【毕业学位论文】几种嗜酸氧化亚铁硫杆菌表型和遗传多样性研究-资源加工与生物工程

分类号 密级 U D C 编号 中南大学 士学位论文 论文题目 几种嗜酸氧化亚铁硫杆菌表型和遗传多样性研究 学科、专业 微生物学 学院（系 所） 资源加工与生物工程学院 研究生姓名 彭 宏 导师姓名及 专业技术职称 胡岳华 教 授 2006 年3 月 分类号 密级 硕士学位论文 几种嗜酸氧化亚铁硫杆菌表型和遗传多样性研究 on 者姓名：彭 宏 学科专业：微生物学 学院（系、所）：资源加工与生物工程学院 指导教师：胡岳华 教 授 杨 宇 副教授 论文答辩日期 答辩委员会主席 柳建设 中南大学 2006 年3 月 硕士学位论文 摘要 I 摘 要 嗜酸氧化亚铁硫杆菌（ 下简称 硫化矿浸出体系中最主要的细菌之一， 同时对于矿山生态环境的形成特别是酸性矿坑废水（ 产生，有重要影响，目前做为酸性极端环境的模式菌株得到各方面的研究探索。本文主要从 的分离与鉴定出发，对多株分离纯化的菌株进行表型和遗传特性的比较研究， 同时探讨影响生物浸矿效率的有关因素。 本文研究中，分别从广西铜坑、甘肃白银、江西九江、江西城门山，采集矿坑水富集分离得到，代号分别为： 、 、 、 。并对四个菌株对亚铁和元素硫的氧化能力进行了研究， 发现不同菌株的氧化活性存在明显差异，并且亚铁氧化活性与氧化元素硫的能力非显著相关。 本文完成了四个菌株在 9K 亚铁培养基的生长参数的测定工作。扫描电镜的结果显示： 株直径为 长度为 长度为 株直径为 株直径为 长度为 株的最适生长温度为 25 30，最适 为 对数期细菌的比生长速率（）分别为 h，h，h，h。同时，针对菌株的生长曲线，本文提出了随机生长模型，模拟结果可以很好的表征实际生长曲线，利用该模型对初始菌群数量和菌种活性对迟缓期的影响进行了分析。 对有机碳源和氮源利用研究方面发现： 类似，而 则比较特殊，该菌不能在亚铁和蛋白胨混合培养液中生长。 16s 列显示，四株菌株均为嗜酸氧化亚铁硫杆菌，其中，菌株准菌株而菌株但是菌株所有已提交的 A. 其中与菌株相似度也仅为 综合有机碳源和氮源利用研究中所也反映出的 其他三个菌株不一致，我们认为菌株 能是 A. f 菌种的一个新菌系。为此进行和出27 天后，两者的硕士学位论文 摘要 果类似，金属锌的浸出量达到650，比无菌对照高一倍，说明该菌株具有一定的浸矿效果。 对细菌生长过程中产生的沉淀进行分析， 发现当示沉淀的结晶状态良好，可以观察到明显的晶面，平均粒径 15m，量比分别是 60和 37，另外研究其热分解效应，主要分两个化学分解过程，由动力学计算结果知，沉淀热分解的第一阶段的反应活化能E=KJ前因子的对数值 二阶段的E=KJ个阶段的机理函数都是符合 程，即随机成核，向后生长。 设计特异性引物，对 的亚铁代谢系统的关键基因亚铁氧化酶基因进行克隆和测序， 序列同发现序列相似性在99%97%之间，分析编码区域发现在第 7987 位可能存在一个高变异区：在第 7981 位，菌株 码的氨基酸 在第 8587 位，菌株 菌株 是 外在位点第 111 位，所有菌株都是 TC，但编码的氨基酸未发生变化,属于同义密码子。对 于编码区上游序列，比对后没有差异；而对于编码区下游序列，经比对发现存在一些差异位点。另外对不同能源基质下生长的 的亚铁氧化酶基因的 果发现亚铁基质的表达量明显高于硫基质。总的看来， A. f 菌的亚铁氧化酶基因是高度保守的，是其亚铁能量代谢系统中的关键酶基因。 关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌，生长曲线，16s 列，黄钾铁矾，亚铁氧化酶基因 硕士学位论文 摘要 , is in as is of in In .f by of on We K、of of of no EM .0 m in .4 m in ) h， h， h h A to is 5 0 pH of MS K . f to 6S 6S of On 6S Y TW MS is K is FY K be a . f. K 7 of 50 in in pH EM 5 m. 硕士学位论文 摘要 he F 0% 7%of E=JE=Jof on ro in . f 9%7% he a DS 9th 7In 9 81 5 87 in K in Y. 11 C in in to ro in in ro be to ro in in 16s 硕士学位论文 目录 v 目 录 摘 要 录 第一章 文献综述 物冶金工艺研究进展 生物冶金细菌学研究进展 分子遗传学研究进展 题的研究目的与研究内容 1 第二章 实验材料和研究方法 3 验材料 3 研究方法 5 析方法 9 第三章 菌种的分离与鉴定 1 品的分离与富集 1 3. 2 培养特性 2 源利用 4 6S 列分析与系统发育 0 矿试验 4 淀分析 4 论 3 第四章 亚铁氧化酶基因多态性研究 4 4 果与讨论 6 第五章 结 论 3 株遗传和表型多样性 3 株亚铁氧化酶基因多态性 4 参考文献 5 研究成果 6 致 谢 8 硕士学位论文 第一章 文献综述 1第一章 文献综述 物冶金工艺研究进展 生物冶金是利用以矿物为营养基质的微 生物，将矿物氧化分解从而使金属离子进入溶液，通过进一步分离、富集、纯化而 提取金属的高新技术。从文献记载来看 , 生物冶金技术已具有较长的历史，其中，中华 民族是世界上最早采用生物冶金技术的民族，早在公元前 2 世纪，堆浸在当时就是生产铜的普遍做法1。在欧洲，这种技术的应用至少始于公元二世纪，从 1687 年开始，瑞典中部 山的铜矿至少已经浸出了 2 百万吨铜2。 微生物在矿业中的认识和 应用研究还处于萌芽阶段。直到 1947 年 , 首先从酸性矿坑水中分离出能氧化硫化矿的氧化亚铁硫杆菌（ ，其后 、 对这种自养细菌的生理特性进行了研究，发现这种细菌能将 化为 并能氧化矿物中的各种还原态硫化物生成硫酸。 1954 年， 等6较系统地研究各种硫化物的微生物浸出，报道了嗜酸氧化亚铁硫杆菌在硫化矿浸出中的作用。 1955 年，7,8首次申请了生物堆浸专 利并将该专利授权给 业公司，该公司在二十世纪 50 年代应用该技术，标志 着生物冶金技术现代工业应用的开端。 目前生物冶金的研究对象已经扩大到 利用具有浸矿能力的细菌进行铜、 铀、金、锰、铅、镍、铬、钴、铁、砷、锌、铝等几乎所有硫化矿的浸出8,9,10。同时，由于这些微生物也是矿山酸性废水 (生的主要因素之一11，因此矿山废水的综合性治 理中微生物因素也值得关注12, 13。由于生物冶金技术特别适于处理贫矿、废矿、表外矿及 难采、难选、难冶矿的堆浸和就地浸出，并具有过程简单、成本底、能耗低、 对环境污染小等突出优点，正在工业生产中逐步推广应用14。各国投入了大量的资金研究和发展这项技术，目前南非、澳大利亚以及美国相对领先，欧盟为 了缩短差距，专门启动了一项n 划15，该计划在欧盟的 12 个成员国以及南非和罗马尼亚中集合 7 家研究所， 14 所大学以及 2个政府部门展开联合研究， 项目从 2004年 11 月启动历时 4年， 总预算 元。进入 21 世纪后，我国也加大了在生物 冶金领域的研究力度， 2004 年启动了生物冶金重大基础研究项目（即 973 计划） ，产业化方面也取得一定进展，例如在江西德兴铜矿的堆浸16、广东紫金山铜矿的低品位铜矿原位堆浸 17以硕士学位论文 第一章 文献综述 2及广东梅州低品味铜矿处理示范工程项目等。但 是，目前产业化方面的重大进展还主要集中于国外，特 别是一些矿业公司，例如 公司在 20 世纪 90 年代末期就开展了浮选精 矿细菌槽浸的研究18,19。归纳起来，产业化主要在两个方面取得了进展。 化铜矿的细菌浸出 山20位于智利北部的 漠， 是表生板岩矿床，铜的平均品位为 含铜矿物为辉铜矿（占 、铜兰（占 以及黄铜矿 （占 ， 采用原位堆浸萃取电积技术 (于 1991 年工程启动， 1994 年 1 月运转，每天处理硫化矿 17300t, 生产标准铜206t。另外，在智利 区的 山设计了进行废石矿堆的堆浸的工艺，图 1 表示其堆浸堆以及相关设施。 铜的浮选精矿细菌槽浸也是研究热点， 在细菌方面，主要是两类：一类是中温菌，主要是 作温度是 40另一类是高温菌，主要 是一些古细菌，如硫化叶菌和布式菌。其中，中温菌浸出 以次生硫化铜矿为主，例如智利的 处理铜精矿 有两条细菌浸出回路9。对于高温菌浸出， 司开发出 8,19,20。 处理金矿的细菌预氧化 全球黄金矿藏资源有约 1/3 属于用传统氰化浸出不能有 效提取的难处理金矿1。鉴于此，必须对其进行预处理，使载金矿体发生变化，将包裹其中的金解离出来，为下一步氰化浸出提供条件，传统的 预处理方法包括：氧化焙烧和图 1 浸. (a)浸堆鼓风机；(b) 绝热膜；c)灌淋硕士学位论文 第一章 文献综述 3加氧浸出等，而生物氧化以其投资成 本低，环境友好成为优选技术。从 20 世纪80 年代开发出来的 难处理金矿生物氧化方面应用最广， 该技术主要用中温细菌在充气的搅 拌槽内处理细磨矿， 图 2 是该技术在各国应用的情况18,19。 生物冶金细菌学研究进展 目前，生物浸出产业化发展要求分离与 鉴定出不同性能的专属细菌。而这要求从各种环境进行分离采样，主 要是在富含各种硫化矿如黄铁矿 (、黄铜矿 (砷铁矿 (的含重金属离子矿山酸性废水（ 11,21因此对 境的多样性研究尤为重要，了解其中微生物群落的组成和演替以及优势菌群。早期的 研究主要是基于微生物培养技术23, 25和抗体或脂肪酸标记技术26只能分离和鉴定有 限的菌种，主要是嗜酸硫杆菌属类22, 26, 而随着分子生物学技术的发展，特别是 术以及生物芯片，使得环境微生物的研究进入一个全新时期 ，多种无需培养的快速检测方法用于研究微生物多样性，从许多 境中发现了新菌属11, 29 增 16S 因的序列多样性以及 研究发现在 i = +1 7 8 = 2* %细菌裂殖 9 士学位论文 第三章 菌种的分离与鉴定 27参数说明 . 实际菌株的生长曲线数据与随机模拟情况如上图 3 从图式来看，当模型参数分别 00， , D=机模型可以相对比较好的拟和出实际细菌菌群的生长情况，尽管模拟曲线相对位于实验点下部。当然模型还需要对一些参数进行修改和优化，这需要更多的实验数据进行参考。 模型参数对生长曲线的影响 输入项中的四个参数可以分为两类：第一类是参数 主要表征接种量对菌群生长的影响；第二类这包括参数 D，他们主要反应菌种活性对菌群生长的影响。对于两类参数，本文要讨论其中的参数 0对生长曲线的影响。从图 3 3结果来看，增加参数 0都能缩短迟缓期的时间，这一结果同前期的报道一致。为了进一步探讨参数对菌群体系的影响，本文考察了不同 0值的生长曲线的平均生长速率常数 K， 通过线性拟和生长曲线的对数图，即菌数的对数值 代数（ 和直线方程，得到的斜率K，即该体系的比生长速率83，结果见图 当 700 时， 得到方程 K 300 时， 得到方程 K 较两者 K 的变化仅有 变化非常小，即菌群的特性没有发生变化。 而对于不同的菌群活性值是： 01234567891010510152025303540103) 绝对菌群数量 初始绝对菌群数量 每代菌群数量 传代代数 S 迭代次数 始菌群数量 细菌活性值 每代菌群平均活性值 , D 菌群活性分布方差 K 平均生长速率常数 图 3)实验数据, 模拟曲线 硕士学位论文 第三章 菌种的分离与鉴定 28当 ， 得到方程 K ， 得到方程 K 较两者 K 的变化有 变化显著，菌群特性发生变化。 由此可见两者虽然都可以缩短迟缓期的时间，但是本质不同。这些模拟结果有利于实际生物浸出的优化控制以提高浸出率。 i)i)102)103) 0=B: C: 3: N 0=700; B: 00; C: 00 图 3: 不同初始菌群活性. a: A 0b: A 0I: 不同初始菌群数量 A: N 0700, : A 0300 硕士学位论文 第三章 菌种的分离与鉴定 29数据显示， 该随机模型可以用于模拟嗜酸嗜酸氧化亚铁硫杆菌在迟缓期和对数期的菌数生长变化 ;讨论了模型参数 0对生长曲线的影响，虽然增加两者的值都可以缩短迟缓期的时间，但是两者对体系影响不一致。 源利用 本研究中，在含元素硫 (5%)的 9K 液体培养基中测定了这 4 种富集菌株的硫源利用情况，在初始接种量均为 106个 /养温度 30，转速 200 初始 以体系 变化表征菌株对元素硫的利用情况，如图 3株的元素硫氧化活性从强到弱依次为： 、 、 、。其中， 和 活性类似， 较强；而这与它们的亚铁氧化活性不同 (见图 3， 的亚铁氧化能力曲线以及在以亚铁为底物的培养基中的生长曲线都显著高于 ，这与已有的报道90不一致，通常认为亚铁氧化活性高的菌株其元素硫的氧化活性也高， 这可能与菌株的生态多样性和遗传差异有关，需要进一步探讨，具体原因将在下一章论述。 机碳源和氮源的利用427 O 在基础培养基（不加9分别加入蛋白胨（ ；葡萄糖（ ； 单质硫 （5%） ； 硫代硫酸钠 （1%） ；427 O （ ；427 O（+ 蛋白胨（ ；427 O （+ 葡萄糖（ 。其中硫代硫酸钠、427 O （过滤除菌后加入培养基，单质硫隔水蒸煮1 4 6 8 3士学位论文 第三章 菌种的分离与鉴定 30灭菌，再加入培养基。以菌株悬液接种，每培养 3d 传代一次。连续传代 3 次，涂片并在显微镜下观察菌的生长情况。 菌株 硫酸亚铁 元素硫 硫代硫酸钠 葡萄糖 蛋白胨 硫酸亚铁葡萄糖 硫酸亚铁蛋白胨 对于菌株 白胨、葡萄糖对其生长都是起抑制作用，可能 一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌新的亚种。其它三株菌株，对有机能源的利用相似，葡萄糖对菌株的生长是抑制作用 ,而少量的蛋白胨（ 可以促进菌株生长，浓度在超过 1%后，蛋白胨开始明显抑制生长。 6s 列分析与系统发育 利用通用引物(见第二章)扩增出四个菌株的 16s 并且克隆到 A , 然后将克隆子交由公司测序, 序列已经递交到 陆号分别为: 、。同时，将序列递交到果显示所有序列跟已有的 A. 四株都初步判定为 A. f 菌，其中，菌株 标准菌株 相似，而菌株似度分别为 但是菌株 较特殊，与所有已提交的 A. f 菌的 16s 序列的相似性都不超过 99%,其中与菌株 相似，但相似度也仅为 从上一节的有机碳源和氮源利用情况，也反映此菌株. f 菌种的一个新菌系，为了探讨其在浸出硫化矿方面的前景，后面将描述其浸出铁闪锌矿的情况。 同时，1, 以 本实验中的四条序列和. 表3建系统发育树。由图3A. 分别是其中， 属于来我们也分离纯化了多株 A. 隆和测定其16s 对结果显示均在三个亚类中，没有观察到其他类型，但是主要分布在表 3士学位论文 第三章 菌种的分离与鉴定 31 没有发现有 的菌株，这可能与地域和其生态环境分布有关。 另外，我们通过全序列的比对，找到了三个亚类的信息位点。我们知道核苷酸替代、核苷酸缺失、核苷酸插入。单个核苷酸替代的方式又可分为转换替代和颠换替代两种。 全序列比对中单个核苷酸的替换出现三个或以上我们视其为信息位点。对核苷酸序列而言，理论上每个位点均可构建三种可能的谱系树。然而，并非所有的位点都能用于重建系统发育关系。可用于构建最简约谱系树的位点才称为信息位点92。由表3序列中共得到 21 个信息位点，除了位点 970 和 1375 以外93，其它都分布在A. f 菌 16s 序列的靠 5端前 800位置，以后的序列非常保守。而对于前13 个位点又主要分布于两个区域内，第一区域位于 175，即通常指的可变区域 外一个则是 390区域介于可变区域 间。同时计算和模拟三个亚类在这两个区域的二级结构和最小自由能94,95，见图 3中， 参照， 别以果显示，在 175， 异交大，而且 最小自由能低，这与其 量高可能相关。而在 390，三个亚类的二级结构差异都比较大，可能作为精细鉴定 A. 菌株名称 索引号 K 11595 Y 3对中使用的16 第三章 菌种的分离与鉴定 324366(点175 A G G 178 G G A 190 C T T 205 C T T 206 G A A 218 A T T 234 C A A 394 A A G 406 T C C 411 T T C 419 A A G 427 A G G 438 T T C 587 G G A 596 T C C 598 T G C 787 G G A 790 T A T 791 A G A 970 A G G 1375 G T T 表 3个亚群的信息位点分布 1: 位置标号统一以 6S 标准 硕士学位论文 第三章 菌种的分离与鉴定 33图 3三个亚区的 16S A 175三个亚区的 16S A 390 3基于 16S A. 株生态发育树，采用 法为 A. 4366 (外来群 硕士学位论文 第三章 菌种的分离与鉴定 矿试验 浸矿试验主要进行铁闪锌矿的浸矿，实验矿样粒度分布为 104 m，矿浆浓度 5%(g/L)，实验菌株采用 种量为 10%，调节初始菌浓度为 107其特殊的生理生化特性，实验中的数据是菌株未经驯化的情况，表现出一定的浸矿能力 , 能对锌离子有一定的浸出效果，但效果不是很明显。开始，有菌摇瓶对铁闪锌矿的浸出速度比较稳定，随时间变化不显著，浸出锌离子的浓度维持在比无菌对照高出 150左右的水平上，但在 25d 以后，锌的浸出率呈现出加快的趋势， 由于细菌能够吸附在矿石表面能对矿物产生腐蚀电化学作用来加快浸矿速度。在 27细菌浸出的锌离子浓度达到 650，而无菌对照只有 392 ，如图 3中 淀分析 铁矾是细菌浸出中常见的现象，为满足细菌生长对某些无机盐的需要，有时要在浸出液中添加 K+， 这使得铁矾更加容易生成。少量的铁矾对细菌的生长活性有利96，但大量铁矾沉淀包围在矿物表面，形成比较致密的包裹层时，对细菌的浸出影响较大。在细菌氧化亚铁过程中，完全氧化以后会在产生黄色沉淀物，在细菌浸出过程中也会出现类似物，附于矿石表面，阻碍浸出过程