【毕业学位论文】(Word原稿)青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化的研究-应用微生物学

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 建农林大学硕士学位论文 青枯雷尔氏菌 (致病力分化的研究 学 科 门 类：理学 一级学科名称：生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向：应用微生物 研 究 生： 指 导 教 师： 研究员 完 成 时 间：二 O 一 O 年四月 he on of 2010 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与 我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属 于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： i 目 录 中文摘要 . 一章 绪论 . 1 1 关于作物 青枯病 . 1 枯病的发生与危害 . 1 枯病的防治 . 1 2 青枯雷尔氏菌及其致病机理 . 2 枯雷尔氏菌 . 2 枯雷尔氏菌的致病机理 . 2 3 青枯雷尔氏菌种下分化 . 3 4 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 . 4 合成相关基因 . 4 外蛋白及 分泌系统和 分泌系统的相关基因 . 4 络状调节系统相关基因 . 5 5 研究目的及创新性 . 6 第二章 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化 . 7 1 前言 . 7 2 材料与方法 . 7 料 . 7 法 . 7 计 . 8 3 结果与分析 . 8 枯雷尔氏菌的鉴定 . 8 枯雷尔氏菌致病力的测定 . 9 茄植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化 . 11 生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化 . 12 姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化 . 12 4 讨论 . 13 第三章 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化的研究 . 15 1 前言 . 15 2 材料与方法 . 15 料 . 15 法 . 16 计 . 16 3 结果与分析 . 17 防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化 . 17 防菌持续作用下青枯雷尔氏菌 致病力分化 . 18 枯雷尔氏菌 继代培养过程的致病力分化 . 19 4 讨论 . 20 第四章 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 . 22 1 前言 . 22 材料和方法 . 22 料 . 22 法 . 22 计 . 23 3 结果与分析 . 24 枯雷尔氏菌的转化 . 24 枯雷尔氏菌 变株 因的验证 . 24 枯雷尔氏菌 变株的遗传稳定性 . 25 枯雷尔氏菌突变株致病力测定 . 26 枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点 . 28 4 讨论 . 29 第五章 青枯雷尔氏菌无致病力突变株与原始菌株的生物学异质性研究 . 31 1 前言 . 31 2 材料和方法 . 31 料 . 31 法 . 31 计 . 33 3 结果与分析 . 33 始 对无致病力突变株生长的影响 . 33 养温度对无致病力突变株生长的影响 . 34 致病力突变株生长曲线异质性 . 34 致病力突变株胞外多糖含量异质性 . 35 致病力突变株 体培养基分光光度计吸收峰分析 . 36 4 讨论 . 37 第六章 结论与展望 . 39 参考文献 . 41 附录 . 46 个人简历 . 49 致 谢 . 50 I 中文摘要 通过对青枯病不同发病时期不同部位的番茄、花生和生姜植株的青枯雷尔氏菌进行分离，从番茄青枯病发病初期的病株根部和青枯病发病后期的病株茎中部分离到的青枯菌中除了强致病力的菌株外，还分离到少量无致病力的菌株，从生姜病株的茎上分离到的青枯菌 均为 无致病力的菌株。 通过 生防菌 青枯雷尔氏菌 1： 1 共培养试验，表明生防菌 是对不同菌株的抑制率有所差异，生 防菌对 株的抑制率仅为 对 抵制率较高， 对其他菌株的抑制率介于 间。对强致病力青枯雷尔氏菌 续 5 代的继代培养后发现 出现致病力分化，而第五代时 出现致病力分化。生防菌 续处理 3 代后，未出现致病力分化，对 一次处理后即出现无致病力菌株的分化。 通过 座子随机插入青枯雷尔氏菌 （ 获得 1004 株转座子随机插入突变株，经过在 板上的形态特征筛选 ,其中有 13 株突变株具有无致病力青枯雷尔氏菌的形态特征。对其中 5 株无致病力突变株进行反向 序和序列比对，分析鉴定出这些年株青枯雷尔氏菌突变株的插入位点在 因和因上，经番茄盆栽苗致病力检测 ,确定为无致病力菌株。比较了这 5 株突变株与原始菌株的生理生化特性，这 5 株突变株的生长速率和相对胞外多糖含量显著低于 最适 和最适温度未发生变化。 5 株突变株 体培养基上清液在紫外 00长上吸收峰的扫描结果，通过聚类分析发现这 5 株突变 株与原始菌株 别聚为不同的三类，即 第I 类， 因突变株为第 ， 因突变株为第 。 关键字： 青枯雷尔氏菌，致病力，分化， 座子，突变 of in of in of in of of in of of of in It . of no of in it in it to no on of it s at 1004 n5 3 TC of of in by of of pH of 00 of of it be I II 青枯雷尔氏菌 (病力分化的研究 1 第一章 绪论 1 关于作物 青枯病 枯病的发生与危害 细菌性青枯病（ 由其病原菌青枯雷尔氏菌（ 起的一种毁灭性的土传病害，它广泛分部于热带、亚热带和温带地区，在我国南方各省发病严重。由于温室效应，气温升高，其分布范围向更高纬度的地区扩展 1,2,3。青枯雷尔氏菌可以适应不同的环境，使得被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有种子植物和被子植物，有双子叶植物和单子叶植物等，给青枯病的防治带来很大的困难 4。它所危害的宿主植物超过 50 个科，包括番茄、茄子、辣椒、烟草、马铃署、花生等重要农业经济作物 5及桉树、木麻黄、桑树等树木 6，造成较严重的经济缺失。 枯病的防治 青枯病的防治 在国内外均有广泛的报道，主要通过农业措施、化学药剂、先育高抗品种和生物制剂等进行防治，其中生物防治得到最广泛的关注。 由于我国耕地有限，轮作等 7农业措施受到很大的限制。利用化学农药 如：康地蕾得、青萎散、青枯灵、硫酸链霉素等 对青枯病进行防治面临环境污染， 而且存在 青枯雷尔氏菌对化学农药产生抗药性，防效不高等诸 多问题 8,9。而选育作物抗病新品种，虽然已筛选获得部分 抗原材料和 高抗品种 10但是 由于对抗病性能高的抗源材料的获得较难，且由于青枯雷尔氏菌的高度种下分化，使抗病品种无法大面积推广及抗病性能的退化的原因，制约了选育抗病新品种的发展。因此，研究采用无毒，环保的微生物（细菌、真菌和放射线菌）农药防治青枯病越来越受到关注。它们主要是从土壤中分离、从内生菌中筛选及构建基因工程菌等方法获得。朱育菁等（ 2004）研制的 剂对连作重病区的茄子青枯病具有良好的防治效果 ， 同时对茄子植株具有显著促长作 用 16。徐玲等（ 2006）利用从番茄根际分离到的一株多粘类芽孢杆菌防治青枯病，获得很好的效果 17。朱红惠等（ 2004）测定了 菌对青枯菌的抑制作用，结果表明，在接种青枯菌前 4 天接种 菌，可以明显降低青枯菌在番茄根面和木质部的数量 18。潘文道等（ 2008）测定了放线菌 番茄青枯病的防效，结果表明在先接种放线菌 再接种青枯菌，其防治效果达到 19。 对于利用无致病力青枯雷尔氏菌菌株防治青枯病国内外做了大量的研究，并有广泛报道，为防治青枯病提供了新的研究思 路。肖田等 (2008)初步研究了青枯雷尔氏菌无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用，取得较好的控病效果，两株无致病力青枯雷尔氏菌 20 天后的相对防效分别达到 97%20。 无致病力青枯雷尔氏菌可通过物理诱变、自发突变和基因工程等手段获得。 et (1994)， 福建农林大学硕士学位论文 2 杨宇红等 (2008)利用基因工程法获得了无致病力的 21,22， et 1990)、康耀卫等 (1995)利用 入突变法获得青枯雷尔氏菌胞外蛋白分泌缺失的突变株 23,24、罗宽等 (1983)、陈庆河等 (2003)利用 射和紫外光诱变 25,26、王羽等（ 2004）利用分离自发突变株 27等方法获得了许多无致病力青枯突变株。关于无致病力青枯雷尔氏菌在防治青枯病方面的机理研究主要集中在无致病力诱导宿主植物产生抗性和无致病力青枯雷尔氏菌所产细菌素的抑菌作用两方面。何礼远等 (1990)研究了通过无致病力青枯雷尔氏菌诱导花生植株产生抗病性，结果表明经花生茎部毛细管滴注接种 ,可诱导花生茎部产生抗病性 ,并可维持 10天以上 ,且具有一定传导性，而花生种子接种无致病力青枯雷尔氏菌菌株后不能诱导花生地上部分的抗病性 ,但可以有效地防止土壤中青枯菌对花生根部的浸染 ,种植42 天后的青枯病防治效果仍可达到 28；董春等 (1999)利用产细菌素的无致病力青枯雷尔氏菌株防治番茄青枯病，并认为细菌素的抑菌作用和无致病力菌株诱导宿主产生抗性这两方面都对防治青枯病上起作用 29。张赛群等（ 2008）研究表明在接种无致病力青枯雷尔氏菌以后，植物抗病反应中的关键物质（ 酶类（ 有显著上升，而分解 性处于被抑制状态，并推测接种后抗病蛋白产量也相应增加 30。 2 青枯雷尔 氏菌及其致病机理 枯雷尔氏菌 青枯雷尔氏菌的菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，具有极生鞭毛，有运动性，不形成荚膜和芽孢，菌体 大小为 落在 养基上有两种形态特征：一种为菌落流动性强，白边较宽，中心呈浅红色，这是强致病性的野生型菌株；另一种为菌落干燥，扁平，白边很窄，中心呈暗红色，这是致病性弱或丧失致病性的变异型菌株 3。 枯雷尔氏菌的致病机理 目前世界上对青枯雷尔氏菌的致病机理已进行了广泛的研究，青枯雷尔氏菌经过植物根部的受损部位和根冠部位侵染植 物，随后由维管组织扩散进入茎部31。青枯雷尔氏菌的致病性是多方面的且复杂的现象。青枯雷尔氏菌的产生多种致病因子包括胞外多糖（ ），多聚半乳糖醛酸酶 32和内切葡聚糖酶 33等植物细胞壁降解酶类及生长素、细胞分裂素和乙烯 34等植物激素。对其致病机理的研究主要集中在它的胞外多糖，果胶酶和纤维素酶上。 1958）首次报道了青枯雷尔氏菌发酵液离心后的上清液能够使番茄枝条萎蔫，而缺乏 35。因此认为植物体内的青枯雷尔氏菌分泌的胞外多 糖，堵塞导管，阻碍植物的水分运输，从而表现出萎蔫的症状。另外 ， 而使寄主植物的免疫系统无法识别和攻击青枯雷尔氏菌 36遗传学研究也已证明 是青枯雷尔氏菌关键的致病因子 40。 青枯雷尔氏菌 (病力分化的研究 3 3 青枯雷尔氏菌种下分化 青枯雷尔氏菌是一个非常复杂的类群，呈现出高度的种下分化的多态性。 41根据青枯雷尔氏菌对不同寄主致病性的表现进行划分为称为生理小种（ 至 60 年代，已命名了 4 个生理小种（见表 1）。何礼远等 42将不同于国 外报道的部分桑青枯雷尔氏菌菌株命名为 5 号生理小种。 表 1 青枯雷尔氏菌生理小种（卢同， 1998） 43 . 1998） 小种 侵染作物 烟草过敏反应 小种 1 烟草及多种茄科植物 产生坏死枯斑 产生大量黑色素 小种 2 只侵染香蕉与海里康 产生过敏反应 不产生黑色素 小种 3 能侵染马铃薯和番茄 产生黄化斑 产生少量黑色素 小种 4 能侵染马铃薯和茄子 产生过敏反应 对酪氨酸酶活性中等 1964）根据青枯雷尔氏菌对 3 种双糖（乳糖、麦芽糖和纤维二糖）和 3 种醇（甘露醇、甜醇和山梨醇）的氧化能力，将青枯雷尔氏菌分为 4 个生化型 (生化型 I、 4。我国的何礼远（ 1983）认为部分桑青枯菌不属于上述 4 种生化型，应属于新的生化型 V45（见表 2）。生理小种和生化型之间没有绝对的相关性，但是研究表明 3 号生理小种均属于生化型 表 2 青枯雷尔氏菌生化型鉴定（根据 1964 和何礼远， 1983） . 1964 1983） 生化型 乳糖 麦芽糖 纤维二糖 甘露醇 甜醇 山梨醇 生化型 I - - - - - - 生化型 + + - - - 生化型 + + + + + 生化型 - - + + + 生化型 V + + + + - - 除了上述两种青枯雷尔氏菌的种下分化的分类方法以外，还有血清型、溶原型、致病型和菌系等方法对青枯雷尔氏菌致病力分化进行研究 43。其中青枯雷尔氏菌的致病型和菌系的分化是根 据青枯雷尔氏菌对鉴别品种的反应性进行划分的。姚革等（ 1990）分析了四川省青枯雷尔氏菌的菌系及其分布后，发现在青枯雷尔氏菌生理小种 I 型中存在着互不侵染的现象 46。帅正彬等（ 1997）对成都地区番茄青枯雷尔氏菌的生理小种进行分析后发现，同属一个生理小种的青枯雷尔氏菌接种番茄品种的结果表现出不同的致病力，研究结果表明在同一生理小种中的菌株，存在不同致病力分化 47。 另外，前人的研究表明，青枯雷尔氏菌存在着不同致病力的分化即强致病力菌株和无致病力菌株，前者侵入寄主植物，可导致寄主的发病；后者可以侵染寄 福建农林大学硕士学位论文 4 主植 物，但不引起寄主发病 48。有研究表明，在特定条件下，强致病力菌株，会散失致病性，弱化形成无致病力菌株； et 2003)营养条件和极端气候引起的病原菌基因突变等原因可使强致病力菌株产生弱化 49；但在自然条件下，青枯雷尔氏菌的强致病力菌株具有保持致病性相对稳定的机制，抵抗外界条件，侵染寄主植物，引起植物病害 50。 4 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 青枯雷尔氏菌致病过程中的某些基因的突变，都会影响到青枯雷尔氏菌对寄主植物的侵染和致病力。其中包括调控和编码 的基因，编码胞外蛋白的基因及 分泌系统和 分泌系统的相关基因，以及形成网络状结构的调节系统等。 合成相关基因 是青枯雷尔氏菌的主要致病因子。 生物合成途径的大部分蛋白质是由大小为 16 纵子调控和编码的。该操纵子由 12 个以上的基因构成，它的转录由一个启动子控制，且需要有 10 个调节基因的产物和 3 种以上的信号相互作用才能被完全的激活， 纵子上的任何一个基因的突变都会阻碍 的产生 51,52。 道了青枯雷尔氏菌缺乏 的自 发突变株的发酵液离心后的上清液不能使番茄枝条萎蔫 35。 外蛋白及 分泌系统和 分泌系统的相关基因 青枯雷尔氏菌的胞外蛋白主要有 10 种，且都能较容易地从发酵液的上清液中检测出来 53。其中包括果胶溶解酶类和纤维素水解酶类等。果胶溶解酶类由果胶甲基脂酶和三种多聚半乳糖醛酸酶构成，三种多聚半乳糖醛酸由 因分别编码，研究表明 缺失突变株仅少量的降低青枯雷尔氏菌致病力，而 因的突变株的可使青枯病发病时间比野生型菌株推迟 1 倍 47,54。青枯雷尔氏 菌能够产生 2 种胞外葡聚糖酶， 够水解可溶性的纤维素， 55,56,失突变的青枯雷尔氏菌使寄主植物发病的时间也有所延迟。 与其他许多病原菌一样，青枯雷尔氏菌也存在 2 种分泌系统。由 因编码的 分泌系统，能够分泌包括细胞壁裂解在内的大部分的重要胞外蛋白 57,58。由 诱导宿主细胞产生各种生理效应，如超敏反应等 59研究表明， 可能横跨了细胞膜的内膜和外膜，并将各种各样 的致病因子及非致病性的蛋白运输到细胞外，抑制植物的免疫反应 63。 因簇包含了 20 多个基因 ,可能位于病原性基因岛内，其中任何一个基因的失活，似乎都会使青枯雷尔氏菌完全失去对寄主植物的致病力和在植物体内增殖的能力，以及在抗性品种植物体中引起过敏反应的能力64,65。 青枯雷尔氏菌 (病力分化的研究 5 络状调节系统相关基因 前人研究发现由于青枯雷尔氏菌适应植物体外的生存环境，它需要一个精细的调节网络来控制 其他致病因子（植物细胞壁降解酶类）等的表达 51。因此青枯雷尔氏菌对 分子调控是严格且复杂的过程。根 据 66对分子调控机制的综述，整个调控网络至少包括了 3 个明显的信号传导机制 ,每个传导机制都具有独一无二的双组分系统即 个系统包含一个与膜结合的传感器激酶和一个特异感应调控因子。传感器激酶 过对其相应的特异感应调节因子 酸化从而对某一环境信号作出响应，进而激活或抑制致病基因的表达。 因最大量的转录需要激活整个网络的所有组分。 图 1 青枯雷尔氏菌控制 其他基因表达的调控网络（ 1998） of . 其中，青枯雷尔氏菌的表现型转换系统基因（ 调节青枯雷尔氏菌致病力的复杂网络结构的核心