【毕业学位论文】（Word原稿）紫茎泽兰EaCBF1基因的克隆及其在不同地理种群的遗传差异分析生物安全硕士论文

I 密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 紫茎泽兰 理种群的遗传差异分析 要 紫茎泽兰是我国为害最严重的恶性外来入侵杂草之一，原产于墨西哥至哥斯达黎加一带，后作为观赏植物引入欧洲，目前已广泛分布于世界 30 多个国家和地区。该草于 20 世纪 40 年代经缅甸传入我国，短短几十年间已经 遍布我国西南地区 6 个省市，并以每年几十公里的速度向我国北方地区扩散。 植物在长期进化中普遍形成了可诱导激活的抗逆境潜能。植物响应低温逆境形成了复杂的网络关系，并受多种调控基因和功能基因的控制，这种信号互作关系在先前的研究中已经得到证实。紫茎泽兰作为一种热带亚热带植物有逐步向温带蔓延的趋势，必然有其特殊的抗寒机制，这很可能与调控因子的控制有关。在拟南芥、番茄、棉花等多种植物中发现的 录因子是植物应答低温逆境的关键调控因子之一，一直倍受重视。在综述了紫茎泽兰入侵机制及国内外关于低温应答转录因子 究进 展的基础上，本文从紫茎泽兰低温调控因子 克隆入手，进行了了紫茎泽兰 列分析比对、诱导表达分析、种群间遗传差异及遗传转化等一系列研究，为从分子层面上解释紫茎泽兰低温适应性机制奠定了基础。主要结果如下： 1通过分析拟南芥、番茄等植物的 基酸核心区设计简并引物，以 模板，获得了 4 个同源性在 70以上的核心区片段。根据已知片段设计特异引物，运用 术从低温诱导下的紫茎泽兰 获得一个全长 800 因，定名为 物信息学分析发现，该基因编码一个由 219 个氨基 酸组成的蛋白，预测分子量为 蛋白具有 7 个非连续氨基酸构成的核定位信号， 60 个氨基酸组成的保守 合域，以及一个 3的酸性转录激活域。不同植物 因比对显示， 苹果 因亲缘关系最近其次是番茄，和葡萄的 远。 2由于 因家族成员间同源性高且多半为单拷贝基因，我们以 探针通过交确定了紫茎泽兰基因组内至少有 4 个 族成员，与核心区克隆测序结果一致。 3运用半定量 术分析了 不同逆境胁迫下的表达水平 。结果显示，低温下表达量最高，其次是干旱和外源 高盐胁迫也会诱导该基因的微弱表达。表明各种逆境信号间有串话现象。为了进一步研究 功能，我们构建了一个含有动子的组成型植物表达载体 ,并通过农杆菌介导法将该基因转化到烟草中，已获得了转基因植株，生理生化检测正在进行中。 4应用等位基因 术检测了 15 个地理种群 码区的单核苷酸多态性。通过测序比对发现，目前我国西南几个受紫茎泽兰危害较大的省市所采集的植物样本的 核苷酸水平上有 11 个碱基的 差异，而由于密码子的简并性，其氨基酸水平上有 3 处差异。这些结果表明该基因的核苷酸序列已经形成一定程度的遗传分化，主要表现在云南、四川及贵州种群相对于重庆和广西百色种群具有更高的多态性。从整体趋势看云南种群与四川和贵州种群亲缘关系近，与重庆和广西种群相对较远。 本研究以 温响应转录因子为对象从温度这个限制物种分布的关键环境因子入手，分析并推测了紫茎泽兰在逆境适应性方面的分子机制。这些研究对阐明紫茎泽兰的入侵扩张机理，预测适生范围具有重要的理论价值和现实意义。 关键词： 紫茎泽兰 外来入侵植物 转录因子 遗传差异 is of It is as an in 9th it be in 0 940s, it to a to a It is a in is by of in a of to is of as BF a in on of of in is is as to BF of 0% A BF a 24a as a a NA an as a in of of at BF in of in to It by BA on It A to is in by CR to 5 to of 1 in 80of on of It IV of 5 in We as of In we on of us to of V 目 录 第一章 前言 . 1 来生物入侵机制研究进展 . 1 外来生物入侵机制的探询：从宏观到微观 . 1 侵生物抗逆适应机制的研究现状 . 2 茎泽兰入侵机制 . 3 录因子 植物抗寒适应性研究中的重要意义 . 4 物低温胁迫应答基因 . 4 用元件的发现以及 码基因的克隆 . 4 控途径及其在植物低温驯化中的作用 . 5 种环境胁迫信号转导的串话现象 . 6 研究的目的与意义 . 7 术路线 . 8 第二章 低温应答转录因子的克隆 . 9 试材料 . 9 物材料 . 9 要试剂和耗材 . 10 株与质粒 . 10 要仪器设备 . 10 法 . 10 提取紫茎泽兰基因组 量） . 10 计简并引物 得 心区 . 11 物的纯化 . 11 接 . 11 化测序 . 11 理 . 12 取 . 12 端 . 13 端 . 13 因全长的拼接和测通 . 16 果与分析 . 16 茎泽兰 因核心区克隆 . 16 茎泽兰 因核心区序列分析 . 17 段 全长克隆 . 19 论 . 21 第三章 紫茎泽兰家族成员数检测 . 22 料 . 22 验材料 . 22 要试剂和耗材 . 22 要仪器设备 . 22 法 . 22 提紫茎泽兰基因组 量） . 22 切、电泳： . 23 印迹转移 . 23 杂交 . 24 针 放射性标记 . 24 交 . 24 膜 . 25 影原理： . 25 果与分析 . 25 论 . 26 第四章 紫茎泽兰 达及功能分析 . 27 料 . 27 试材料 . 27 试菌株和植物 . 28 器设备 . 28 法 . 28 参基因 克隆 . 28 板定量 . 28 组载体的构建 . 28 物表达载体的构建 . 29 击转化农杆菌 . 30 法转化野生型烟草 . 30 果与分析 . 31 同环境胁迫对 达量的影响 . 31 达载体的构建 . 32 物表达载体的鉴定 . 34 组载体的遗传转化 . 34 基因植株的筛选及生理检测 . 35 论 . 35 第五章 不同地理种群单核苷酸多态性分析 . 37 料与方法 . 37 品采集信息 . 37 位基因单核苷酸多态性的获得 . 38 果与分析 . 38 论 . 40 第六章 结论与展望 . 42 论 . 42 研究的创新点 . 42 望 . 43 参考文献 . 44 附录 . 51 1 培养基配方 . 51 2 缓冲液 . 52 3 交所 用试剂 . 52 致谢 . 55 个人简介 . 56 略 词 表 缩写 英文全称 中文名 落酸 旱应答元件 温应答元件结合蛋白 嘧啶重复序列结合元件 嘧啶重复序列结合蛋白 胎晚期丰富蛋白 导物 透应答高表达基因 温应答基因 ,4,5磷酸肌醇 分裂原活化蛋白激酶 依赖型蛋白激酶 端快速扩增法 表 目 录 图 1温信号转导途径的调控机制 6 图 1 起的信号串话原理 6 图 1有 式元件的 逆境响应基因的激活途径 7 图 2茎泽兰丛生芽组培苗 9 图 2-2 端快速扩增法原理图 12 图 2茎泽兰基因组 取效果图 17 图 2同方法下紫茎泽兰总 提取效果图 17 图 2并引物 物电泳检测 17 图 2拟南芥和番茄 心区相似性比较分析结果 18 图 2心区翻译产物的比较 18 图 2 个紫茎泽兰 族成员核心区多肽同源关系树 19 图 2因特异引物 物电泳检测 19 图 2茎泽兰 整氨基酸序列 19 图 2其它植物 系统遗传树 20 图 3针回收结果 25 图 3:紫茎泽兰总 切结 果； B:紫茎泽兰 交检测紫茎泽兰 族成员数 26 图 4同环境胁迫下 达差异 32 图 4物表达载体的构建 32 图 4 切的 物表达载体 33 图 4建好的 物表达载体的鉴定 33 图 4 切的 序载体 34 图 4组载体 酶切鉴定结果 34 图 4草遗传转化 35 图 55 个紫茎泽兰地理种群采样点分布图 38 图 55 个不同地理种群扩增产物电泳检测 39 图 5:广西南宁种群 序图 B:云南大理种群 序图 39 表 2茎泽兰、拟南 芥和番茄 心区同源性分析 19 表 4验处理 27 表 5茎泽兰采样地点及相关地理信息 37 表 55 个不同地理种群 源性矩阵 41 X 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前言 来生物入侵机制研究进展 外来生物入侵机制的探询：从宏观到微观 随着经济全球化，贸易自由化的进一步延伸，与人类生存戚栖相关的生物和环境受到了前所未有的巨大威胁。生物多样性保护和生态安全逐渐成为当今国际社会关注的焦点，而外来入侵生物所造成的生物安全问题也已经成为各国国家安全的重要组成部分（万方浩等， 2005）。有别于物种的引进与交流，生物入侵是指生物由原生存地经自然的或人为的途径侵入到另一个新环境，并对入侵地的生物多样性、农林牧渔业生产或人类健康造成经济损失或生态灾难的过程。每年由于外 来入侵生物造成的经济损失触目惊心。据不完全调查显示，美国每年直接或间接用于主要