【毕业学位论文】（Word原稿）静水压联合IGF-1干预对山羊颞下颌关节盘细胞F-actin表达影响的实验研究

兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 1 第一章 前 言 颞下颌关节盘 (下颌骨髁突和颅骨颞骨关节窝之间的一种纤维软骨样组织，在生理状态下处于复杂的力学环境中，其关节盘纤维软骨细胞能够对外力产生生理及病理上的反应。而在目前针对严重的颞下颌关节病临床上无疗效理想的治疗方法，工程化颞下颌关节盘是一项有前景治疗新途径 1力学因素和胰岛素样生长因子 -（ 别作为一个重要的生物学刺激因素和生物化学刺 激因素参与组织工程化颞下颌关节盘的构建。 细胞骨架是细胞的支架结构 ,是细胞力学信号转导的一个重要环节 , 肌动蛋白（ 胞骨架是一种位于细胞核及胞浆内的纤维状蛋白质基质，是细胞内传递应力信号的重要途径。肌动蛋白（ 是细胞骨架中微丝的主要蛋白，包括聚合态肌动蛋白（ 游离态肌动蛋白（ 有研究表明：在机械应力作用下，细胞骨架蛋白 发生重排 5细胞骨架丝状肌动蛋白（ 重排有利于细胞外信号向细胞内传递及细胞形态改变 8 下面就静水压和 组织工程中的应用、 纤维软骨细胞生物力学研究现状 、以及 介导力学信号传导机制中的作用作一综述。 水压在组织工程中的应用 在人类的日常生理活动中，关节软骨承受着各种力学刺激，如压力、剪切力等，这些不同方式的力学刺激影响着软骨的生长代谢。其中在人体关节软骨所受到的各种力学刺激中，压力是最主要的，原因是压力在人体关节运动中的出现频率和作用时间占主要地位。而关节盘压缩模量的大小从数十千帕到数十兆帕不等，数据差异明显，原因可能与应力大小、种属原因、振幅、试验应变率以及频 率等因素有关 11其中压力的作用是静态和动态压力交替完成的。 生物力学刺激是软骨细胞不断生成细胞外基质的一个基本信号，在体外的细胞培养中，直接压缩力、静水压、高剪切流环境和低剪切流环境等机械兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 2 力学刺激被整合到培养器中承担生物反应器功能，通过改变生物反应器培养状态，达到控制工程化软骨的质量 13。在静水压对关节盘单层细胞影响的实验中发现，持续的 10频率为 1 14发现对单层培养的细胞时， 静水压在多种组织的力学调控中都扮演重要角色，这些组织有膀胱 15、骨 16、脉管 17、软骨 18 26膝关节盘 28、椎间盘 29等，在这些研究中，静水压基本都能促进细胞外基质的产生。因为纤维软骨的退化和骨关节病仍然是一个巨大的挑战，所以在纤维软骨的组织工程研究中应用静水压作为刺激改建因素有可能成为特别有前景的策略。 静水压包括循环静水压和静态静水压，循环静水压和静态静水压是不同的力，成骨细胞在正常骨运动过程中也可能发生 细胞行为改变可能与其受到的循环静水压有关 31，同时发现循环静水压不仅能维持成骨细胞表型同时还能提高基质流动有关酶的活性。 2等人发现脉管系统的细胞因为液体不断流动所以也承受循环静水压的作用，在这种情况下静水压对于维持细胞骨架的结构十分重要；虽然很多组织承受着循环压力，但在生理情况下也一样受着静态压力的作用，特别是椎间盘细胞和关节软骨；有学者 33通过实验证实 细胞受到 10静态静水压作用后，其蛋白合成与型胶原基因表达增加，然而有趣的现象是，在纤维软骨的生化的研究中，发现力学刺激 24h 之后，发现蛋白多糖与型胶原表达进一步增加，这表明间歇时间在长期组织工程研究中是一个应该考虑的重要因素。 细胞骨架的形变被认为是细胞感应外界力学刺激的的初始表现 34， 静水压 被定义为一种压缩 体积的力，事实上，形变程度往往非常小， 充满液体结构能够压缩的限度也 非常低，静水压从 0 到 10变化会 因为细胞容量 的抗 压缩能力 ， 而在细胞体积上 仅 有大 约 变化 。尽管原则上如此小的变化可不计入细胞变化的范畴，然而在结缔组织细胞中能观察到比上述实验设计更低的静水压可以 引起的钙离子通道 的 开放 35。静水压 对 细胞骨架的影响是可以 影响每一个 由 单体合成多聚体的网络结构， 此 网络结构具 有持续而稳定的通量，可以连续的被解聚、聚合、从而以配合细胞的需要 。当 细胞骨架聚合作用受到热力学作用影响时，细胞中多聚体的稳定性会发生改变，有结果研究表明不同的物种可承受不同强度的压力和 (或 )不同的 环境温度。 也有学者认为，压力引起软骨细胞生长的变化的原因可能由于力学信号兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 3 通过细胞膜受体 (如 整合素 51 等 )启动 相应 信号转导通路 ( )， 作用于 各种效应点，从而 表现 为 细胞生长代谢 和 基质合成方面的变化 36,37。在关于 下颌髁突软骨细胞的研究中发现，适宜的压力可以改变细胞的微结构，其力学传导的可能途径是通过整合素 蛋白的转导过程而传导的。总之，静态静水压和间歇性静水压刺激在组织工程研究中都显示了有利的影响。然而，静水压对纤维软骨影响的分子生物学机制还有待进一步的研究。 胰岛素样生长因子 - (组织工程中的应用 关节软骨具有自分泌和旁分泌调节作用的生长因子 ,是软骨细胞有丝分裂刺激剂。 （ 1）刺激软骨细胞分裂增殖； （ 2） 促进蛋白多糖的合成 ,抑制蛋白多糖的降解；（ 3） 刺激、型胶原的合成； （ 4） 维持软骨细胞表型 ,在软骨细胞的自稳态平衡的调节中起重要的作用； （ 5） 抑制软骨细胞凋亡。 各种生长因子中第一个被确认对关节软骨具有旁分泌 (细胞产生的因子作用于邻近其它细胞 )和自分泌 (细胞产生因子作用于细胞本身 )调节作用的生长因子，能促进刺激细胞的分裂增殖和蛋白聚糖的合成。 有学者38研究发现， 时间依赖效应，在一定浓度范围内的 浓度为 100 浓度超过一定的浓度， 现出一定的耐受性。然而 使体外三维培养的软骨细胞生成类软骨样组织39。在半月板纤维软骨细胞中， 特别在位于无血运区的细胞促增殖作用更明显 40。然而在软骨细胞 的培养中发现，内源性 过阻止 而降低 在自组装研究中， 而改变细胞外基质中、型胶原含量的比兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 4 例，这显然对基体的性质不利，相对而言 且能促进更多细胞外基质的合成，同时提高了自组装基体的力学性能 41。在 关节盘的实验研究中，学者们发现高浓度的 低浓度则利于 42。 验发现，低浓度的 43。基于生长因子各自特有的作用，推测不同生长因子间进行组合后有可能具有协同作用。 现生长因子联合应用而已提高工程化组织 块结构的完整性，然而在提高生物力学特性和生化合成方面无显著作用 44。在正常情况下， 复合物形式存在，不表现活性。只有当 言之， 而其作用机制尚待进一步研究。 纤维软骨细胞是存在于椎间盘、膝半月板和颞下颌关节盘以及全身其它联动关节组织中的一类细胞的统 称。生物力学在纤维软骨细胞组织工程和骨关节病发生发展中起重要作用，近年来越来越多的学者从细胞及分子水平研究了生物力学对纤维软骨细胞生物化学代谢的影响。 下面就 纤维软骨细胞生物力学与致炎因子的关系以及不同力学加载方式对纤维软骨生物力学的影响做一综述 。 维软骨细胞生物力学与致炎因子的关系 在骨关节炎或风湿性关节炎中，纤维软骨细胞处于炎症环境中。多位学者模拟了在炎症环境中纤维软骨细胞受力学刺激后产生的反应。 45以致炎因子 节盘纤维软骨细胞，给予 20%， 态拉伸应变消除 调部分基质金属蛋白酶（ 作用。生物力学信号通过抑制多种 表达从而下调纤维软骨细胞在炎症环境下的代谢活性。 6等发现椎间盘纤维软骨在致炎因子作用下，通过产生和激活 下调基质的合成量；而5研究表明生物力学信号能对抗这种不良反应，这表明在骨关节炎患者中机械负荷不仅对纤维软骨的内环境稳定起决定性作用，而且对胞外基兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 5 质的降解同样重要。 47以不 同频率不同强度的周期拉伸力（ 用于鼠半月板纤维软骨细胞，当周期拉伸力强度为 5% 到20% 时不会诱导前致炎因子诱导性型一氧化氮合酶 (肿瘤坏死因子(金属基质蛋白酶 表达。 以强度依赖性抑制白细胞介素 1 诱导型 产生，同时 有频率依赖性，高频率低频率抑制 能力增强。 48还发现 制了 瘤坏死因子受体 2（ , 诱生型一氧化氮合酶 (基因表达，随着周期拉伸应变作用时间延长基因表达抑制增强。另外 8等发现在炎症环境下生物力学信号调整 不是 表达；然而周期拉伸应变的抗炎作用是暂时的，周期拉伸应力对 抑制作用早于并强于且在 间也明显不同，这其中的原因未知。 49还发现周期拉伸应变有抑制 导上调细胞 核因子受体激活剂(of 其配体 作用，并且有强度和频率依赖性。 合后，通过促进分化和融合前期破骨细胞、活化或残存的成熟破骨细胞而增强骨的吸收。近年 0等分别对对兔椎间 盘纤维软骨细胞以 用和不同强度、频率、加载时间的拉伸应力研究发现，在有致炎因子和无致炎因子的条件下，在 率、 6%拉伸强度对纤维软骨细胞具有最大的抑制基质代谢作用。由此可见未来的重点应该更关注周期拉伸应变在何种强度、频率、持续时间下可以产生对抗炎症因子的治疗作用以及应用于创伤性损伤的治疗。 不同力学加载方式与纤维软骨生物力学的关系 伸力与纤维软骨细胞生物力学的关系 关节软骨主要承受压缩力，而纤维软骨在其正常生理环境中承受着明显的拉伸应力。拉伸力对纤维软骨细胞生物合成至 关重要。 51对半月板细胞的内侧和外部细胞施加双轴拉伸力，结果显示一氧化氮和总蛋白含量增加，显示内侧和外部细胞对拉伸力在生物合成和基因表达有相同的反应。纤维软骨细胞在应对生理范围内的机械信号通过合成胶原、蛋白聚糖类和弹性蛋白，从而完成其缓冲的功能。同样胰岛素样生长因子 (促进纤维软骨细胞胞外基质合成和修复功能， 2用生物兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 6 物理拉伸设备以 3%和 20%的强度分别加载于鼠 节盘纤维软骨细胞，结果显示 体（ , 胰岛素样受体基质 1（ 胰岛素 样结合蛋白 3（ , 胰岛素样结合蛋白 5（ , 基因表达受到抑制，并且高强度拉伸较低强度而言有更强的抑制作用，由此可见持续生物物理拉伸下调 统的表达，并可能通过此作用降低纤维软骨的生长和修复潜能。这些细胞在拉伸力作用下的生物化学转变，预示其可以成为组织工程中的潜在刺激参数。 缩力与纤维软骨细胞生物力学的关系 压缩力也是纤维软骨组织主要承受的一种力。 53通过对半月板纤维软骨细胞实验发现 :动态压缩力对抗 导产生的致炎作用，预示通过关节负荷物理治疗，可能成为对关节损伤治疗的一种方法。而骨关节的特点是致炎因子含量增加（如前列腺素 一氧化氮） ,4等证实动态压缩力在 间增加 了前列腺素 一氧化氮的含量，并且产生量依赖于压力强度和半月板的区域，内部较外部产生前列腺素以抑制机械力诱导产生的一氧化氮，暗示改变关节的负重部位和强度可能减少炎症介导因子的产生 。明确力传导机制能帮助阐明纤维软骨细胞保持组织健康或损伤后的愈合反应。 55以细胞压缩装置对单个软骨细胞、内侧半月板细胞、表层半月板细胞以及韧带细胞非限制性压缩，并对细胞进行了一系列的假设，结果此四种细胞中关节软骨细胞刚度最大，其次分别是外部半月板细胞和内侧的半月板细胞， 韧带细胞与半月板细胞的刚度无显著差异但显著低于关节软骨细胞，四种细胞的近似泊松比相互之间没有统计学差异；作者还通过免疫荧光染色发现半月板纤维软骨细胞的骨架染色与韧带细胞类似，但是与软骨细胞的骨架染色差异很大，提示细胞的生物力学性质可能与组织的起源有关。这些研究提示也可以通过其它技术手段，获得并对比纤维软骨细胞的生物力学性能。 切力与 纤维软骨细胞生物力学的关系 普遍认为钙离子浓度可以调节细胞中蛋白质的含量。 56运用流动腔技术，震荡流体流动对细胞产生剪切力，结果增加了纤维软骨细胞 内的钙水平和硫化糖胺聚糖的含量，推测可能是由于钙调节纤维软骨细胞的生物化学通路导致了硫化糖胺聚糖含量的变化，这与 57得出震荡流体流动兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 7 力可以调节软骨细胞胞质中钙离子浓度的结论相一致，之前的研究表明钙离子的增加是半月板纤维软骨细胞流动力的瞬间反应 58。 59发现低渗压诱导 瞬间增加并伴随细胞 断裂，不明确是否有剂量依赖性，可成为未来这方面实验研究的重点。当关节在行使功能的时候，可以在细胞表面引起间质的震荡，从而影响蛋白的合成。现在实验中所用的剪切力是否在生理范围内，用于实验的系统是否可用于理解体内的细胞行为，这些问题亟待解决。 机械力学刺激对 达影响的研究 为细胞提供主要力学支撑的是细胞骨架，细胞骨架是细胞中重要组成部分，由大量肌动蛋白丝组成，形成贯穿于细胞质和细胞核的蛋白纤维网络体系。细胞骨架包括微管、微丝和中间丝三种成分，分别与细胞质膜上的蛋白质脂质分 子相互连结从而成为细胞运动、细胞形态和跨膜信息传递的结构基础 60。微丝主要由肌动蛋白构成，参与保持细胞形态和细胞间紧密连结，同时它还与细胞外基质的黏附相关。当微丝解聚时以 聚合时以 常 正常细胞内微丝的解聚和聚合的相互变化以及互相平衡是细胞运动分裂增殖和黏附的重要调节因素 61。肌动蛋白纤维与跨膜分子相连，是跨膜力传递的主要环节，中间丝是单体蛋白分子，在整个骨架重建中处于被动但不容忽视的地位，骨架系统与细胞各 成分、各部分的相互作用产生稳定的细胞内张力状态，是细胞赖以生存、分化和生长的重要内部力学环境 62。 细胞骨架在受到应力刺激后可发生复杂的形态改变及生化改变，有学者研究表明周期性机械应变力作用下细胞骨架可以发生重排 63。学者们研究了不同力学加载模式对 影响，发现在机械力的作用下 排列发生改变，邓银栓 64等以不牵伸载荷作用于肌腱细胞，选择的牵伸强度分别是4%、 8%、 12%；时间为 2、 4、 8、 12、 24h；频率是 果发现不同的牵伸载荷条件可以引起体外培 养的肌腱细胞 断裂、解聚，并且断裂、解聚与载荷时间及应力强度呈正相关。然而在对静压力和剪切力对成骨细胞 影响的研究中，发现静压力作为一种类似生理状态的力与剪切力相比较，对细胞的形态与 影响较轻 65。同样是作用于成骨细胞 应力实验表明 66，在机械力作用下微丝趋于解聚，然而在去除机兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 8 械刺激后，随时间延长，解聚的微丝发生了重聚现象，表明细胞骨架在受力后发生的改变是可以恢复的。 综上所述，目前尚未见到有关周期静水压对山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞 未见 静水压合并生长因子联合作用对 基于以上研究，因此，本课题通过实验就以下三个问题进行研究： (1) 研究 (2) 静水压对自然山羊 3） 静水压联合自然山羊 明确静水压和 而为静水压力和 依据。 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 9 第二章 山羊 细胞 达的影响 颞下颌关节盘是位于下颌髁突和颞骨关节窝之间的纤维软骨样组织，是颞下颌关节 行使功能的主要组成部分，以关节盘变薄、透明样变和穿孔等不可逆性病变为特征的重度 患者的进食、说话带来了困难和痛苦，长期以来没有很好的治疗方法，是目前口腔临床面临的疑难问题之一，近年来组织工程技术的发展为临床修复损伤和病变的关节盘提供了一种新的治疗方向。 为组织工程中一种常用的生长因子，在促进细胞增殖、细胞外基质等多方面起到了积极用，在 达影响的研究中， 7以 用于体外单层培养的软骨细胞，结果发现实验组的细胞骨架的荧光强度较对照组明显增加，并且 预组的细胞的力学性能明显增加，支持为细胞提供主要力学支撑的是细胞骨架这一观点，并推测 起的变化可能与生长因子受体与黏附斑之间的信号交联的相互作用相关。所以本实验选用课题组 68选用的浓度为 10ng/ 单层培养的纤维软骨细胞进行干预，初步探讨 软骨细胞 实验材料 主要试剂 高糖 养基 (国 )； I 型胶原酶 (国 )； 胰蛋白酶 (国 )； 国）； 国 ）；抗坏血酸维生素 C(国 )；非必需氨基酸 (国 )；胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料研究所 ,中国 )； 国）；型胶原兔多克隆抗体 (博奥森，中国 )； 奥森，中国）； 北京中杉金桥生物技术有限公司 )； 北京中杉金桥生物技术有限公司，中国 )；吐温 、各级乙醇 (天津化学试剂有限公司，中国 )；苏木素（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）；二甲苯 (西安化学试剂厂，中国 )；氯化钠 (天津化学试剂有限公司，中国 )；青霉素、链霉素 (华北制药股份有限公司 ,中国 ) 主要仪器 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 10 超净工作台 (苏州净化设备厂，江苏 )； 置相差显微镜 (本 )； 二氧化碳恒温培养箱 (国 )； 子分析天平 (赛多利斯天平有限公司，北京 )； 本 )； 式离心机 (上海安亨科学仪器厂 )； 温 烘烤箱 (德国 )； 本 )； 动 台式灭菌器 (山东新华医疗器械股份有限公司 )； 79力加热搅拌器 (江苏环保仪器厂 )； 电热恒温鼓风干燥箱 (上海义恒科技有限公司 )； 516温 气浴摇床 (美国 司 )； 数控超声洗清器 (昆山市超声仪器有限公司 )； 温水浴锅 (江苏金坛市大地自动化仪器厂，金坛市环保仪器厂 )； 水 系统 (司，美国 )； 000激光共聚焦显微镜 (本 )； 主要器械 手术刀、持针器、咬骨钳、离心管、培养皿、眼科弯剪、眼科镊、注射器、组织镊、三角烧瓶、血清瓶、尖吸管、弯头吸管、 6 孔 /12 孔细胞培养板、刻度吸管、 50杯、磁力搅拌棒及搅拌器、 m 微孔滤膜、针头式可换膜 滤器、 100 目筛网、 100菌塑料冷冻保存管、血球计数器等。 主要试剂的配制 1高糖 养基 ：将干粉型高糖 养基溶于 700 800用三蒸水冲洗袋壁后倒入烧杯，补充到 1000力搅拌 .0 g)，继续磁力搅拌 4 6 h，调 净台内用两张 分装，贴标签 ,4存放。 2 0.2 mg/ 型胶原酶： 100 型胶原酶溶于 505%胎牛血清的 高糖 ， 磁力搅拌至完全溶解， 装至小青瓶中， 保存。 3. 4%多聚甲醛溶液：称取 4于三角烧瓶中，加入 80 的 热至 60左右，磁力搅拌使粉末完全溶解，通常需兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 11 滴加少许 1 后补足 0.1 的 00分混匀。 4胎牛血清的灭活与分装 ：保存于 的胎牛血清于 4 冰箱过夜解冻，后放入 56 恒定水浴箱中，每 5分钟震摇一次， 35分钟灭活补体后取出，于超净台中分装， 冻存 。勿直接解冻，因温度改变太大，易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 5 1%青霉素、链霉素联合抗菌液 : 在超净台内， 4理盐水加于青霉素 (80 万单位 /瓶 )瓶内，混匀； 5 理盐水加于链霉素 (100 万单位 /瓶 )瓶内，混匀后弃去 1 8 、链霉素混合液加入 72 理盐水中，分装， 冻存。 6 25 抗坏血酸维生素 C :250 坏血酸维生素 C，溶解于 100 ，完全溶解后，过滤除菌，分装， 保存。 7 取 00鲜配置的双蒸水中一般配制为 100 倍浓缩液，即浓度为 200 (g/L)，过滤除菌，分装， 储存、备用。 8 2.5 g/L 胰 蛋白酶 100l） 将 250 蛋白酶粉末搅拌混匀，在超净台内过滤除菌，然后分装成小瓶于 保存以备使用。 20 g 0分溶解后分装于 20只冻存管中，每只 1冻存。使用时再用完全培养基稀释为浓度分别为 10ng/ 10 其他溶液的配制 方法参考论文海藻酸盐囊化山羊关节盘细胞在短期压力下蛋白多糖和 型胶原 达 69。 实验方法 羊颞下颌关节盘细胞的体外分离、原代、传代培养、冻存、复苏 （ 1） 山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞的分离：实验动物为屠宰 2h 内 1月龄山羊，每只质量 10右。 1）去除易污染因素：用清水冲洗羊头，尽量去除血污和易感染因素，泡入 75%的酒精中 20 2）解剖分离：在超净工作台内，无菌条件下完整切取山羊双侧颞下颌关节盘，修剪去周围组织 ,含 100 U/霉素、链霉素的 。 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 12 3）剪碎组织 :取下的关节盘放入不含血清的高糖 菌小烧杯中，用眼科剪剪成 1.0 小的碎块后移入三角烧瓶中。 4）消化过夜：加入 5 倍体积的 I 型胶原酶， 86 转 / 37 恒温摇床中振荡消化过夜。 5）细胞收集：收集消化液， 1300 x8 去上清。再后用无血清的 养液离心漂洗 2 3 次（ 1000 ，去除上清。 6）制成细胞悬液：用含 15% 胎牛血清的高糖 养液 (含 15% 胎牛血清、 100 U/、链 霉素， 25 抗坏血酸 )中将细胞团吹打均匀，制成细胞悬液。 （ 2）山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞的原代培养 将收集的细胞悬液以 2 105 密度接种于 100胞培养瓶中 , 于 5% 和湿度、 37 恒温箱下培养， 48 h 后半量换液 , 以后隔日换液并逐日在相差显微镜下观察细胞生长情况并照相记录，记录好细胞种类、代数、放大倍数、时间等。 （ 3）山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞的传代培养： 待细胞长满培养瓶底 80%左右，用 蛋白酶消化，在镜下观察胞质回缩、细胞间隙增大后立即加入等量含血清的培养 液中止消化，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，收集细胞悬液，低速离心 (800 5 计数，按 3:1 比例传代，按上述条件继续培养。 （ 4）山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞的冻存 1）胰酶消化 :致密度为 80 90% 的对数生长细胞，冷冻前一日全量换液， 胰蛋白酶消化后计数 ， 1000 心 5 2）细胞冻存：倾除上清，加入配制比例为培养基：血清： 5:4:1的冻存液，冻存液中细胞的最终密度为 5106 1107/装入无菌冻存管，每只加入 1 1.5 存液。 3）标记：冻存管上写明细胞的名称、冻存时间等信息。装入已做标记的小袋或支架同时做好记录。 4） 4 ：拧紧冻存管口，封口膜封闭，胶布封固，棉花包裹后放入 4冰箱，约 1h。 5） ：接着置于 冰箱，约 1h。 6） ：然后再放入 冰箱中，保存备用。冻存后在短期内复苏，观察细胞对冻存的适应性。 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 13 （ 5） 山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞的复苏 从冻存小袋内取出冻存管后，直接投入 37 温水浴中，轻轻摇动令其内容物尽快融化，移入无菌操作台内，酒精擦拭后，吸出细胞悬液于离心管并滴加 10 倍 以上培养液，混合后低速离心 (800 5除去上清液，再用培养液洗一次， 2%台 盼蓝测定细胞活力，继续培养，次日更换一次培养液。 纤维软骨细胞 、 型胶原免疫组化鉴定 （ 1） 型胶原免疫组化 1) 将贴满细胞的盖玻片放 洗 2 遍，加入 4%多聚甲醛固定 30 2) 取出细胞爬片 两遍。 3) 3%离子水孵育 5消除内源性过氧化物酶活性。 4) 蒸馏水冲洗， 泡 5 5) 滴加山羊封闭血清，室温孵育 10去，勿洗。 6) 滴加 抗体： :100）， 4 过夜。 7) 洗， 33 次。 8) 滴加山羊抗兔 温孵育 10 9) 洗， 33次。 10）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育 10 11） 洗， 33 次。 12)显色剂显色 2 13)自来水充分冲洗。 14)苏木精复染，梯度酒精脱水， 1%盐酸乙醇分色 8s。 15)二甲苯透明 15 16)中性树胶封片。 （ 2） 型胶原免疫组化 1）将贴满细胞的盖玻片放 洗 2 遍，加入 4%多聚甲醛固定 30 2)取出细胞爬片 两遍。 3)3%离子水孵育 5消除内源性过氧化物酶活性。 4)蒸馏水冲洗 ， 泡 5 5)滴加山羊封闭血清，室温孵育 10去，勿洗。 6)滴加 型胶原兔抗多克隆一抗（抗体： :75）， 4 过夜。 7)33 次。 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 14 8)滴加山羊抗兔 温孵 10 9)33 次。 10)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育 10 11)洗， 33 次。 12)显 色剂显色 2 13)自来水充分冲洗。 14)苏木精复染，梯度酒精脱水， 1%盐酸乙醇分色 8s。 15)二甲苯透明 15 16)中性树胶封片。 细胞 达的影响 1、取体外单层混合培养二代、三代颞下颌关节盘贴壁细胞，用含有10ng/完全培养基对细胞进行培养。 2、分别在 24h 和 72h 将干预后的贴壁细胞以及各组相应的空白对照组，以 行染色，然后激光共聚焦显微镜观察变化和表达情 况。 3、山羊 细胞 疫荧光染色：各实验组细胞干预处理结束后吸除培养液后， 漂洗细胞三次， 4%多聚甲醛室温固定 30三次，随后以含 1% 闭 40后加入 5 g/作液室温孵育 1h，之后以 洗四次。滴加抗荧光淬灭封片剂上机观察。 4、分组：将生长因子组命名为 C 组 ,完全培养基组命名为 实验结果 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察酶消化法获得的纤维软骨细胞 24h 内 可以贴壁，经过 3 4d 到达对数期，第 7d 进入平台期，细胞在对数期可以进行传代培养。图（ 原代贴壁细胞多为长梭形即纤维样细胞，其他的多角形、圆形的是软骨样细胞。原代细胞传代后二、三代细胞生长良好，细胞形态稳定，细胞伸展呈扁平状。 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 15 图 消化法体外关节盘细胞培养 A：原代细胞，细胞逐渐从组织中爬出，以多角形为主，呈立体状 （ ； B： 混合培养的细胞，细胞以长梭形、多角形为主，细胞铺展呈扁平状（ 。 关节盘细胞 I、 胶原免疫组化染色结果 对混合培养的二、三代贴壁细胞分别进行，可见，细胞形态呈铺展状，单层培养的 细胞中， I 型胶原免疫组化胞浆内见棕黄色颗粒为阳性染色；单层培养的 细胞中， 型胶原免疫组化图片，胞浆内见少量浅棕黄色颗粒为弱阳性染色 (见图 细胞 达的影响的结果 细胞骨架 绿色荧光样物质，在 24h 时候， C 组的荧光强度较对照组明显增强 (P 见 图在 72h 时 C 组的荧光强度与较对照组相比无统计学差异 (见图 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 16 图 、 免疫组化染色 A：单层培养的 B：单层培养的 型胶原免疫组化图片，胞浆内见少量浅棕黄色颗粒为弱阳性染色（ 图 光共聚焦显微镜 A： 24h，对照组； B： 24h， 预组； C:72h，对照组； D:72h， 预组 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 17 讨论 目前尚未见有关于关节盘纤维软骨细胞株的报道，要获得体外研究的纤维软骨细胞就必须进行原代培养 。 的基质主要是型胶原，所以本实验采用型胶原酶消化，获得大量纤维软骨细胞，实现细胞体外扩增和生长的目的。本实验中的 节盘细胞取材于当地屠宰场的幼龄山羊，实验中完整剥离了 纤维软骨，取材准确；修剪了关节盘的边缘，去除了周围多余的纤维结缔组织；在含双抗的 漂洗多次，直至漂洗液澄清，彻底去除肉眼可见的红细胞。相差显微镜下观察细胞形态、 、 型胶原免疫组化染色与其他学者 71的研究报道相一致。经过形态学观察和免疫组化鉴定，可以确定本实验所培养的细胞为关节盘纤维软骨细胞。 各 种生长因子中第一个被确认对关节软骨具有自分泌 (细胞产生因子作用于细胞本身 )和旁分泌 (细胞产生的因子作用于邻近其它细胞 )调节作用的生长因子 ,是强大的软骨细胞有丝分裂刺激剂，可促进蛋白聚糖的合成和刺激细胞的分裂增殖。蓝旭等 38研究发现， 软骨细胞的作用表现出明显的剂量 定浓度范围内的 浓度为 1围内能显著促进细胞的增殖，当浓度超过一定的数值， 糖醛酸含量不再增加，显示出一定的耐受性。生长因子作用于生长因子受体 ，通过受体信号转导系统，引起软骨细胞的增殖、分化和代谢的变化，导致最终的生物学效应的产生。有学者 77发现 10ng/适用于组织工程化 细胞自组装基体的应用，在促进细胞外基质的产生等方面产生积极作用，这也是本实验选用此生长因子及其浓度的依据。在 达的影响研究中， 67等发现以 预过的软骨细胞中 荧光强度高于对照组，这与本实验中 24h 的时候，10ng/预过的纤维软骨细胞中 增多趋势一致， 然而随时间的递增对照组中 预组中 改变没有统计学差异，有待于后期实验研究中明确其原因机制。 兰州大学硕士研究生学位论文 静水压联合 预对山羊颞下颌关节盘细胞 18 第三章 实验二 静水压合并 山羊颞下颌关节盘细胞 达的影响 颞下颌关节盘组织是位于颌面部关节窝与髁状突之间的粘弹性的纤维软骨组织，要承受周期的、反复的、动静态负荷，其组成与透明软骨不同。在对透明软骨的研究 72表明：生物力学刺激是软骨细胞生存和不断生成细胞外基质的一个基本信号，能调节关节软骨的新陈代谢活动，改变软骨细胞的生物力学 性能，被广泛认为是优化软骨基质合成克服软骨功能上障碍的有效途径，以往学者在软骨细胞实验中设计了多种不同的力学加载方案，对基质的影响不尽相同。 在人类的日常生理活动中，关节软骨承受着各种力学刺激，如压力、剪切力等，这些不同方式的力学刺激影响着软骨的生长代谢。其中在人体关节软骨所受到的各种力学刺激中，压力是最主要的，原因是压力在人体关节运动中的出现频率和作用时间占主要地位。而关节盘压缩模量的大小从数十千帕到数十兆帕不等，数据差异明显，原因可能与应力大小、种属原因、振幅、试验应变率以及频率等因素有关，颞下颌关节盘 在体内除了承受上面提到的各种力学刺激，还会受到关节腔内产生的静水压作用 70。 通过实