是小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的成员，其特点包括无包膜、具有正义单链RNA基因组等，巴尔的摩病毒分类系统将其分类为IV型病毒(Bachrach,1968)。 目前，小核糖核酸病毒科有超过30个属，超过75个种，研究的最多的是肠病毒属，包括脊髓灰质炎病毒（PV）和柯萨奇病毒（CV）(Zell et al.,xx)。 对PV充分的研究使其成为对研究其他小RNA病毒复制的模型，因此，它也经常被用来指导FMDV的研究。 FMDV的病毒粒子由一条长约8.5kb的RNA基因组和包裹着基因组的二十面体衣壳组成(Grubman andBaxt,xx)。 与肠病毒不同，FMDV表面没有与受体结合有关的凹陷，而是通过其衣壳表面的环状结构来实现该功能(Belnap etal.,2000;武汉大学博士学位论文2Hogle etal.,1985;Logan etal.,1993)。 这种环状结构比其他小RNA病毒更为明显，它被称为GH环，是FMDV结构蛋白VP1的一部分，通过其保守的RGD基序参与病毒的吸附过程(Burman etal.,xx)。 FMDV的基因组结构如图1-1所示，含有5非翻译区（5UTR）、3非翻译区（3UTR）和一条单一的开放阅读框（ORF），其基因组的5末端还连接着一段氨基酸序列（VPg），VPg共价连接在病毒的RNA上，在RNA的翻译过程中起到了重要的作用(Paul andWimmer,xx)。 FMDV基因组的5UTR长约1300nt，含有几种不同特征的结构，包括S片段（S），假节结构（PKs），cAMP反应元件（cre），核糖体进入位点（IRES）以及胞嘧啶残基（polyC）。 5UTR的下游是长约7000nt的ORF，它会翻译产生一个单独的多聚蛋白，并被进一步的加工形成一系列的中间体和14种成熟病毒蛋白。 L pro是最先被编码的前导蛋白，这是一种在其他小RNA病毒中都不存在的蛋白，在FMDV的复制中起到了重要的作用(Belsham,xx;Sasaki etal.,xxb)。 随后，FMDV基因组会编码病毒的4个结构蛋白（图中以红色表示的VP 4、VP 2、VP3和VP1），而较短的2A蛋白（图中以紫色表示）将结构蛋白和其下游的非结构蛋白（图中以蓝色表示的2B、2C、3A、3B1- 3、3C pro和3D pol）分开。 不同于PV和其他小RNA病毒，FMDV的基因组编码3个不同的3B蛋白拷贝(Boros etal.,xx;Reuter etal.,xx)。 FMDV基因组的下游是一段长约90nt的3UTR和一段poly（A）尾巴，其3UTR比5UTR短而且包含较少的结构，仅仅只含有两个预测的茎环结构（SL1和SL2），这些结构可能与5UTR的IRES和S片段相互作用(Serrano etal.,xx)。 研究表明，3UTR是口蹄疫病毒复制所必需的，因为整个3UTR的缺失会抑制口蹄疫病毒的复制(Saiz etal.,xx)。 还有一些证据表明，PV的3CD蛋白能与5和3末端相互作用，3AB蛋白也在其中发挥着重要作用(Harris etal.,1994)。 图1-1.FMDV的基因组结构示意图(Howes,2018)口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK-21细胞的转录组分析31.1.3口蹄疫病毒的生活周期如图1-2所示，FMDV的生活周期包括吸附、进入、脱壳、翻译、多聚蛋白加工、复制、包装、成熟等八个步骤。 图1-2.FMDV的生活周期(Howes,2018) （1）吸附小核糖核酸病毒利用各种细胞受体附着在细胞表面，FMDV主要使用两种细胞受体整联蛋白和硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate，HS）。 整联蛋白是一组细胞表面受体，由和两种不同的亚基形成异源二聚体发挥作用。 HS是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，因此携带负电(Meneghetti etal.,xx)。 FMDV的野外分离株使用RGD结合的整联蛋白作为受体，而其组织培养适应株则可以利用HS，研究认为这可能是病毒突变的积累导致外衣壳表面正电荷的增加导致的(Baranowski etal.,2000;Berryman etal.,xx;Chamberlain etal.,xx;Jackson etal.,1996;Jackson etal.,xx;Jackson etal.,2000;Neff etal.,1998)。 （2）进入FMDV进入细胞主要通过网格蛋白介导的内吞作用与整联蛋白受体分离，该途径也被证明用于马鼻炎A病毒（ERAV）的进入过程(Berryman etal.,xx;Groppelli etal.,xx)。 病毒与HS受体分离是通过细胞膜穴样内陷介导的内吞作用，因此受体的不同会影响病毒的进入过程(Odonnell etal.,xx)。 （3）脱壳进入细胞后，病毒被转运到早期内吞体完成颗粒解离、基因组脱武汉大学博士学位论文4壳和膜渗透过程。 FMDV的脱壳机制目前还不清楚，与其同属于小RNA病毒科的PV进入细胞后会发生构象变化产生A型或感染性颗粒，导致VP4和VP1的N末端暴露(Belnap etal.,2000)。 但FMDV的受体与肠病毒不同，似乎也没有中间颗粒产生，因此可能有完全不同的脱壳机制。 有研究表明，FMDV可能是在进入内吞体后由于pH降低导致的颗粒解离(Caridi etal.,xx;Odonnell etal.,xx)。 在脱壳后，衣壳蛋白VP4被释放并与细胞膜相互作用形成多聚体孔，这可能使vRNA释放到细胞质中，从而在细胞质内发生翻译和复制过程(Panjwani etal.,xx)。 （4）翻译FMDV基因组翻译时，核糖体亚基直接结合在位于基因组5UTR中的IRES上，利用不依赖帽子结构的机制来完成翻译过程。 包括IRES特异性翻译作用因子（ITAF）在内的许多细胞蛋白在IRES区域形成复合物，共同参与FMDV的翻译过程。 最近有研究表明，G3BP1蛋白能结合到FMDV的IRES区域调控病毒的翻译过程(Galan etal.,xx)。 为了减少与宿主细胞翻译的竞争，FMDV会通过切割真核翻译起始因子eIF4G来关闭宿主依赖帽子结构的翻译过程，帮助自身基因组高效的翻译(Gradi etal.,1998)。 （5）多聚蛋白加工FMDV基因组被翻译成多聚蛋白后通过一系列的蛋白水解过程产生许多中间体，最后产生成熟的病毒蛋白。 FMDV多聚蛋白被其自身的L pro、3C pro和2A蛋白酶切割形成蛋白前体L,、P1-2A、2BC和3ABCD。 随后，这些蛋白前体还会由3C pro完成一系列切割过程产生许多包括VP0和3CD在内的中间体和14个成熟病毒蛋白(Mason etal.,xx)。 （6）复制FMDV的复制会先复制出负链RNA并形成双链RNA形式的中间产物，随后双链RNA解开作为合成正链的模板(Grubman andBaxt,xx)。 包括FMDV在内的许多正链RNA病毒的复制都与细胞膜有关，这些封闭的细胞膜结构被定义为复制细胞器，为病毒复制复合体的形成提供了结构支持(Hsu etal.,xx)。 （7）包装FMDV包装的机制尚不清楚，目前的理论认为病毒基因组中可能含有特定的包装信号，能够在VP0的成熟切割之前触发基因组的包装过程。 在对爱知病毒（AiV）的研究中发现L pro可能在RNA的衣壳化过程中起到重要作用(Sasaki etal.,xxa)。 （8）成熟基因组包装完成后，VP0完成最后的成熟切割，形成成熟蛋白VP2和VP4(Grubman andBaxt,xx)。 1.1.4口蹄疫的危害FMD是一个全球性问题，几乎世界上的每个饲养牲畜的地方都会发生疫情，影响多种家畜和野生动物。 FMD的症状通常类似于其他水泡性疾病，包括水疱口口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK-21细胞的转录组分析5炎病毒和猪水疱病。 受感染的动物舌头、鼻子和脚上会产生病变，通常表现出发烧和跛足的症状(Grubman andBaxt,xx)。 虽然口蹄疫通常具有较低的死亡率，但在幼小动物中，感染可以扩散到心脏并引起心肌炎，特别是该疾病会迅速蔓延导致100的发病率。 FMD的暴发会导致产奶量减少，并存在由于动物体重减轻导致生产力下降的情况，而且，受感染国家的动物和动物制品贸易会被限制，造成巨大的经济损失(Knight-Jones andRushton,xx)。 由于FMDV毒株的多样性和宿主范围的广泛性，FMD的蔓延非常迅速并且难以被控制。 其传播途径十分广泛，包括感染动物与易感动物的直接接触、污染的交通工具的机械传播，处理人员的衣物和气溶胶等等(Alexandersen andDonaldson,xx;Sutmoller etal.,xx)。 FMD最近一次大规模暴发发生在xx年的欧洲，由O型口蹄疫病毒泛亚株引起，暴发后疫情迅速在英国、法国和荷兰蔓延(Knowles etal.,xx)。 尽管实施了多种控制方法，包括捕杀受感染的动物、限制动物运输和贸以及和紧急接种疫苗，这次疫情仍然造成了数十亿英镑的损失(Knight-Jones andRushton,xx;Sutmoller etal.,xx)。 目前FMDV疫苗的制作主要使用在BHK-21细胞中扩增的灭活形式的病毒。 然而，这些疫苗具有一定的局限性首先，这些由全病毒抗原制成的疫苗可能含有大量的非结构蛋白，接种后动物会产生这些非结构蛋白的抗体，因此很难区分动物是已经被感染的还是成功接种疫苗的(Lee etal.,xx)。 其次，这些疫苗的生产需要严格的生物安全设施来扩增大量的病毒，而且一旦接种的动物没有快速产生抗体，它们在接种后仍然很容易被感染，因此在疫情暴发的情况下疫苗的接种效果并不理想(Rodriguez andGay,xx)。 另外，由于大量不同种类的菌株的存在和不同血清型之间免疫交叉保护的缺乏，FMD的暴发仍然很难被控制(Rodriguez andGay,xx)。 因此，我们需要更好地理解病毒感染和复制过程中涉及的机制，以便实现控制措施的改进和疫苗的优化。 1.2口蹄疫病毒的持续性感染1.2.1口蹄疫病毒的持续性感染FMDV会引起持续性感染是在野外观察FMD暴发时发现的，但直到1959年才被Van Bekkum等人提出，他们发现在感染恢复数周后牛的唾液（食管-咽（OP）液）中仍存在感染性病毒颗粒，这种对动物带毒状态的证明为随后大量FMDV持续性感染的研究提供了基础(Van Bekkumetal.,1959)。 这些研究表明，持续性感染会在牛、绵羊和山羊中发生（定义为感染后至少28天后病毒检测仍为阳性的动物），武汉大学博士学位论文6并且可以从这些动物的咽部分离出活病毒(Sutmoller etal.,1968)。 然而，猪是否会发生持续性感染还存在争议，有研究表明猪能在3-4周内清除感染，因此可能不会成为携带者，但也有研究声称已经检测到猪的FMDV持续性感染，他们假设FMDV会感染猪肺泡巨噬细胞，这可能成为FMDV的载体(Baxt andMason,1995;Mezencio etal.,1999;Rigden etal.,2000)。 然而，其他研究者都未能证明FMDV在猪身上发生持续性感染，除了在1997年台湾的2个感染了O型FMDV三周后的猪皮肤样本中，发现了1个经过RT-PCR检测后呈病毒阳性的样品。 但值得注意的是，这头猪与其他受感染的猪（包括接触感染的猪）一起放在一个盒子里，因此检测的阳性信号可能严重污染的环境(Alexandersen andDonaldson,xx;Alexandersen etal.,xx)。 除了家畜，野生动物也会发生FMDV的持续性感染。 有研究表明，非洲水牛可携带病毒长达5年，但包括鹿和黑斑羚在内的其他偶蹄类野生动物则不太会发生持续性感染，因为一旦暴露在病毒中，它们会发生严重的感染(Bastos etal.,2000;Gibbs etal.,1975;Hedger,1972;Hedger andCondy,1985;Hedger etal.,1972)。 动物在急性感染期病毒清除失败可能导致持续性感染的发生，虽然没有明显的症状，但会长期携带病毒(Salt,1993,1998)。 而那些接种或者未接种过疫苗的动物一旦暴露在活病毒中，很容易就会感染病毒并形成持续性感染。 因此持续性感染的存在让FMD的预防和控制变得尤其复杂，而且对于那些禁止贸易的国家和地区，接种FMDV疫苗将是一笔很大的开销(Alexandersen etal.,xx)。 1.2.2口蹄疫持续性感染细胞系包括FMDV在内的许多病毒感染细胞后都会以一些病理性的方式干扰宿主的细胞功能，包括导致细胞形态发生变化、产生细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）或是影响宿主细胞的基因表达(Lyles,2000)。 此外，病毒也可以持续存在于宿主细胞中却不发生明显的病理变化，并与宿主共同进化。 为了探索这种持续性感染形成的机制，我们需要一种病毒能够持续性感染的细胞体外模型。 在口蹄疫病毒的持续性感染细胞系建立之前，已经有一些其他病毒的持续性感染细胞系利用不同的方法成功建立。 1966年，Duc-Nguyen等人发现患有淋巴性白血病的大鼠肾细胞在感染了鼠白血病病毒后能形成持续性感染。 他们在不同代次的细胞中均检测到了病毒抗原，并在第14代培养物的上清液中检测到具有感染性的活病毒(Duc-Nguyen etal.,1966)。 1975年，Kawai等人成功建立了狂犬病毒（RV）持续性感染的BHK细胞，他们发现，这些持续性感染的细胞会产生一些较小的噬斑，而且经过一段时间的传代，这些小噬斑会逐渐取代大噬斑(Kawai et口蹄疫病毒急性感染和持续性感染BHK-21细胞的转录组分析7al.,1975)。 1982年，Ahmed等人建立了呼肠孤病毒持续性感染的L细胞，他们采用的方法是利用野生型和缺陷型的呼肠孤病毒共感染L细胞(Ahmed etal.,1981)。 1985年，De laTorre等人建立了第一个FMDV持续性感染细胞系。 他们使用经过噬斑纯化的C型FMDV感染IBRS-2和BHK-21细胞，发现有少量细胞未发生CPE并存活下来，这些细胞不仅能够传代，而且能持续产生FMDV(De laTorre etal.,1988;de laTorre etal.,1985)。 之后，他们从不同代次的持续性感染细胞系中得到248个单克隆，并从中获得6种表型不同的细胞，这些细胞的形态和增殖速度均有差异，并且表现出对病毒不同程度的抗性。 之后，本实验室试图用类似的方法建立O型FMDV持续性感染细胞系。 为了避免细胞之间的相互作用，我们利用单细胞技术挑选出一些携带病毒的细胞克隆，但没有细胞能在传代后存活下来并形成持续性感染。 在所有的小RNA病毒中，FMDV对酸性环境最为敏感，其140S病毒粒子在进入酸性内体后可能分解成12S五聚体亚基，并释放出病毒RNA，而扩散到酸性内吞体中的溶酶体基质会增加内吞体的pH，抑制人类鼻病毒和FMDV的感染(Carrillo etal.,1984;Curry etal.,1995;Johns etal.,xx;Neubauer etal.,1987)。 有研究表明，溶酶体药物能够通过抑制内吞体的酸化抑制FMDV的感染(Carrillo etal.,1985;Curry etal.,1995;Martn-Acebes etal.,xx)。 氯化铵是一种重要的溶酶体抑制剂，能够抑制内吞体和溶酶体pH的降低，并阻断病毒早期的感染过程(Dabydeen andMeneses,xx;Dermody etal.,1993;Liebl etal.,xx;Wetzel etal.,1997)。 Canning和Fields通过实验证明氯化铵可以降低感染后呼肠孤病毒的子代病毒产量，并有助于在小鼠L细胞中快速建立持续感染，这给我们建立持续性感染提供了很好的思路(Canning andFields,1983)。 因此，我们用O型FMDV感染氯化铵处理过的BHK-21细胞，发现通过20mM浓度处理的细胞能够快速建立O型FMDV持续性感染细胞系（BHK-Op）。 这株细胞系的建立是借助氯化铵抑制内体溶酶体系统的酸化，从而在细胞水平上增强对病毒感染的抗性(Huang etal.,xx)。 此外，我们还发现持续性感染细胞与急性感染细胞存在很大的差异，例如增加的病毒毒力、传代晚期稳定的复制效率、未受损的内化能力和非结构蛋白的氨基酸替代。 在之后的研究中，我们利用单细胞分选技术和荧光定量PCR技术分析了BHK-Op单个细胞的病毒含量，发现并非所有的细胞都呈现病毒阳性，而病毒阳性的细胞也存在不同的病毒拷贝数(Xin etal.,2018)。 为了更进一步的研究这些细胞，利用梯度稀释法，我们分离出持续性感染细胞系病毒阴性细胞株（BHK-VEC）并发现，BHK-VEC具有抵抗野生型FMDV的能力，而持续性感染病毒（FMDV-Op）感染BHK-VEC后能使其重新形成持续性感染，这为持续性感染的研究提供了很武汉大学博士学位论文8好的模型(Han etal.,2018)。 1.2.3口蹄疫病毒持续性感染的特点持续性感染病毒能较长时间存在于宿主体内而不表现出病理状态，在表型和基因组上都与急性感染有很大的差别。 持续性感染病毒对环境的耐受性发生改变，包括对高温的耐受性降低，对pH及紫外线的敏感性也发生变化。 另外，持续性感染病毒噬斑的特性也发生了变化，具体表现为噬斑在持续性感染的过程中逐渐变小，而病毒的毒力也发生了变化(Escarms etal.,1992;Straver etal.,1970)。 有研究表明，在传代期间，持续性感染病毒对BHK-21细胞的毒力逐渐增强，而对小鼠和牛的毒力则是逐渐减弱的(De laTorre etal.,1988;Diez etal.,1990b;Huang etal.,xx)。 通过病毒中和实验和ELASA检测，Mohan等人发现牛在发生持续性感染后，食管咽液（OPF）和口鼻液（ONF）的中和抗体滴度和FMDV特异性IgA应答都显著提高，而且ONF的特异性应答比OPF更高且更稳定(Mohan etal.,xx)。 因此，我们可以尝试通过粘膜抗体反应来检测并区分牛是否发生持续性感染。 除此之外，也有很多研究表明持续性感染病毒的基因组也发生了一些变化。 在对经过100次传代的BHK-21持续性感染病毒R100进行分析时，Escarmis等人发现，持续性感染