【毕业学位论文】(Word原稿)青枯雷尔氏菌生理生化特性及胞外蛋白多态性研究-微生物分子生物学

中文摘要 I 学校编号 图书分类号 学 号 密 级 全日制学术学位研究生硕士学位论文 青枯雷尔氏菌生理生 化特性及胞外蛋白多态性研究 of *（作者姓名） 学 科 专 业： 研 究 方 向： 指 导 教 师： 申请学位级别： 论文提交 日期 ： 2014 年 月 日 论 文 评 阅 人 ： 论文答辩日期 ： 2014 年 月 日 答辩委员会主席： 学位授予单位 ： 福建师范大学 学位授予日期 ： 2014 年 月 日 文摘要 本研究以不同致病性及诱变后的青枯雷尔氏菌菌株为供试菌株，采用发酵培养法，研究了青枯雷尔氏菌的培养特性、保存特性 等生理生化特性 以及其胞外毒素蛋白生物活性的影响因素。采用 胶电泳并运用 件分析了青枯雷 尔氏菌胞外蛋白的多态性，为从蛋白质的角度进一步研究作物青枯病疫苗、开发新型无污染、高效率的生态农药奠定理论基础。不同致病性青枯雷尔氏菌培养过程中 随培养时间先上升后下降， 在整个发酵周期中呈下降趋势，及菌体浓度先上升在稳定而后下降，反应了不同致病性青枯雷尔氏菌培养特性的多态性。无致病性青枯雷尔氏菌 为植物疫苗工程菌，在盐浓度为 2% 8 时能保存较长时间，致病性及其生物仿效果保持相对恒定。青枯雷尔氏菌菌毒素蛋白具有一定的生物活性，可使番茄幼苗发病，对高温和紫外线较 为敏感，接种方式对其生物活性的发挥也有一定影响。青枯雷尔氏菌胞外蛋白种类和含量呈现较高多态性，主要集中在 变和 入诱变菌株胞外蛋白具有明显的多态性。强致病性青枯雷尔氏菌胞外蛋白含量较弱致病性高，其中强致病性青枯雷尔氏菌胞外蛋白含量较多者主要分布在 下，而弱致病性则主要分布在 上。根据青枯雷尔氏菌胞外蛋白条带相似性构建的系统树也反应出不同致病性青枯雷尔氏菌菌株之间的相关性，进而反应出其胞外蛋白的多态性特征。本研究以不同致病性青枯雷尔氏菌为出发 点，着手胞外蛋白多态性研究，为从功能蛋白的角度防治青枯病提供新的思路和方法。 关键词： 青枯雷尔氏菌， 生化 特性，胞外蛋白，生物活性，多态性 he of of it of of on of D of pH on in of of on pH on it a in a of 2% pH 68). a to a on on a in 0Co n5 on 44to of we to of in of 文文摘 V 中文文摘 青枯病是由青枯雷尔氏菌（ 起的一种 在 世界 范围内广泛传播的 土传细菌性病害， 1880年首次发现于美国北卡罗来纳州格兰维尔。该病原有着广泛的寄主范围及地理分布，广泛分布于热带、亚热带及温带地区， 可 通过土壤进行传播， 给作物生产带来巨大经济损失 。 为了防止青枯病的发生，降低损失，大多采取轮作方式，然而由于收到其生产周期的限制，此法越来越不适应现代农业发展的需要。 化学药物防治虽然在短期内效果显著，但由于其长期使用能使作物产生抗药性及环境污染严重的弊端，不能作为青枯病防治的主要手段。 青枯雷尔氏菌菌系复杂，寄主广泛，除危害番茄外，还可侵染包括烟草、花生、香蕉等在内的 50多个科、 400多种植物， 因此急需探究一种新的安全高效 且对环境友好的方法进行生物防治。 本研究主要以福建省农科院农业生物资源所微生物研究中心 保存 的 不同致病性青枯雷尔氏菌 及经过 60诱变后的青枯雷尔氏菌菌株 为研究对象 ，通过 发酵培养， 探明 青枯雷尔氏菌的培养 多态性特征 、保存特性及其生物活性 物质的 影响因素；采用 胶电泳 分析了青枯雷尔氏菌胞外蛋白的多态性 并 运用 件 构建系统树， 为从蛋白质的角度进一步研究作物青枯病 疫苗 、开发新型无污染、高效率的生态农药奠定理论基础。主要研究 内容及 结论如下： 1、 对 本实验保存的强致病性青枯雷尔氏菌 菌株 弱 强致病性青枯雷尔氏菌 菌株 行发酵培养， 跟踪记录其生长繁殖过程中 、 及菌体数变化，结果表明：强致病性青枯雷尔氏菌菌株 长周期可分为四个阶段，分别为适应期（ 08 h）、对数期（ 16 h）、稳定期（ 32h）和消亡期（ 96120 h）；弱致病性青枯雷尔氏菌菌株 发酵液中的生长周期与强致病性菌株呈现类似周期。菌体数与 呈正相关，且差异极显著；菌体数与 呈负相关，差异不显著； 与 呈负相关，差异极显著。 青枯雷尔氏菌强致病性菌株 致病性菌株 发酵培养过程中，随着时间的推移， 略有降低，但总体变化不大；发酵液 变化随培养时间变化呈指数型变化。 2、 研究 植物疫苗菌株 保存 特性 ， 分析盐浓 度和 植物疫苗制剂保存特性的影响及保存过程菌株致病性的动态变化， 有助于拓展其适用的广度和深度，为 寻找植物疫苗制剂的最佳保存条件提供依据。 当氯化钠浓度在 2% 8 时，发酵液中菌体数相对稳定，其他条件下菌体数变化不稳定。以上时，菌株无法生长，可能是细胞外渗透压过高致使细胞失水死亡。此外，植物疫苗菌株 强酸（ 小于 4）或强碱（ 于 10）条件下不能增长 。因此，可将盐浓度 2% 3%， 6为 植物疫苗菌株 悬剂保存 的参考条件。 、 本研究对 强致病性 番茄青枯病原菌 外活性物质即毒素蛋白 进行提取 ，并研究温度 和紫外线 对其致病性的影响 ，采用病情指数显示其在不同条件下的生物活性， 结果表明： 提取的毒素物质具有一定生物活性， 采取剪叶法处理 可使番茄幼苗发病，毒素 蛋白 的生物活性对 高温 和紫外线都 较为 敏感 。 当 其 置 于 20 、50 、 80 和 100 水浴中 0.5 h 时之后，细菌毒素的生物活性降低，与对照相比，其对番茄青枯病病情指数分别减少了 100%。当 温度达到 100 时，其生物活性完全丧失 。毒素蛋白在 超过 0.5 h 的紫外照射时，其 生物活性 几乎 丧失 ，且 各紫外处理组番茄幼苗病情指数在 5%显著水平和 1%极显著水平上均无 显著 差异。 4、 不同致病性青枯雷尔氏菌胞外蛋白 的种类和含量各不相同， 运用 其进行凝胶电泳并作相关分析 。结果表明： 强、弱致病性青枯雷尔氏菌分泌的胞外蛋白具有不同多态性差异， 大概含有 10 种胞外蛋白，主分子量要集中在2097 钴 变和 入均可影响青枯雷尔氏菌胞外蛋白分泌。强致病性青枯雷尔氏菌胞外蛋白含量较弱致病性高， 诱变后的菌株胞外蛋白较原始菌株种类变化不 明显，但含量差异显著，总体浓度较低。 本研究为从蛋白的角度阐明其致病机理及开发蛋白类新型生物农药提供 了 理论基础。 5、 本研究 运用 外 蛋白进行分析并根据其电泳条带相似度构建系统树。 结果表明 ： 青枯雷尔氏菌胞外蛋白种类和含量呈现较高多态性，强致病性菌株胞外蛋白分泌较多， 分子量大小 主要在 弱致病性青枯雷尔氏菌胞外蛋白分泌主要在 外， 根据各条带相似性构建的系统树 可以看 出不同致病性青枯雷尔氏菌菌株之间的相关性 ， 反应了不同致病性青枯 雷尔氏菌的生理生化特性及其胞外蛋白的多态性。 目录 录 中文摘要 . . 文文摘 . V 目录 . 一章 绪论 . 11 1、作物青枯病及其病原菌的致病机理 . 11 枯病的发生与危害 . 11 物青枯病的发生特点及流行规律 . 11 枯雷尔氏菌致病机理 . 11 枯雷尔氏菌致病性与质粒的关系 . 12 2、青枯雷尔氏菌的多态性 . 12 枯雷尔氏菌在植株体内分布及侵染多态性 . 12 物免疫系统多态性 . 13 3、青枯雷尔氏菌胞外蛋白的研究及其应用前景 . 15 4、本研究的目的及意义 . 15 第二章 青枯雷尔氏菌培养特性多态性 . 17 1、试验材料 . 17 2、试验方法 . 17 悬液 的制备 . 17 养过程中强弱致病性菌株菌体数的测定 . 17 养过程中强弱致病性菌株发酵液 的变化 . 18 养过程中强弱致病性菌株发酵液 的变化 . 18 据处理 . 18 3、结果与分析 . 18 枯雷尔氏菌强、弱致病性 菌株发酵参数分析 . 18 枯雷尔氏菌强、弱致病性菌株培养过程中菌体数变化 . 21 枯雷尔氏菌强、弱致病性菌株培养过程中 变化 . 22 4、讨论 . 23 第三章 青枯病植物疫苗胶悬剂保存特性研究 . 25 、试验材料 . 25 2、试验方法 . 25 物疫苗菌株 发酵及胶悬剂制备 . 25 浓度对植物疫苗菌株 悬剂保存特性的影响 . 25 2.3 对植物疫苗菌株 悬剂保存特性的影响 . 26 存对植物疫苗菌株 株致病性及对番茄青枯病防效的变化 . 26 据分析 . 26 3、结果与分析 . 26 浓度对植物疫苗菌株 悬剂保存特性的影响 . 26 3.2 对植物疫苗菌株 悬剂保存特性的影响 . 27 物疫苗菌株 悬剂保存过程相关参数分析 . 28 物疫苗胶悬剂保存过程菌株 病性及对番茄青枯病防效的变化 28 4、讨论 . 29 第四章 青枯雷尔氏菌细菌毒素蛋白生物活性的影响因子分析 . 31 1、试验材料 . 31 2、试验方法 . 31 茄青枯雷尔氏菌毒素的生物活性测定 . 32 3、结果与分析 . 32 种方式对青枯雷尔氏菌细菌毒素生物活性的 影响 . 32 种浓度对青枯雷尔氏菌细菌毒素生物活性的影响 . 33 度对青枯雷尔氏菌细菌毒素的影响 . 34 外线对青枯雷尔氏菌细菌毒素的影响 . 35 4、讨论 . 36 第五章 青枯雷尔氏菌胞外蛋白多态性分析 . 39 1、试验材料 . 39 2、试验方法 . 41 枯雷尔氏菌发酵培养 . 41 枯雷尔氏菌胞外蛋白电泳 . 41 枯雷尔氏菌胞外蛋白含差异性 . 42 枯雷尔氏菌胞外蛋白含量检测 . 42 、结果与分析 . 43 枯雷尔氏菌胞外蛋白电泳图谱 . 43 枯雷尔氏菌胞外蛋白含量检测 . 45 4、讨论 . 46 第六章 青枯雷尔氏菌胞外蛋白组分分析 . 47 1、试验材料 . 47 2、试验方法 . 47 枯雷尔氏菌发酵培养及胞外蛋白凝胶电泳 . 47 用 件对凝胶电泳图片进行分析 . 48 建系统树 . 48 3、结果与分析 . 48 枯雷尔氏菌胞外蛋白凝胶电泳图片背景消除 . 48 同电泳条带强度分析 . 49 统树 . 52 4、讨论 . 54 第七章 结论与展望 . 55 1、结论 . 55 2、展望 . 56 参考文献 . 57 第二绪论 11 第一章 绪论 1、作物青枯病及其 病原菌的致病机理 枯病的发生与危害 青枯病是由青枯雷尔氏菌（ 起的一种世界性的土传细菌性病害 1， 1880 年首次发现于美国北卡罗来纳州格兰维尔。该病原有着广泛的寄主范围及地理分布，广泛分布于热带、亚热带及温带地区，给作物生产带来巨大经济损失，对我国南方各省市茄科作物造成的危害尤为严重。 系复杂，寄主广泛，除危害番茄外，还可侵染包括烟草、花生、香蕉等在内的 50 多个科、400 多种植物 2其中马铃薯、番茄、烟草等茄科作物受害最为严重 5。 物青枯病的发生特点及流行规律 青枯病是茄科作物上重要的细菌病害，其发生流行因素较为复杂，在 我国河南、山东、江苏、云南、广西、湖南、广东、福建等省普遍发生，华南地区尤为严重。青枯雷尔氏菌的发生因素十分复杂，与气候、土壤、栽培和生物等因素有关，各因素之间存在着相互作用，一个原来为青枯雷尔氏菌发生的主导因素，因其他因素的影响可以转化为次要因素。发生因素的多态性，使得青枯雷尔氏菌表现出发生危害不确定性。 近年来，在一些些茄科作物主产地区，青枯病不断扩展蔓延危害尤为严重，一般发病率在 20%40 %。青枯病的病菌主要随残株在土壤中过冬，能存活数年，高温（ 30 C）、高湿（ 90%）、多雨是诱使青枯病发生和 流行的主要因素，尤其是雨后转晴，太阳暴晒，土温升高，气温达 3037 ，最有利于青枯病流行。发病后，在苗的胚轴和茎中部的青枯雷尔氏菌含菌量高达 1091010 g6染病植株比健株稍矮，叶色较淡，在高温晴朗的白天病株嫩茎和叶片自上而下萎垂，夜间尚可恢复，经 34 天或更短时间全株茎叶萎蔫枯死，但病株在短期内仍保持青绿颜色，叶片也不脱落。横切病株茎部可见维管束变褐，用手挤压有污白色菌脓从切口处溢出，这是体内寄生的病原细菌溢脓。田间可以用这种方法快速诊断青枯病。青枯病是一种较难防治的病害，目前宜 采取选用抗病品种，加强栽培控病措施为主，适当结合施药的综合防治措施。当然，各国科学家也正在努力研制新型高效的植物疫苗，以期减少或彻底解决作物青枯病的危害。 枯雷尔氏菌致病机理 青枯菌的致病机制十分复杂，主要的致病因子是胞外多糖（ 细胞壁分解酶（主要是果胶质酶和纤维素酶）、 型 泌系统产物，其中胞外多糖的作用尤为突出，在保护细菌、促进细菌的移动与定殖及堵塞和破坏寄主导管等方面起着重要作用 10为此，日本科学工作者研究了这种胞外多糖的组成以及它与致病性的关系，第一章 绪论 12 发现这种多糖是一种 混合物一主要由 N 22和少量鼠李糖、葡萄糖以及某些简单肤所组成，尽管其化学性质还不清楚，但认为这种胞外多糖与毒力有关系 ( 等 )，这是因为它阻滞寄主植物维管束组织，导致水分输导的困难。而上述致病因子的协调作用由 3统控制， 3 羟基棕榈酸甲基酯信号水平随细菌密度变化而变化，以 节基因的启动和转录为核心，自动而精密地调节青枯菌中有关致病基因的表达和关闭，并由此控制细菌的生长状态 13。然而，另一些科学工作者则认为青枯雷尔 氏菌的致病基因在质体上，且在培养过程中致病性（如番茄青枯菌）容易丧失 14再加上其数量有限，因此给分离研究工作带来了极大的困难。青枯菌还可分泌多种细胞壁降解酶（如纤维素酶类和果胶酶类），可能在病菌侵入植物体内时起作用 17。 枯雷尔氏菌致病性与质粒的关系 中国农业科学院分子生物研究室除了从寄主青枯菌获得大质体外（ 60120106d），还获得小质体（ 60120105d） (谢道听等 )。他们检测了中国的 14 种寄主植物的 51 个野生型青枯菌内生质体，并对其中 20 个野生型（毒力 株）和20 个突变型（非毒力株）进行了比较研究，发现其中 14 株野生型和 10 株突变型菌株均含分子量大小相同的有 12 个质粒；其中有些菌株（野生型或突变型）不存在质粒；有些野生型毒力株不含质粒，而其衍生突变型无毒力株则出现质粒。前两种情况表明，致病性与质粒没有必然联系，而最后一种情况，致病性的丧失伴随着大质粒的出现，看来，质粒的形成与致病性无关系，这种现象不排除致病基因是从染色体上跃跳的结果。 2、 青枯雷尔氏菌 的 多态性 枯雷尔氏菌在植株体内分布及侵染多态性 枯雷尔氏菌在番茄植株体内的分布 特 性 青枯雷尔氏菌存在于番茄病株不同部位的组织中，在其根、茎、叶各组织中均能检测到青枯雷尔氏菌的存在，说明其分布的广泛性。而不同组织结构中，其分布含量也略有差别，对于番茄病株来说，一般茎顶部含菌量最多，向下沿根部方向逐渐降低。 青枯雷尔氏菌从番茄根部浸入番茄植株，而后在根部组织繁殖，进而沿着植株的维管束逐渐向茎部、叶部蔓延扩散，最终致使全株 萎蔫。不同部位侵染的青枯雷尔氏菌致病力有强弱之分，直接关系到番茄植株病害发展的进程。 研究结果表明，当番茄组织内的含菌量达到 106g 以上时，番茄苗 就会出现全株萎蔫症状 18 。番茄青枯雷尔氏菌在植株体内的分布并非越靠近侵染点越高，在病株中分离结果表明，越靠近顶部组织其含菌量越高，这种分布的多态性为番茄青枯雷尔氏菌侵染后植株顶部优先 萎蔫提供了依据。在不同品种的番茄植株体内，请枯雷尔氏的侵染效率有所不同，由此反应了青枯雷尔氏菌在番茄体内分布的多态性 19 枯雷尔氏菌在烟草植株体内的分布 特性 绪论 13 青枯雷尔氏菌感染烟草后，致使烟草植株出现类似番茄的整株萎蔫症状，严重影响了烟草产量。而带病菌的烟田土壤极易引发感染，因此成为烟草青枯病发生的 主要因素 21。有关青枯雷尔氏菌在烟草植株体内的分布研究尚未见报道，但其在不同组织内的分布呈现明显差异，其含菌量相差较大且多为致病性较强的病菌。侵染后的烟草植株，在茎中部组织的含菌量类似于番茄青枯病侵染特性，均高于茎基部和顶部组织。 青枯雷尔氏菌在烟草植株体内的分布具有较高的多态性。烟草的品种以及青枯雷尔氏菌致病性的强弱直接关系到烟草青枯病的发生程度。青枯雷尔氏菌对烟草的致病性产生不同分化 22同样，不同烟草品种对青枯雷尔氏菌也存在这抗病性的差异25 。研究青枯雷尔氏菌在烟草植株体内的分布， 是研究烟草抗病性的必要前提，目前简单易行的是通过田间适时取样来研究青枯雷尔氏菌在烟草病株体内不同部位不同组织内的分布情况及其致病性情况。 枯雷尔氏菌在茄子植株体内的分布 特性 茄子植株被青枯病病原菌感染后，按发病进程的不同，一般可将病株分为发病初期、中期和末期三大类。初期叶片出现绿色斑点，中期部分叶片开始出现萎蔫，末期，则全株萎蔫，直至死亡。不同品种的茄子对青枯病抗性也同样存在的明显差异 26。 健康植株和病株以及病株的不同组织部位、不同发病时期体内青枯雷尔氏菌的含菌量分布有很大差异，体现了茄 子植株体内青枯雷尔氏菌分布的多态性。此外，青枯雷尔氏菌在花生、辣椒、姜等植株体内的分布及侵染也存在着一定的多态性特点 27 物免疫系统多态性 物免疫系统机理 在长期的进化过程中，植物也像动物一样逐步发展了自身以抵制病害。当受到外界刺激时，某些小分子诱导子可与内源性分子一起协同调节和诱导植物免疫系统发生反应。为此此，针对植物 “免疫系统 ”开发植物疫苗是新农药创新研究中的一种新思路和新方法 30。探清植物信号传递系统以及免疫系统相关调控基因，可以为研制抗病、抗寒、耐酸、耐碱等优 良品种以及转基因农业奠定理论基础和科学依据。实际生产中出现的一些问题，也可以通过对植物免疫系统机理的研究而得以解决。 植物免疫系统的安全哨 白基因，为不用农药控制农作物病虫害带来新的希望。 以比作为植物的预警雷达， 美国康乃尔大学 物研究所（ 植物免疫系统的研究中发现了水杨酸结合蛋白 2（ 因。这一发现推进了迈向植物自身天然抵御病虫害、减少农药需求的步伐。研究表明， 白基因能及早发现险情并及时向植物免疫系统传递抵御外敌的信号，在植物 “免疫系统 ”信号转导过程中发挥重大作用。当植物发生病害时，它会向其他未感染部分转导遇袭信号，致使整株植物加强防卫，不仅对已攻入的病原体，同时也对其他细菌、真菌和病毒的病原体表现出持久的广谱抵抗力。 物免疫系统防御 第一章 绪论 14 克莱希格小组于 1997 年在植物体内发现 白，在今后的 5 年时间里对其提纯并着手克隆 白的基因、破译其遗传密码，从基因水平上研究 白在抵御病虫害的机制方面的作用 31结果发现，类似于动物免疫系统，植物也有类似的防御机制 当细胞被感染或发生变异可能变为 癌细胞时，细胞就会经历程序性死亡，牺牲个体以保全整体，我们称其为 “丢车保帅 ”。科学家们在发现这些机理后就可以着手研究利用植物自身的防范机制来抵御病虫害的新技术，从而增强植物转导御敌信号的能力，主要靠自身免疫 提高天然防御能力 。 此外，研究小组还提出两种可能的生物防病战略：第一，从基因改造入手，提高农作物产生植物荷尔蒙以及转导防御信号的化合物的能力；第二，开发制造能够模拟这些功能的类似化合物，帮助植物预防病虫害。就其本质来说，他们都是通过提高植物自身的天然防御能力从而达到防御的效果。此种防御既能能避免污染环境， 使病原微生物防不胜防，又能避免其产生 “抗药性 ”。克莱希格指出，病原体的入侵标志着一场持久战的开始，如果植物能够及时识别入侵之敌，并及时激活自身 “免疫系统 ”来防御入侵，那么将极少发生病害。人类对植物 “免疫系统 ”探究、了解得越多，就越能够在不使用农药的前提下，更有效地帮助农作物赢得最终胜利。 物免疫系统应用 自然环境中，很多植物病原菌严重地损害植物的生长和繁殖，在植物与病原体共同进化的过程中，逐渐形成了一系列复杂高效的保护机制来抵制病原菌的侵染。 植物一生面临着非常复杂和严峻的生存环境，长期受到真菌 、细菌和病毒的侵袭。经过漫长进化，从而逐渐形成了一系列复杂的主动适应机制，我们称之为植物 “免疫系统 ”。植物同动物一样，有了免疫系统之后，遇到病原菌入侵，即可引发免疫反应，使植物对病虫害产生抗性。利用植物的免疫性防治病虫害、开发新农药是当前植物病虫害生物防治研究中的一个新的紧迫性课题。 目前以寡糖类活性低聚糖 为重点的生物工程正逐步成为生物资源研究利用的热点。陕西美辰生物科技股份有限公司先后与西北大学化工学院、西北农林科技大学植物保护学院合作，在中国工程院院士李振歧教授的主持下，成功地从陕西美辰生物水苏糖原材料 中提取含有具诱导抗性的植物活性低聚糖，从而为防治小麦条锈病开辟了新的途径。所谓的生