细胞培养攻略.doc

一、细胞培养基础和步骤细胞培养基大全：/experiment/430/488/490/491/140812.htm细胞原代培养步骤：/experiment/451.htm细胞传代培养步骤：/experiment/505.htm更多细胞培养实验：/experiment/allExperiment.htm二、细胞培养常见问答1、加到培养基中的血清 必须灭活吗？答：不是必须的，看做什么实验了。2、四季青胎牛血清灭活是56 30分钟吗？答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子 。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56 ，30 min。3、我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗？答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。4、我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体 ，是不是会影响转染？我想未灭活的血清中含些抗体 补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗？细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67 收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么？答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。5、(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗？有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中；我配制胰蛋白酶 液，用的是D-PBS，有关系吗？答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子 、氨基酸 等成分带来的负面影响。我在实验室处理血清的时候，有一次水浴 箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80 ，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56 下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37 温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45 到62 之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。你可以摸索一下，血清从-20 冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。(2)分装后的血清从-20取出放4让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗？答：正常。6、如何选用培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：7、为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 8、L谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 9、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的氨基用L丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L谷氨酰胺几乎完全降解。 10、为什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 11、如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002 000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 12、如何消除组织培养的污染？ 当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1） 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2 ）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。3 ）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4 ）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5 ）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6 ）重复步骤4。7 ）在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。 13、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 14、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？ GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在28 时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20 储存胎牛血清，避免反复冻融。 15、目录上说，Hanks 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？ Hanks 平衡盐溶液（HBS）和Earles平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 16、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别? Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测： End-Point Determination of Endotoxin Content 噬菌体检验 生物化学检测 激素的检测 血红蛋白检测 Sf9 细胞生长促进及方法学检测 17、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 18、制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？ 是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100 l OPTI-MEM中，稀释DNA在100l OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800 l）。（注意以上是35 mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。 19、我使用SF900 时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？ 如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1），让血清给蛋白酶提供作用底物。 20、如何检测内毒素(热源)水平？ LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。 胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。） 21、我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？ 如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。 22、20 下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？ 对于普通使用的缓冲液，pH值随温度变化而变化。 下表列出温度改变10 时，pH值的变化情况 例如 20 下配制pH7.4 Tris缓冲液,40 时pH值为 7.4-（2x0.310）6.7823、室温下(25 )配制的Tris-HCl溶液，在37 使用时PH值是多少？ 缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50 mM Tris-HC 溶液在4 ，25 ，37 时，不同的PH值。24、昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？ 生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.06.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345380 mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。 25、High Five细胞有任何其它名称吗？ High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 编辑：呜咽1. 胰酶消化法实验方法原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。实验材料胎鼠新生鼠试剂、试剂盒1640培养基牛血清胰酶Hanks液碘酒仪器、耗材培养箱培养瓶青霉素瓶小玻璃漏斗平皿吸管移液管纱布手术器械血球计数板离心机水浴箱实验步骤一、实验材料准备1. Hanks液配方：KH2PO40.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO30.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hanks液可以高压灭菌。4下保存。二、具体操作1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2. 用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。8. 加入Hanks液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。10. 将细胞调整到5105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37下培养。收起注意事项1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。4. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。7. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。8. 瓶子开口后要尽量保持45斜位。9. 吸溶液的吸管等不能混用。实验方法原理培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。实验材料细胞试剂、试剂盒D-Hanks液小牛血清RPMI1640双抗胰蛋白酶EDTANHClNaHCO3仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管玻璃瓶培养瓶废液缸吸头枪头胶塞离心管量加样枪红血球计数板实验步骤1. 贴壁细胞的消化法传代：（1）吸除或倒掉瓶内旧培养液。（2）D-Hanks液洗23次。（3）向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶