【毕业学位论文】（Word原稿）PIN1基因单核苷酸多态性与慢性肾脏病的关联分析PIN1基因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用

兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 略 词 表 缩略词 英文全称 中文 全称 性肾脏病 继发性甲状旁腺功能亢进 甲状旁腺激素 血管疾病 肽酰脯氨酰顺 /反异构酶 嘌呤尿嘧啶丰富的元 素 编码区 腺嘌呤尿嘧啶丰富的元素 结合蛋白 1 同源剪接调控蛋白 小等位基因频率 AD 尔茨海默氏病 合酶连反应 制性内切酶片段长度多态性法 联免疫吸附剂测定 小球滤过率 K/脏病生存质量指导 核苷酸多态性 迪 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 1 前言 随着发病率的逐年上升，慢性肾脏病 （ 已经 成为 全球性的公共卫生问题之一。 继发性甲状旁腺功能亢进（ 是 者常见并发症之一，其特征是甲状旁腺激素 (平 升高 1，临床主要表现为钙、磷代谢紊乱。 且对于心血管系统、免疫系统、造血系统、神经系统和内分泌系统如心肌细胞、胰腺细胞、胸腺细胞、肝细胞、脂肪细胞及肾脏均有不同程度的损害 2。近年研究表明， 平异常与透析前 者和肾功能正常者 心血管事件 （ 的发生率 有 显著的相关性 3在患者中， 平升 高是该类患者 件的独立危险因素 3。另外，在长期透析患者中发现持续的 平升高不仅导致严重钙磷 代谢紊乱，而且增加 发病率和死亡率 6因而，防治 升高无疑对 延缓 防 肾性骨病的发生有着非常重要的意义。 肽酰脯氨 酰 顺 /反 异构酶 （ , 是肽基脯氨酰同分异构酶家族成员之一，最早在酵母双杂交中发现，是第一个被确定对酵母和人类细胞分裂均有作用的同分异构酶， 是唯一的哺乳动物特异性的催化丝 /苏 顺 /反异构化的酶 9 具有高度保守性和特异性 。 以特异性的同磷酸化的丝 /苏 酸基因序列结合，通过催化顺 /反异构酶的肽键，从而改变其生物活性和磷酸化 11。 化 的 构象 变化 对 许多 磷酸化信号途径产生 深远影响 12 因 研究多见于肿瘤领域， 因 及其下游基因或蛋白可作为肿瘤发生、发展的标志，为肿瘤的诊断及预后判断提供帮助 ，是肿瘤很好的预测因子14近年研究发现 稳定性有一定的调节作用 16。 而各种达的关键要素腺嘌呤 尿嘧啶丰富的元素（ 属于顺式作用元件家族 17，主要存在于 编码区（ ，其与反式作用蛋白共同调节 稳定性和翻译 18。 报道 提示 合蛋白相互作用， 可 异构化调节 胞因子 19 并调节细胞内 翻译和降解 21 定性主要是由合蛋白与 互作用而调节的 23 结 合蛋白有两种：腺嘌呤尿嘧啶丰富的元素结合蛋白 1（ , 和 K 同源剪接调控蛋白兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 2 （ 23,26。 衰变促进因子27而 要是增加 稳定性 29 定性的调节是通过 变因子 互作用实现的。 性的。顺反异构化的脯氨酸粘附于 得磷酸化的 点暴露， 其相互作用导致磷酸化，激活 化的 互作用使其降解增加、编码减弱。而 视为 争性的拮抗剂，其与 合增加 定性，抑制 解，增加 平， 最终使得 血清中 平升高。 研究发现在 因敲除 小鼠中血清 平升高，而未发现血清钙和磷的变化，表明在体内 定基础的 表达 32。 33研究发现在低钙饮食诱导的 鼠模型或腺嘌呤诱导的 鼠模型中甲状腺中 活性是降低的。由于 性 降 低，去磷酸化的 活化 数量减少，可与 合的数量减少，直接导致 合蛋白的结合率降低，使 解减少；间接使得 与 合 作用增强， 增加 半衰期和稳定性， 增加了 平， 使更多的 核 糖体中合成，最终导致 综合文献，我们发现 定性 有 调节 作用，当 因低表达或不表达时， 性 降低， 去 磷酸化的 合到 域的数量 减 少 ， 半衰期和稳定性增加，使 成 增多最终 导致 因而，我们有理由相信 录翻译过程中起了至关重要的作用。 定性的关键调节者 16,33 发病机制中有一定的作用。 目前 ， 仅零星报道了 因单核苷酸多态性（ 肿瘤 的 相关研究， 尚无 因 的作用机制的研究 ，更无 度的相关研究 。 探讨 因 控 关系如何， 可能成为 究的热点。为此，我们通过对 者和健康患者进行 因启动子 区 测序分析，比较两者 因突变情况，然后 分析血 浆 因启动子区 各临床指标 间的 相关性。由此揭示 因启动子 区 遗传变异在 的作 用，并为早期预防、延缓 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 3 技术路线图 因单核苷酸多态性在 的 作用 以上述 六 组人群模板， 因 血浆 因 启动子区多态性及 生发展的相关性分析 测基 因型 测序验证； 件分析 期 对照组 期 期 采用 定血 浆 浓度 相关临床指标的测定：如血清 P、，及尿肾功 、24h 尿蛋白定量 等。 件 分 析 因 启动子区 多态性与 生发展的关联分析 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 4 第一部分： 因单核苷酸多态性与慢性肾脏病的关联分析 目的： 探讨 因 的作用， 为早期预防、延缓 进展 奠定 理论基础。 方法： 提取 252 例病例组 和 61 例对照组血 标本 基因组 并通过核酸定量仪检测 度和纯度；参考 据库，选取 最小 等位基因频率（ 5%的常见多肽点， 从 因启动子区选出1 个潜在性功能位点进行研究： 态性分析。 法分析基因型，扩增 点在内的片段，采用限制性内切酶 切，根据酶切片段长度判断结果。采用双盲法原则由两名实验员判断结果并记录；同时，选取部分样品进行测序，验证 因型鉴定 的 结果。利用 件分析 不同 基因型与 关系。 结果 1. 因启 动子区 基因型及等位基因 频率与对照组比较均 有统计学意义（ 态性与 发生具 有相关性。 2. 因启动子区 位点 T 等位基因频率高于对照组（ 态性与 进展有关。 结论： 因启动子区 多态性与 发生 、发展 有关。 变异基因可能是 易感因素。 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 5 对象和方法 一研究对象 1材料与对象 例来源 收集 2012 年 1 月至 2012 年 12 月在兰州大学第二医院肾病科住院的非透析者 252 例，其中男性 138 例，女性 114 例，平均年龄 。 002 年 K/南 35，具体如下： 指肾脏损害和 /或 0 ml/续至少 3 个月。其中肾脏损害的标准包括肾脏病理学检查的异常，或者能够反映肾功能损害的实验室检查指标 (如血、尿成份或影像学检查 )的异常。入选的 252 例 者原发病情况如下：慢性肾小球肾炎 105 例，其中 病 24 例，局灶节段性硬化性肾炎 11 例，轻微病变性肾炎 13 例，系膜增生性肾炎例 16 例，膜性肾病 16 例，病理不详 25 例；慢性小管间质性肾炎28 例；高血压肾病 35 例；糖尿病肾病 38 例；狼疮性肾炎 18 例；过敏性紫癜性肾炎 16 例；其它包括多囊肾、梗阻性肾病等 12 例。 康对照来源 从本院体检中心随机纳入 61 例性别、年龄相互匹配的健康志愿者作为对照，其中男性 31 例，女性 30 例，平均年龄 。本实验经兰州 大学第二医院伦理委员会批准同意，每位受检者（对照组和病例组）均 签署知情同意书，并抽 取 5周血液供相关数据检测。 除标准 1）年龄 T F: 5， 3， R: 5， 3， 296应体系 （见表 4） 表 4 应体系 成分 用量 uM NA 总体系 2060州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 9 6. 酶切反应体系 （见表 5） 表 5 切酶体系 成分 用量 物（含 ） 0总体系 1069、实验方法 指某一人群基因组内特定核苷酸位置上存在不同碱基， 在基因组中具有高密度和遗传稳定性的特点 且其在群体中的分布频率均不低于 1，包括单个碱基的转换，缺失和插入 。按其发生的位置和是否引起氨基酸残基改变分为编码区 非编码区 前者引起氨基酸残基改变者称为非同义突变，不引起氨基酸残基改变者称为同义突变，而后者虽也不引起 氨基酸残基改变，但可能位于启动子区域影响基因转录，促进或抑制蛋白表达。 因位于人染色体 19D: 5300。参考 核苷酸多态数据库 ()，选取 的常见多态位点，我们在因启动子区选出 1 个常见单核苷酸多态位点： 其位于 因 5， 端 （以起始密码子 A 为 +1）。 据库显示 点 为 ， ， 基因型 在中国人 群中的 频率分 别为 目前，国内外仅 研究报道了 因启动子区该位点多态性与肿瘤的发生有一定的关联，而未见到任何文献报道该位点与 关联。因此，我们筛选 做为 因启动子 区 可能的功能性变异位点进行多态性与关联性分析。 2. 基因组 制备 本采集 抽取受检者清晨空腹外周静脉血 5入到 凝管中轻轻混匀，分装 3血冻存于 ，待统一提取基因组 余 2血 1000心15行分装 ， 并将 血浆 标本放于 保存 。 解冻后的 血浆 样本需再次离心，然后检测。 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 10 取方法 标本解冻，按 式血液基因组 提 试剂盒（上海生工）说明书提取基因组 体操作如下： 1) 取 300抗凝剂的血液，加入 750 分混匀，室温放置 1至红血球完全裂解，此时液体为透明红色 。 2) 12000心 20上清，用 悬沉淀，高速离心清洗沉淀 2次，最后将离心管倒置室温干燥 2 3) 加入 1800，震荡混匀 1于 65温浴 20或混匀。 4) 加入 200D 分混匀。产生沉淀者， 70温浴 10 5) 加入 200水乙醇，充分颠倒混匀。 6) 将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中，静置 212000 心 3掉收集管中废液。 7) 将吸附柱放回收集管中，加入 500 W 10000 心 1掉收集管中废液。 8) 将吸附柱放回收集管 中，加入 500 10000 心 1掉收集管中废液。 9) 将吸附柱放回收集管中， 10000 心 2 10) 将吸附柱放入干净的 心管中，在吸附膜中央加入 50热（ 60）的 置 510000 心 1所得到的 20保存 。 度和纯度检测 使用德国 司生产的 131 蛋白核酸定量仪测量度和浓度。经 测量， 均浓度为： 65ug/ 度 3引物的设计 因的序列来自于 D: 5300。扩增的引物采用 件设计，由上海生工公司进行引物合成。引物序列不含 点，扩增片段包含待测的 点。引物具体信息见表 3。 4. 应 增产物为 296 剂盒购于 40。 应条件见表 6。 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 11 表 6 应条件 反应温度 时间 预变性 94 变性 94 退火 55 延伸 72 终延伸 72 555 375. 物琼脂糖凝胶电泳的鉴定 应结束后， 运用 琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。具体操作如下： 1) 制胶：取 琼脂糖粉置入烧瓶中，加入 100缓冲液，配浓度为 凝胶，并微波炉中加热至琼脂糖粉完全溶解。 2) 灌胶：待凝胶温度降至 50左右，加入 3B 液，混匀后缓慢倒入胶模中，凝胶的厚度为 3速的插入梳子，尽量避免气泡的产生，置常温下凝固。 3) 待凝胶完全的凝固后，将梳子移去，将制备好的凝胶放置于电泳槽中。 4) 向电泳槽中 缓冲液，液面需高过胶面。 5) 将 增产物 5入加样孔中，以 20 对照， 鉴定条带。 6) 电压 80V，电泳 30 7) 在紫外仪 下观察 带，并用凝胶自动成像系统拍照。结果见图 1。 图 1 因 增片段 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 12 6. 基因分型（ 酶切体系见表 5， 37 水浴 16h 后离心。酶切产物采用 3%的 琼脂糖凝胶，电压 160 伏，电泳 30凝胶系统拍照后，分析鉴判断基因型。 三种基因型分别为： 为纯合子，仅有 296个片段； 为杂合子，含有296213 83个片段 ； 为纯合子，含有 213 83片段，见图 2。 图 2 因启动子区 3 种 基因型酶切结果图 1， 2 为 ； 3， 4 为 ； 5， 6 为 7. 因 哈迪 验 称遗传学平衡定律， 是指 在没有进化影响下基因一代一代传递时，群体的基因频率和基因型频率保持不变 。 即随机交配一代以后基因型频率将保持不变： 示 因型的频率， 示 因型的频率， 2示 因型的频率，其中 p 是 A 基因的频率， q 是 a 基因的频率。那么基因型频率之和应等于 1，即 pq+(p+q)2 =1。 序（ ）分析 667CT 衡， 对照组观察值与对照组预期值基因型分析频率无统计学意义（ P即 因 基因型分布符合 见表 7。 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 13 表 7 因 衡 对照组预期值 对照组观察值 8 8 P. 测序验证 果 随机从病例对照中分别选取 30 例样本， 物送上海生工 生物工程 公司测序，其结果与 法鉴定结果一致 ， 见图 3。 A B 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 14 C 图 3 测序确定 667CT 基因型： A) ； B) ； C) 。 三、统计分析 采用 计软件数据 。 基因频率按 衡定律 计数，基因型及等位基因频率比较采用四格表资料的 2检验。 计量资料采用 均值 标准差描述， 计数资料以频数和百分比表示。 ， 见表 1图 1各组在原发病方面亦无统计学差异（ P。 表 1与 对照组的 基本 资料 项目 对照组 （ 61 例） （ 49 例） （ 43 例） （ 41 例） （ 48 例） （ 71 例） （ 252 例） 性别（男 /女） 年龄（岁） 最小年龄（岁） 最大年龄（岁） 慢性肾小球肾炎 慢性间质性肾炎 高血压肾病 糖尿病肾病 狼疮性肾炎 过敏性紫癜性肾炎 其他 31/30 0 68 - - - - - - - 27/22 9 65 16 6 5 5 6 9 2 20/23 0 76 23 5 3 4 4 4 0 28/13 0 86 21 4 6 6 1 0 3 25/23 2 86 16 8 9 12 2 0 1 38/33 8 85 29 5 12 11 5 3 6 138/114a 8 86 105 28 35 38 18 16 12 与对照组比较， 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 16 图 1发病的构成情况 2 因启动子区 基因型及等位基因频率在对照组和 中的比较 对照组与 因启动子区 基因型频率 比较 对照组与 因启动子 区 的 3 种基因型 （ ， T 型） 在对照组中 分别 为 而 在 两者之间存在显著性差异 (态性与 发生可能 有关。 表 2照组与 因启动子 区 基因型频率比较 对照组 n=61(%) n=252(%) 8(29(8(198(25(T 43(223(因型频率比较 A：对照组； B： 对照组与 因 启动子 区 等位基因频率 比较 按 衡定律计算两组 因 启动子 区 等位基因频率， 结果见表 2 2 T 等位基因 明 显 高于对照组（ 态性与 发生有关， 异 基因可能是 生 的易感因素。 其次， 和对照组中 C 等位基因频率（ 高于 T 等位基因频率 (这与资料显示的中国人 等位基因频率相符合。 表 2对照组与 因启动子 等位 基因频率比较 对照组 n=61(%) n=252(%) C 74(256(T 48(248(位基因频率比较 （ 因型及等位基因 频率 在对照组和 各组间的比较 因启动子 区 基因型 频率 在对照组和 各组间 的比较 因启动子 区 基因型 （ ， 和 ）频率在 对照组 的 比较 情况见表 3 3中， 在 ， 2期， 3 期， 4 期及 5 期中的百分比分别 是 而 T 基因型频率在 至 中的百分比分别是 ， 2 期 ， 3 期 ， 4 期 及 5 期 因 启动子区 基因型频率与对照组比较 均 有统计学意义（ 态性与 进展有 关 。 因 启动子 区 等位基因频率在对照组和 各组间 的比较 因启动子 区 等位 基因 频率在对照组与 各组间 的 比较情况 见表 3 3 ， 2 期 ， 3 期 ， 4 期 及 5 期 因 启动子区 等位基因频率与对照组比较 均 有统计学意义（ 点 T 等位基因频率有增加趋势 。说明 因启动子 区 位点 T 变异基因与 进展有关。 表 3因启动子 区 基因型及等位基因 频率 在 对照组和 各组间 的比较 对照组 （ n=61） N(%) （ n=49） N(%) (n=41) N(%) （ n=43） N(%) (n=48) N(%) (n=71) N(%) 基因型 T T+位基因 C T 18( 38(5(43(74(48(5(a 41(a 3(a 44(a 51(a 47(a 5(a 29(a 7(a 36(a 39(a 43(a 6(a 36(a 1(a 37(a 48(a 38(a 6(12.5)a 35(a 7(a 42(a 47(a 49(a 7(a 57(a 7(a 64(a 71(a 71(a 与对照组 比较， 因型频率在 对照 组与 各组 间 的比较 （ 因频率在 对照 组与 态性 在不同人群中具有保护作用。 因多态性与 阿 尔茨海默氏病（ 系报道不一， 43通过大样本对 因 析后认为 态性与 关联，说明 因并不增加 病的风险。其结果与 44报道的 因启动子 区 基因型有一个高风险的 生率且 与 正相关的结果完全相反。 目前，我们查阅国内外大量文献，未曾发现关于 因 启动子区多态性在慢性肾脏病中的相关研究。 基于上述理论依据，我们推测 因 启动子区多态性 可能通过改变 性和表达，进而影响 稳定性，使 终形成 疑 生、发展中起重要作用。因而，我们假设 因 启动子区 多态性与 生、发展有关。本部分 研究通过检测 因启动子区 基因型及等位基因的分布频率，分析 因 启动子区 多态性 与 能的相关性 。 本 部分 研究结果 提示 ： 1. 因启动子区 基因型及等位基因频率与对照组比较 均 有统计学意义（ 态性与 发生具有相关性 ，位基因可能是 易感因素 。 2. ， 2 期 ， 3 期 ， 4 期 及 5 期 因启动子 区 基因型 及等位基因 频率与对照组比较 均有 统计学意义 (随着 进展， 异基因型（ 和 ）和T 等位基因频率均呈逐渐上升趋势， 说明 因启动子 区 多态性 与进展有关。 综上所述， 因启动子区 多态 性与 生 、发展有关 。异基因可能是 易感因素。 本部分 研究 存在一些不足，该课题基于病例 例皆来源于我院，而对照全部来自于我院体检中心，难免会发生选择偏倚，为尽量减少偏倚，扩大样品量是最佳方法。 其次，未检测与 合的两种结合蛋白的浓度。 在今后的工作中，一方面通过扩大样本量继续进行入组者的 因多态性的研究 以及检测结合蛋白的浓度，必要时对 两种结合蛋白兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 23 基因测序； 另一方面需进行基因变异的生物学功能实验（报告基因、 以确定所发现基因变异的分子生物学功能机制，并进一步探索 因突变与生、发展 的具体作用 机制，为 基因靶向治疗提供依据。 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 24 小结 1 因启动子区 多态性与 发生具有相关性 ， 位基因可能是 易感因素 。 2 随着 进展， 异基因型（ 和 ） 和 T 等位基因频率均有 逐渐上升趋势，说明 因启动子 区 多态性与 进展有关。 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 25 第二部分：血 浆 平与 慢性肾脏病的关系 因启动子 区 多态性 与 发生、发展有关。本研究的第一部分显示： 者 T 等位基因频率高于对照组， 异基因型（ 者中的频率亦高于对照组，说明 因启动子 区 点多态性与 发生有 关 ， 异基因可能是 易感因素 ； 因启动子 区 基因型 及等位基因 在 各组 与对照组的比较中均存在显著差异，并 且发现 随着 进展， 异基因 型（ 和 ） 和逐渐上升趋势 ，说明 多态性与 因位于 19码的核蛋白 由 163 个氨基酸残基组成的，它是一种高度保守的，特异的功能蛋白，特异性的催化磷酸化的丝 /苏 种磷酸化后的异构导致底物蛋白构象改变，从而调节其功能。TH 活 化的 互作用，使 解增加， 因表达减少，血清 中 平降低。 而 争性的拮抗剂，其与 合增加 定性，抑制 加 平，使 因表达增多，血清 中 平升高。 研究显示， 与多种信号通路的调节，且在许多肿瘤中高表达，但 33研究发现 低钙饮食诱导的 鼠模型或腺嘌呤诱导的鼠模型的甲状腺中低表达。然而， 度 在 者中的 水平 如何，其与 者各 临床指标 及 因多态性 关系如何，国内外文献均未见相关研究报道。因此，本 部分 研究通过分析 者血浆 度 与 关系，初步探讨 生、发展中的可能作用。 对象和方法 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 26 一研究对象 1 例来源 参见本论文第一部分 2健康对照来源 参见本论文第一部分 3排除标准 参见本论文第一部分 4分组情况 参见本论文第一部分 二、研究方法 1. 血标本的采集及实验室指标的测定 标本的采集 血浆 标本 的 收集及保存参见本论文第一部分 验室指标的测定 血尿素氮、 血肌酐、尿酸、钙、磷、镁等指标由我院生化室采用自动生化仪检测；尿肾功 、 24h 尿蛋白定量 由尿液分析仪检测； 检测采用 别购买试剂盒。 2. 实验原理 本实验采用生物素双抗体夹心 。本法使用特异性的抗体包被于固相载体，洗涤后加入含有抗原的待测样品，如果待测样品中有相应的抗原存在，其便可与包被固相载体上的特异性的抗体相结合，经保温、孵育、洗涤后，即可加入酶标记的特异性的抗体，再经孵育、洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。 3. 仪器设备及试剂 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 27 要仪器设备 (见表 1) 表 1 主要仪器设备 仪器名称 产地 高速 离心机 德国 电热水浴恒温箱 余姚捷达温度仪表厂 普通冰箱 （ 4 /） 本 全自动酶标仪 00, 美国 震荡仪 北京京辉凯业科技有限公司 多通道移液器 德国 20量可调加样枪 德国 200量可调加样枪 德国 100排微量加样枪 德国 要试剂（见表 2） 表 2 主要试剂 试剂 数量 成分 人蛋白（肽酰脯氨酰顺 /反异构酶） 合 1(（武汉华美） 96 孔 /盒 酶标板（ 12 条 8 孔），标准品（ 2 瓶，冻干粉），生物素化的抗 体（ 120），辣根过氧化物酶标记亲和素（ 120），生物素标记抗体稀释液（ 10辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (10样本稀释液 (20浓洗涤液(20底物溶液 (10终止液 (10板贴(4 张 ) 人甲状旁腺激素 （ 汉华美） 96 孔 /盒 酶标板（ 12 条 8 孔），标准品（ 2 瓶，冻干粉），生物素化的抗 体（ 120） ，辣根过氧化物酶标记亲和素（ 120），生物素标记抗体稀释液（ 10辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (10样本稀释液 (20浓洗涤液(20底物溶液 (10终止液 (10板贴(4 张 ) 4. 实验方法 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 28 品稀释 1） 测：血 浆 样本用样本稀释液进行 1:100 倍稀释后进行检测，具体操作如下：取 10l 样本加入到 40l 的样本稀释液（ 1:5 稀释）中混匀。再从上述稀释液中取 15l 加入到 285l 样本稀释液（ 1:20 稀释）中混匀。二步完成后得到的即为 1:100 倍稀释后的样本。 2） 测：血浆 样本无需稀释。 准品的制备 1) 从试剂盒中取出一支标准品，于 6000心 30 秒。用 1本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打 5 次以助溶解，充分混匀得到标准品 置备用。 2) 取 7 个 1.5 心管 (次排列，各加入 250l 样本稀释液。吸取 250l 标准品 第一个离心管中 (轻轻吹打混匀。从 吸取 250l 到第二个 中 (轻轻吹打混匀。以此类 推进行标准品的倍比稀释。样本稀释液。 【标准品浓度】 编号 6 4 2 0 pg/100 50 25 ng/10 5 （备注： 标准品、洗液工作液、生物素标记抗体工作液及辣根过氧 化物酶标记亲和素工作液的制备方法一致，各工作液的制备方法不再分别描述。） 液工作液 兰州大学硕士研究生学位论文 因单核苷酸多态性在慢性肾脏病中的作用 29 浓洗涤液按 1:25 倍用去离子水进行稀 释。 例如用量筒量取 240离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取 10洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 物素标记抗体工作液 生物素标记抗体液按 1:100 倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。 如 1090l 生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前 10 分钟内配妥。 根过氧化物酶标记亲和素工作液 辣根过氧化物酶标记亲和素按 1:100 倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进