【精品】MTT实验心得2.doc

【精品】MTT实验心得2 MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。 MTT的原理活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。 由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。 1、培养好细胞点板。 养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。 如果知道了细胞的名字，就可以上.at检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。 当然可以根据自己实验要求进行修改。 由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。 这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入 180、 100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48h能基本长满板底，假设50微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。 这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。 注意不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。 建议细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。 点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。 2、点板布局。 其实这一点很多人不懈一顾。 如果你的细胞要养48h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。 因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。 3、加MTT。 如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。 4、加入MTT后的反应。 时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。 为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。 提醒如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。 关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。 至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我不多说，如果有人不明白我再证明给他看。 当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。 5、检测MTT。 还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470nm左右或630nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。 6、吸收值分析。 在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。 这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。 7、如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。 请问在做MTT实验室是否遇到过下面的情况调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，并不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺大的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的大，如果把调零孔的值减掉之后，OD值为负值。 另外加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红。 对照组测出的OD值在0.40.5之间。 接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm。 我做了很多次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象。 我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的结果三个浓度下的OD值两次的都比较吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右。 不知是什么原因，请分析。 另外，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那么高吧，而且你复孔之间的差值一般是多少？不好意思，你说的现象我没出现过。 还得注意几点 1、MTT应该新鲜配制，在4度保存最多不能超过2周，也有说10天的，反正不能太久。 2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不能用的，应该加入无菌PBS。 3、如果有心，你可以在700nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析。 4、加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净。 问96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法判断板里细胞的死活了.不知道有没有什么办法?丁香网友chinaefulle认为 1、对于贴壁细胞死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好。 2、对于悬浮细胞似乎不好直接判断。 有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，然不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内就可以判断，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不易着色。 如果96-孔板养不好，可以试着用24孔板。 如果是旧板养不好，就试着用新板。 为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3h，但不要太长，否则板就黄了。 还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试。 如果你的细胞不好养，尽量不要用旧板。 问加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色。 我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，结果颜色就不对了，干扰了MTT的检测。 丁香网友chinaefulle认为MTT为淡黄色，用0.1M的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了。 不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，就可能导致MTT越不稳定。 问我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm，和您说的波长所测值会有很大差异吗？丁香网友chinaefulle认为如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性。 570nm的吸收也是挺高的。 波长不同吸光度会有差异，但不影响检测结果的趋势变化。 如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射产生的），那么选用最大吸收波长有利于减少非特异性吸收所导致的误差。 问我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？丁香网友chinaefulle认为单波长也是可以用的。 双波长主要可以扣除非特异性吸收，比如细胞颗粒造成的吸收和板孔背景导致的非均一性吸收。 如果使用96孔板前先检测板孔的背景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标记好不用，单波长也能大体扣除因此造成的非特异吸收。 对于细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对结果判断的方向性不会有太大影响。 下图A是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对于你的酶标仪建议使用470nm。 问MTT用PBS配制,原先培养基中10%FBS会影响结果吗?丁香网友chinaefulle认为不会，因为上清会弃去，每一个孔中都平行有10%FBS，即使有影响，其影响的大小也是可以通过阴性对照扣除掉。 问我一直在想一个问题，为什么网上见的protocol绝大部分都是MTT加1020ul，然后放34h再测？是为了节省试剂？我想在某种程度上时间能更重要些，但为什么不增加MTT的量，减少孵育时间呢？从我的实验来看，增加MTT、降低孵育时间是可行的。 但是现在也存在一个问题，就是即使用到5000/well，现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上。 是否有MTT增加的原因？这个还在进行验证。 希望有我这种实验经历和想法的同行一起讨论。 丁香网友chinaefulle认为你提的这个问题很好，值得探索。 但是目前都是约定加入10%体积的MTT，然后反应3-4h。 我个人猜想可能与以下原因有关（纯属猜测，因为没做过实验） 1、根据我的经验，MTT的溶解度不是太好，所以0.5%的MTT母液（相当于10X）已经可能接近最大溶解极限，而直接用含血清的培养液配制因为带入的成分复杂，MTT保存的稳定性可能存在疑问。 所以使用孵育3-4h的条件。 2、MTT是琥珀酸脱氢酶的人工底物，底物浓度过高可能导致酶抑制，当然，MTT是否有此作用值得实验验证，但大多数酶的底物浓度过高时会产生酶的抑制作用（直接的抑制作用）。 问我的MTT是用PBS配的，5mg/ml，因为每孔的溶液量为100ul，所以我加了10ul。 现在我的调零孔孵育4小时后为黄色，但是加入DMSO之后，还是红色的，490nm下的吸收值为0.2左右。 难道是我买的培养基或是血清有问题，我用的是GIBCO的1640培养基，杭州四季青的血清。 丁香网友chinaefulle认为 1、MTT温孵4h可能会发生自发的氧化还原作用而产生颜色。 因为你是和培养基血清一起孵育的，你的空白孔470nm吸收在0.2左右，因该说是预期值，要减少它，在你的条件下只能靠减少反应时间。 但是要注意你的“有细胞但不加药的孔”吸光度是多少，如果吸光度小，比如低于0.8，那么建议你增加细胞浓度。 2、尽量不要用延长反应时间来增加吸光度，因为MTT会自发转化，尤其是有血清的帮助下（血清中含有NADH、Fe3+等物质，这些物质能促进MTT转化），通过增加细胞数减少反应时间来提高检测孔和空白孔的相对差值是可行的，而通过增加反应时间可能很难凑效。 这一点许多书上没说。 你除去培养基后是否在加入同体积的PBS。 我曾经试过，把培养基吸出，然后加同体积的PBS，再加入MTT，测出的值要比有培养基可孔的值低，当时好像能低0.2左右（490nm）。 丁香网友山百合的做法是去除培养基后，直接加用PBS稀释的MTT（MTT母液也是用PBS配制的）200微升，放置1h再加200微升的DMSO。 丁香网友chinaefulle认为估计采用提高MTT浓度以减少孵育时间的做法可能不可行。 仅供参考，理由如下我们常规加入的MTT是过量的，反应4h后96孔板的溶液仍是黄色，改变较小，这表明MTT加入的量的确是过量的。 过量的底物与酶反应实际上是零级动力学过程，即酶已经被底物饱和。 如果再增加底物浓度实际上也改变不了一定时间内的产物量。 也就是说，底物再增加10倍，要想获得原先的吸光度，以前用3h，现在可能还是要用将近3h。 因此意义较小。 当然，我用的是理论分析，应该以实验为依据。 仅供你参考，如果能明显缩短反应时间那么还是很有意义的。 问我前两天做了两板，孵育四小时候，把液体倒出時发现MTT还原物也被倒出了一些！结果很不好！而且用移液枪吸出的也带有还原物！我该怎么办呢？问题2由于我所作的药溶解度非常低一百多微克每毫升就析出！使等倍稀释很不准！有什么办法解决？我们在Hanks液里加了牛血清白蛋白提高溶解度可行吗？不是说血清会影响结果吗？丁香网友山百合认为 1、注意细胞状态，细胞状态好的时候不会掉；或者倒液前离心； 2、药物可用DMSO溶解成母液，一般为使用浓度的0.1%左右，不过液有文献报道用1%，我看的文献有用1%、0.5%、0.1%的，尽可能要使工作液中DMSO的含量低，以免影响细胞生长状态。 不要加蛋白促溶，一方面是否能起促溶作用不明确，另一方面蛋白可以吸附药物，尤其是小分子药物问大家都是用DMSO吗？怎么看到有的文献是用HCl-isopropanol溶液，然后570nm测定？丁香网友chinaefulle认为DMSO的使用比盐酸-异丙醇方便，至少盐酸-异丙醇溶液你还得配置，而DMSO拿来就可以用