【毕业学位论文】(Word原稿)芭蕉属植物内生菌特性的研究-园林植物与观赏园艺

福建农林大学博 /硕士学位论文 芭蕉属植物内生菌特性的研究 on 学 科 门 类：农 学 一级学科名称：园 林 二级学科名称：园林植物与观赏园艺 研 究 方 向：园林植物生物技术 论 文 编 号： 指导老师： 论文完成时间：二 on 2008 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了 标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 目 录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 第一章 研究综述 . 4 1植物内生菌研究进展 . 4 . 4 . 5 . 6 . 7 . 8 2香蕉枯萎病生物防治研究进展 . 10 3本研究的目的和拟解决的问题 . 11 第二章 芭蕉属植物内生菌的分离与数量分布特性 . 12 1 材料与方法 . 12 . 12 . 12 2结果与分析 . 13 . 13 数量的分布特性 . 13 . 14 . 15 3 讨论 . 16 第三章 芭蕉属植物内生细菌的鉴定及种群分布特性 . 17 1 材料与方法 . 17 . 17 . 17 2结果与分析 . 18 . 18 . 18 3讨论 . 21 第四章 芭蕉属植物内生细菌生防功能菌的筛选 . 23 1 材料与方法 . 23 . 23 . 23 2结果与分析 . 24 菌的生防菌筛选 . 24 . 24 3 讨论 . 27 第五章 生防菌铜绿假单孢杆菌在香蕉苗上的定殖规律 . 29 1 材料与方法 . 29 . 29 . 29 4. 29 蕉苗上定殖菌的分离检测 . 30 蕉苗上定殖菌的电镜观察 . 30 2结果与分析 . 30 4香蕉组培苗植株内定殖情况 . 30 4香蕉沙床苗植株内定殖情况 . 37 3讨论 . 40 第六章 讨论与展望 . 41 参考文献 . 43 问题如下 致谢 简历 发表论文 参加项目 所有的表格和图都是页码格式，怎么搞的，请修改。 1 中文摘要 香蕉枯萎病是一种毁灭性的土传病害，在防治上难度比较大，该病的生物防治已受到世界各国的极大关注。植物 内生菌作为一种新的微生物资源，引起广大研究者的注意。健康的芭蕉属植物体内可能存在能够与其协作起来共同抵抗香蕉枯萎病的内生菌，寻找这种内生菌作为生防菌防治香蕉枯萎病， 相对于其他生防因子而言，有很大的优势。 本研究 对 4 种芭蕉属植物 的内生细菌进行了分离和 鉴定 。 对不同品种芭蕉属植物不同部位的 内生细菌分布规律 进行 研究。统计分析结果表明， 不同品种芭蕉属植物内生细菌含量存在较大差别， 4 个检测品种中野生蕉内生细菌含量最高，芭蕉和 红花蕉 含菌量最低；红花蕉和威廉斯蕉均为根部含菌量远高于叶部和茎部。 野生蕉叶部内生细菌含量比根部含量高， 多集中在输导系统。 本研究将不同器官组织的研究具体细分到叶肉、叶脉、叶柄、茎顶部、茎中部、茎基部、根部，发现内生细菌并不是分布在各部位的每个组织中。 分离到 沙门氏 菌属 假单孢杆菌属 肠杆菌属 根瘤菌属 芽孢杆菌属 克雷伯氏菌属 等 16 个属的内生细菌，并将其中 14 株鉴定到种级；其中， 种类群在不同品种和植株的不同器官中均有分布并且数量都占绝对优势 。 根据这 14 种内生细菌的分布情况显示， 不同品种内生细菌在种群数量分布上存在差异 。 通过平板对峙试验 从 65 株芭蕉属植物内生细菌中筛选 对辣椒青枯雷尔氏菌有抑制作用的内生细菌 1 株，对香蕉枯萎尖孢镰刀菌古巴专化型拮抗作用较强的有 4 株，对苦瓜 炭疽菌拮抗效果较明显的 4 株。其中铜绿假单孢杆菌 时对 3 种病原菌都有较好的离体抑菌效果， 具有研究开发价值。生防菌 利福平突变菌株 在香蕉沙床苗上定殖试验结果显示， 香蕉沙床苗的 7 天、 14 天致死浓度均为 107。 同一接菌浓度不同苗龄香蕉苗上 生防菌 定殖规律与数量也有所不同。同时，提高接菌浓度对生防菌定殖数量提高的作用不明显。 在 20 天苗龄的香蕉组培苗上接种稀释10000 倍的生防菌 酵液能够使该菌在植株体内较好的定殖，接种 20 天后在香蕉苗根部及茎上部的定殖数量 都能保持一个较高的水平，同时使用的菌液浓度又较低，试验中死苗数也相对较少，在进一步的定殖规律、防病机理和菌剂开发应用的研究中可作为研究基础模式。 关键词： 芭蕉属；内生菌；分布；鉴定；生防菌；定殖 2 英文摘要 on of a it to It no of in As a It in be in of a of to as of to in of a in of in of of of s in on as at it in of 6 of 4 to in At in of 4 in of of 65 f. on 4of in 4on s in 407 to 4 To 40000 it 0 3 0 4in 4on a in of of 4 第一章 研究综述 芭蕉属植物，原产于亚洲东南部，是观赏价值极高的观赏花卉，已广泛应用于华南等温暖地区的庭院墙角、窗前、假山、亭口或池边等地的园林种植，极富南方特色，亦可盆栽观赏；其中红花蕉具鲜艳挺拔的红色直立花序，又是极好的插花材料，可作切花观赏。 近 几十 年来 毁灭性病害 香蕉枯萎病 蔓延 了几乎全世界，仅 剩 南太平洋、地中海、马来西亚的一些岛屿 没有感染香蕉枯萎病 （ C， 2004） 。 目前已 危害 到几乎所有香蕉 种 类 ， 如 “ 大 蜜 哈 ” 、 、 、 香蕉品系 ，还有 矮香蕉 、龙牙蕉(粉蕉 ( A)、棱香蕉 和野蕉 ( 王文华 ， 2007） 。 香蕉枯萎病传播蔓延十分迅速，发生为害逐年加重，而且可能会使香蕉在地球上逐渐消亡。香蕉枯萎病作为一种土传维管束病害，在防治上难度比较大，一般化学药剂几乎无效，到目前为止还没有一个对香蕉枯萎病行之有效的防治方法 ，但是越来越多的研究者把目光投 向生物防治。在生物防治领域，植物 内生菌 作为一种新的微生物资源，引起广大研究者的注意。健康的芭蕉属植物体内可能存在能够 与 其 协作起来共同抵抗香蕉枯萎病的内生菌，寻找这种内生菌作为生防菌 防治香蕉枯萎病 ， 相对于其他生防因子而言，有很大的优势 。 1植物内生菌研究进展 植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部或细胞间隙的 一类微生物 ，被感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物 即我们可把植物内生 菌理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物。 （邹文欣， 2001） 遍存在性 内生菌普遍存在于目前已研究过的各种植物中 。目前，已报道宿主植物主要分布在77科 153个属（邹文欣， 1999） 。 最早的认识起始于 1898年 ， 1898； F， 1898；， 1898； ， 1898）。 现在 全世界已在 80个属 290多种禾本科植物中发现 内生真菌 （邹文欣， 2001）。 近年来在甘蔗、玉米、水稻等禾本科农作物中还发现多种能固氮的内生细菌 （邹文欣， 1999） 。双子叶植物的内生菌研究主要集中 在 经济 植物和 药 5 用植物，如：菊科、桑科、葫芦科、梧桐科、十字花科、芭蕉科、卫矛科、珙桐科、夹竹桃科、小檗科、瑞香科等。由于裸子植物 的 内生真菌可产生抗肿瘤和抗菌的活性物质，现已对红豆杉科、三尖杉科、油松科、罗汉松科、银杏科等进行了系统的研究 （ 张晓瑞，2007） 。 研究 发现内生菌 也 存 在 于 灌木 植物 、草本植物以及栽培作物 、果树甚至藻类、苔藓和蕨类植物中 （邹文欣， 2001） 。 同时，植物体的根、茎、叶、花、果实和种子等中均有发现内生菌（张晓瑞， 2007）。 布与生物 多样性 植物中内生菌的种类和数量与植物的种类、基因型有关，在宿主植物科的水平上具有专一性，有的甚至在宿主种的水平上也有专一性（张晓瑞， 2007）。在同一种植物的不同器官组织中，内生菌的种类和数量也有不同，不同内生菌往往占据不同的生态位，它们在植物体中相互作用， 促进生长而或抑制生长， 建立一种微生态 的动态 平衡，植物体可被看作一个微生态系统（ L， 2001； 王坚， 2008）。 其中有一些是分离频率高、数量大的优势种群，还有一些是稀有种群（ 文才艺， 2004）。同一种植物，内生菌的种类和数量也与植物的生长阶段有关。 研究表明内生菌的种类多样性还与植物的生长环境有关，热带、亚热带的植物与干燥、寒冷地区植物相比，其内生菌种类比较多，生物多样性越丰富的地区植物中内生菌的种类和数量也越丰富（张晓瑞， 2007）。 对于一种植物而言，从中可分离到的内生菌通常为数种至数十种，有的甚至多达数百种（邹文欣， 2001）。如 子中的内生菌，发现分离自 83个健康叶片上的内生菌有多达 418个形态学种（其中基因型不同的分类元至少有 347个），这些内生菌同时也表现出一定的宿主专化性和地域专化性（ E，2000）。 目前在各种植物中发现的内生细菌已超过 129种（隶属于 54个属）。这些内生细菌大多为土壤微生物种类，其中假单 孢杆 菌属 （ 、芽孢杆菌属 （ 、肠杆菌属（ 以及土壤杆菌属（ 为最常见的属。 （ 邹文欣， 1999） 植物内生真菌大多数属于子囊菌类 （ 及其无性型，包括核菌纲（ 、盘菌纲 （ 和腔菌纲 （ 的许多种类以及它们的一些衍生菌 （任安芝， 2001） 。现已 经 在 80多属的几百种禾本科植物中发现 内生真菌 。尹建雯 等 从 3种芦荟中共分离 得到 内生真菌 88株，经微生物学形态观察，初步鉴定有 4个目、 4个科、 22个属 （尹建雯， 2004） 。内生真菌在药用植物中的研究 比较多，通过对一些药用植物的研究发现其内生真菌在镰刀菌 属 （ 、交链孢属 （ 、青霉属 （ 、根霉属 （ 、 枝孢 属（ 、毛壳菌属 （ 、曲霉菌属 （ 、盘多毛孢属 （ 、向基孢属 （ 、枝顶孢属 （ 、头孢霉属 （ 等皆有分布，其生物 多样性十分丰富 （王坚，2008） 。 6 近些年来，从植物中发现了大量的内生放线菌。目前分离到的内生放线菌主要为链霉菌属（ （ 汪军， 2008） 。 第一次发现内生放线菌是 其中 51 株为链霉菌属， 4 株 小单孢菌属（ ， 1株 诺卡氏菌属（ ， 1株 链孢囊菌属（ （ T， 2003）。 2个科 31种植 物的叶子 中 分离 得 到 97株放线菌 ， 从茎分离到 21株，从根分离到 212株，可见根部分离到的内生放线菌最多，在分离到的放线菌中链霉菌占 90以上，其余是 小双孢菌属（ ， 诺卡氏菌属 ， 小单孢菌属 和未鉴定的菌株 （ ， 2003） 。 物的 关系 传统的观点认为 大部分 植物内生菌对植物有潜在的致病性， 为 条件致病菌。当植物健康 时一般不表现出病症，但当植物衰老或受到环境条件的胁迫而防御功能严重削弱时，一 部分 内生菌就会转变为病原菌引起植物病害。现在被广为 接受的观点则认为在内生菌与宿主植物长期协同进化的过程中二者形成了互利共生的关系。一方面宿主植物产生的光和产物可为内生菌提供 其生长所需的 营养，另一方面内生菌产生的代谢 产 物常包含一些促生 或 抗菌的活性物质，能促进植物 的 生长发育，提高植物抗逆境 、 抗胁迫和抗病害的能力。 （王坚， 2008） 进宿主植物生长 内生菌促 进 植物生长 的 作用 表现 在 两 个 方面。一方面，许多内生菌 能产生促植物生长物质如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等，直接促进植物生长。 假单孢杆 菌属，芽孢杆菌属等都能分泌吲哚乙酸或赤霉素，草生欧文氏菌（ 仅能产生吲哚乙酸，而且还能产生细胞分裂素（冯永君， 2001）。 张集慧等从兰科植物中分离到的 5种内生真菌的发酵液和菌丝体中，分别提取出 5种植物激素，赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米核苷等，它们对兰花的生长发育有较好的促进作用（张集慧， 1999）。刘慧等人从黄花蒿中分离出一株内生真菌，其发酵液中能积累 ， 2000）。 沈德龙等的研究证明水稻内生成团泛 菌 （ 种植物生长激素，它们共同调节水稻的生命活动，能影 响水稻乳熟期光合产物的分布（沈德龙，2002）。 另一方面 ， 内生菌可增进宿主植物对 N、 P、 从而间接促进植物生长 。 低水平 元素的吸收，如有内生真菌的高羊茅叶片中的 1990）。同时，很多植物的内生细菌可从空气中吸收氮气，并将其固定为化合态氮，固氮内生细菌能利用宿主植物产生的多余能量发挥固氮作用，而且不形成特化结构，几乎可以在宿主各种营养器官内发挥作用（冯永君， 2001）。 禾本科农作物如水稻、 甘蔗、玉米上的内生细菌 都 具有很强的固氮能力。 甘蔗的根、茎、叶内存在大量的新型内生固氮菌 重氮营养醋杆菌 （ ，这种内生菌具有强抗酸能力 ， 能在高糖环境中生长和保持高效固氮活性并与甘蔗建立联合固氮作用 ， 表现 了 严格的寄主专一性 7 （ ， 1998；陈丽梅， 2000）。 强宿主植物对逆境和病虫害的抗性 研究表明许多内生菌能提高植物 对环境 的抗逆性。感染内生菌的牧草对环境胁迫如干旱（ ， 1997）、以及铝的毒害（ P， 1999）等具有更强抗性。 内生菌可增强宿主植物对植物病原细菌和真菌的抗性。目前已从多种植物中分离出了具有此种作用的内生菌。 内生真菌的草遭受真菌病害影响的程度远远低于没有内生菌的（ ； 1989）。 王万能和肖崇刚从烟草根部分离 出能防治烟草黑胫病 的内生细菌 （王万能， 2003） 。龙良鲲等从番茄健康植株根内分离获得的 239株内生细菌中有 18株能在平板 对峙 中拮抗番茄青枯病菌 （龙良鲲， 2003） 。 有些内生菌是因为产生了抗生素类物质对病原菌有拮抗作用， 这些 抗生素物质包括 2,4二乙 酞藤黄酚（ 、吩嗪羧酸 （ 、藤黄绿脓菌素 （ 、硝吡咯菌素 （ 、脓青素 （ 、 ，其中 们对小麦全蚀病菌有较强抑制作用，对黄瓜枯萎病也有一定的生防作用（ 石晶盈， 2006） 。另外一部分内生菌能产生几丁质酶 ， 以降解真菌的细胞壁或其它致病因子。内生菌的生防作用还表现在与病原菌竞争生态位和营养物质 ，从而 阻止病原菌入侵和繁殖。一定数量的内生菌及其诱导植物产生的酚类、醌 类物质在细胞间隙的积累 ，能 构成病原菌进入植物体内或在植物体内运转的机械 和 化学屏障 （ 文才艺， 2004） 。 许多研究表明，内生菌 能使宿主 植物对植物害虫和土壤线虫也有一定的抗性。 内生菌控制昆虫主要表现在其产生 一些毒素（ 包括生物碱 ） 使寄主能防御植食者，导致昆虫拒食 、 体重减轻 、 生长发育受抑制甚至死亡率增加等 。 在加拿大白株树中分离出的内生真菌代谢产物苯并呋喃衍生物对云杉卷叶蛾有很高的 抑制 活性 （ A， 1997） 。另外一种杀虫机制是植物体内固醇类物质代谢改变，以及真菌与昆虫竞争宿主植物的能源供应，引起被真菌 感染的植株上的幼虫生长缓慢甚至死亡 （刘峰， 2004） 。 工接种内生菌防治病虫害 用人工接种方法将有对植物病虫害有拮抗作用的内生菌接入到植物体内，发挥内生菌的防病作用。目前常用的人工接种方法有 3种： 灌根接种法，用内生菌悬浮液浇灌植株根际，使内生菌进入 到 植物根茎 内 （ 翁启勇， 2003）。 浸种接种法，将宿主植物的种子在内生菌悬浮液中浸泡一定 的 时间 再播种，长出后的植物体内会有该内生菌 （ 龙良鲲， 2003）。 叶片接种法 。另外， 茎基部注射、愈伤组织培养等 也 是常 见 的人工接种方法 （ 何红， 2004）。 为种子保护剂能有效防治玉米病害（ M， 1995）。 田宏先等 通过试验证明， 马铃薯组织内生菌 能 对马铃薯茎基腐病 进行 田间防治及 具 增产作用 （田宏先， 2002） 。目前，美国、澳大利亚、新西兰和欧洲一些国家的种子公司，都 能 提供内生真菌感染率高的草种。据估计 1990年全世界有 6000吨 内生真菌感染的黑麦草种子得到利用 （ R， 1993） 。现已培育出 8 的含内生真菌的种子除多个品种的黑麦草外，还包括草地 早熟禾、高羊茅、紫羊茅、蓝羊茅、硬羊茅以及剪股颖等若干品种 （ 梁宇， 2000） 。 用内生菌分泌的抗生素 植物内生菌分泌的抗生素是 直接 抑制和杀死病原菌， 因此 可以利用内生菌的代谢产物 直接 控制植物病害，作为研制无公害生物农药的重要来源 之一（汪军， 2008） 。根际内生菌 假单孢杆菌 会 产生一类鼠李糖脂生物表面活性剂物质， 能 破坏腐霉菌 （ 卵孢子的原生质膜，引起卵孢子细胞壁的水解破裂 （ ， 1995） 。 等从雷公藤的茎中分离到一株内生真菌 （ ，能产一种肽类抗生素 （ ， 不但能抑制灰葡萄孢 （ 等植物病原真菌，还能抑制白假丝酵母 菌（ 等人类病原真菌 （ A， 1999） 。 建外源基因的载体 内生菌长期生活在植物体内，能够在植物体内稳定的生长和进行代谢活动，这就使内生菌成为绝佳的载体在植物体内表达外源基因 （李强， 2006） 。目前的研究较多的主要是构建能够表达外源杀虫防病基因的工程菌株， 这是现在植物病虫害 生物防治又一新思路 。 在植物内生菌中转入抗病虫基因比 在植物中直接转入抗病虫基因简单容易， 而且将某些抗病虫基因导入内生菌，提高植物的抗病虫能力 的同时， 植物本身的基因并未发生改变 可 保持植物的天然性状 （汪军， 2008） 。 将苏云金杆菌的杀虫基因导入植物内生菌是现在的研究热点。 到 的木质棍状杆菌犬齿亚种（ 接种到某些植物上后可以很快转移到整个植物体中 ， 利用这点将苏云金杆菌 （ 的伴胞晶体编码基因转移到这种内生菌中，实现了对欧洲玉米螟的生物防治 （ H， 1992） ，减少了化学农药的使用。 甘蔗害虫 J， 1993） 。 离与侵染定殖 生菌的分离 首先要考虑宿主植物的选择。选择宿主植物的时候一般要考虑植物的独特生物学特性、一些特有的 现象、生长年限、生长环境等。例如要分离可产生对疾病有治疗作用物质的内生菌，一般选择药用植物；如果要选择对农作物病虫害具有防治作用的内生菌，一般要选择具天然抗病虫害能力的植物；如果要选择能降解污染物的内生菌，可选择生长在有污染物环境下的植物。这样可以减少随机筛选带来的繁重工作量。 （李强， 2006） 目前，内生菌的分离方法主要使用平板分离法，因为此法简便经济，易于推广。分离过程通常要先采用升汞、乙醇、 氯酸钠、 菌水冲洗。然后切取植物组织直接接入分离培养基或研磨榨取植 物组织汁液稀释涂布平板。 （王坚， 2008） 生菌的 侵染定殖 与检测 9 植物内生菌可以分为专性内生菌和兼性内生菌。前者只能存活于植物体内，如 环腐棒杆菌（ 是甜菜专性内生细菌，织片草螺菌 （ 、红苍白假单 孢杆 菌 （ 是玉米、甘蔗、高粱等植物的专性内生菌，它们跟随植物的整个生活史而存活，并通过种子传播到下一代（ G， 1996； 冯永君， 2001） 。后者不仅能在植物体内存活还能从植物根际和土壤中分离到 ， 多数内生菌都属于兼性内生菌 ，许多研究者认为，根际土壤是植物内生细菌的主要来源目前这一观点得到了大多数人的支持（ G， 1996； ，1999） 。 内生菌进入宿主植物体内 要经过 吸附、侵入和定殖 三个阶段 。内生菌对植物的表面吸附是一个主动过程。内生菌与植物组织表面的亲和机制如何 ， 可能会影响到内生菌侵染 植物的效率 （ ， 1997）。关于内生菌的侵染方式有几种假说，有人通过植物内生菌分解纤维素的研究结果认为内生菌 可能是通过分解植物表皮和破坏细胞壁进入植物，并且可能利用植物组织中的纤维素为碳源，以维持生长活动的需要（ 1996）。 大多数研究者 认为内生菌是通过自然孔口和伤口等进入植物体：自然孔口通常包括植物叶上气孔、水孔以及茎上的皮孔、蜜腺、胚根和次生根发生处等 ； 伤 口 则包括根在土壤中伸展时造成的持续不断的擦伤口 ， 以及雨水冰雹和收割多年生植物等造成的机械损伤等 （ ， 2003） 。内生菌侵入植物体的方式途径会因植物