【毕业学位论文】（Word原稿）三氮脒温度敏感型原位凝胶注射剂的初步研制

毕 业 论 文 （本科生） 中文标题 三氮脒温度敏感型原位凝胶注射剂的初步研制 英文标题 in 生姓名 王彦军 指导教师 史彦斌 学 院 药学院 专 业 药 学 年 级 2008 级 兰州大学教务处 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 诚信责任书 本人郑重声明：本人所呈交的毕业 论文（设计） ，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。毕业 论文（设计） 中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。 除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或在网上发表的论文。 特此声明。 论文作者签名： 日 期 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 I 目 录 摘要 . . 1. 前 言 . 2. 材料 . 器 . 药 . 3. 方法与结果 . 出介质的选择 . 酸盐缓冲液 . 馏水 . 理盐水 . 氮脒体外分析方法 . 测波长的选择 . 动相的选择 . 准曲线的绘制 . 密度与回收率 . 品稳定性 . 氮脒原位凝胶注射剂的处方设计 . 白凝胶的制备 . 凝时间的测定 . 物容量考察 . 定性考察 . 外释放试验及释药机制 . 4. 讨论 . 备工艺 . 量测定 . 外释药机制 . 参考文献 . 致 谢 . 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 三氮脒温度敏感型原位凝胶注射剂的初步研制 学生：王彦军 指导教师：史彦斌 兰 州大学 药学院 甘肃 兰州 730000 摘要 : 目的： 筛选三氮脒温度敏感型原位凝胶注射剂的处方组成，考察体外释放过程，初步拟定制备方法。 方法： 以胶凝温度、胶凝时间和沉降时间为评价指标， 筛选三氮脒原位凝胶注射剂处方的组成；反相高效液相色谱法测定三氮脒含量，流动相为 l 磷酸溶液（用三乙胺调节 ）：甲醇 =58:42，流速为 测波长 370生理盐水为释放介质，小杯法进行三氮脒原位凝胶注射剂的体外释药过程，用累积释放量和释放时间数据拟合一级动力学方程、 模型方程，探讨释药机制。 结果： 空白原位凝胶注射剂的处方为： 聚糖溶解于 10 盐酸中 (3%, w/v)， 油磷酸钠溶解于 10离子水中 (18%,w/v)，混合便得。再在高速搅拌下加入适量的 三氮脒水溶液即得三氮脒原位凝胶注射剂。试制 原位凝胶 制剂的平均胶凝时间为 温放置 9d 开始出现沉降现象 。高效液相色谱分析方法的精密度、回收率及样品稳定性均达到色谱分析的要求。体外释放曲线表明连续 5d 采样测试， 三个三氮脒原位凝胶注射剂的平均累计释放率为 释药过程更接近骨架型缓释 制剂的一级释药过程，释放机制以 架溶蚀为辅。 结论： 本法制备的三氮脒原位凝胶注射剂在体温下胶凝时间较短，体外释药时间长，但该制剂为溶液剂时药物含量小，其稳定性也尚待进一步提高。该制剂进一步改进后可考虑作为畜禽慢性血液原虫病的预防性治疗药物。 关键词 ：三氮脒，壳聚糖， 度敏感型原位凝胶，反相高效液相色谱 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 in 30000 To in of in as to of l pH 8:42)as 70in as of of in 0ml 3%, w/v)，0ml of 8%, w/v)， to to in on th at of in of to of in of 7 ， in to be be to as it is in in 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 1. 前 言 随着我国国民经济的快速发展和人民物质生活水平的提高，畜牧业在国民经济总体发展中的位置日趋重要。家畜寄生虫病是危害和阻碍畜牧业生产和健康发展的主要障碍之一。近年来随着 集约化 养殖业的兴起，畜禽之间寄生虫病的传播更加凸显，群发性寄生虫病爆发的几率增加。某些隐性寄生虫病发病慢，病程长，慢性消耗动物体能，损害其生产和繁殖性能，也可致畜禽 大批死亡。据不完全统计，每年因寄生虫病给畜牧业造成的直接和间接经济损失数以亿计。此外，人畜共患寄生虫病不仅给畜牧业带来经济损失，更重要的是严重危害人类的健康。多年来 , 人们一直在寻找和研制驱虫广谱、高效、低毒、低残留和 价格低廉 的抗寄生虫药物，并取得了一定的进展。然而，多数研究侧重于新药物原料的开发上，而对药物制剂及其 递释 系统的研究开发报道较少。因此，基于现有疗效确切、安全、可控的抗寄生虫兽药新剂型的研究开发值得重视。 三氮脒 （ 为广谱抗血液原虫药，属于芳香双眯类 （图 1） ，收载于中华人民共和国兽药典 2005 年版一部 。本品对家畜锥虫、梨形虫及边虫 (无浆体 )都有治疗作用 ，用于家畜巴贝斯梨虫病 、泰勒氏梨形虫病 、伊氏锥虫病和媾疫锥虫病 ，其作用机理是选择性阻断锥虫动基体的 成和复制，并且与细胞核产生不可逆性结合 ，从而使锥虫的动基体消失，并终止分裂繁殖 1。三氮脒毒性较大，大鼠皮下注射 63mg/鼠 258 mg/有市售剂型为注射用粉针剂，少则为单剂量肌肉注射给药，多数情况下需间隔 24h 连续用药，长达一周左右。 三氯脒 毒性较大，安全 范围较窄，治疗量有时会出现不良反应，注射液对局部组织刺激性较强，大剂量常分点深部肌注。本课题拟将三氮脒制成一种经注射途径给药的缓控释制剂，使之能够克服现有制剂频繁使用血药浓度波动大、易产生副作用的不足，且一次注射通过缓慢释放使药物在体内的平均滞留时间维持在一周以上，低剂量可以用于预防，高剂量用于治疗。 N N H 2 O 1 三氮脒的化学结构 位凝胶注射剂是一种新型的注射给药系统，特别是由可生物降解材料 制成的原位凝胶（ in 药系统受到人们的广泛关注。这些给药系统通过注射器将药物注 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 射到皮下或者肌肉，药物进入体内因温度变化便转化为半固态贮藏 2。原位凝胶不同于传统的亲水凝胶，是指高分子材料以溶液或者半固体状态给药后，在用药部位响应外界刺激（如温度、 子强度、光和特异化学物质等），发生分散状态或构象的可逆性转化，形成的半固体或 固体 制剂 3,4。此原位凝胶由亲水性高分子材料制备，因而具有高度亲水性的三维网络结构以及良好的组织相容性。同时，独特的溶液 单、使用方便、与用药部位 组织相容性 强、滞留时间长等诸多优点，加以广泛的用途和良好的控制 释药 性能，原位凝胶给药系统已经成为药剂学领域的一个研究热点 5,6。 与传统的给药系统相比，原位凝胶制剂具有显著 的 优点：对接触环境的改变做出物理的或者化学的响应，根据响应值的大小调整制剂的理化性状（如相转变程度、温度和时间等）及药物在体内的动力学特征（如释药速度参数、达峰时间和滞留时间等）来适应临床症状及时有效 地 治疗；有较好的生物粘附性，能较长时间地和用药部位紧密接触，可提高生物利用度； 其 高度亲水性三维网络结构，将药物 或药物的初级制剂（如脂质体、微球、乳剂等）束缚于其中或间隙中，可以控制药物的释放，同时 还 能够对药物起到稳定的作用；具有特殊的理化性能，如溶液 体外具有一定的流动性，易于灌装，便于工业化生产；良好的组织相容性，容易被患者接受，提高了患者的顺应性，并且可以多种途径给药（如口服、注射、滴眼、鼻腔黏膜给药、直肠黏膜给药、阴道黏膜给药、经皮给药等） 7,8。 应用生物可降解材料作为凝胶基质，可避免如植入剂或 以 非生物降解材料作为基质的制剂 在 给药前后的手术治疗，使其使用较为方便。 根据其作用机理不同，可将 其分为温度敏感型、离子敏感型、 感性和光敏感性 8。温度敏感型（温敏型 ) 凝胶现在是目前研究最为广泛的一类 原位 凝胶 制剂 ，一般具有反响胶凝的性质，即温度低于低临界相变温度（ 为自由流动的液体，高于 形成凝胶 9。此类温敏型凝胶包括了天然聚合物，修饰的天然聚合物，聚乳酸 /聚羟基乙酸共聚物、聚乙二醇 /聚乳酸羟基乙酸（ 段共聚物、聚乙二醇 /聚氧乙烯 (段共聚物及其代谢产物、 度敏感性凝胶的形成机制一般是由于温度改变后氢键或疏水作用的改 变而导致聚合物的理化状态发生变化。如一些纤维素的衍生物呈现反向胶凝性质 ，即随温度升高而由溶液变成凝胶：纤维素本身为水不溶性，当引入一些亲水的基团时就有一定的水溶性。当其亲水基团与疏水基团比例适当时便可以在水溶液中发生凝胶转变，随着温度的升高，水对聚合物的溶解能力降低，聚合物之间的相互作用成为了主导作用，从而形成凝胶 8。 近年来，作为唯一自然界中含有游离氨基碱性多糖的壳聚糖，由于其具有抑菌、抗癌、 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 增强免疫力等多种生理功能，并且具有无毒、无免疫原性、无致突变性、不溶血以及可以自然降解，良好的组织相容性等诸 多优良特性，在生物医学及药物传递系统中得到广泛的应用 10但是，由于壳聚糖致密的分子结构，使其不溶于有机溶剂，只能溶于 兰州正丰生物科技有限公司 ）； 业生化试剂供应商）；聚乙二醇 600、聚乙二醇 1500、聚乙二醇 4000（ 其余试剂均为分析纯。 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 3. 方法与结果 出介质的选择 酸盐缓冲液 配置方法：精密称取在 115 5干燥 2试验 用磷酸氢二钾代替磷酸氢二钠） 与磷酸二氢钾 水溶解并稀释至 1000得 20。另称取三氮脒 得质量 浓度为 此三氮脒溶液 1入磷酸盐缓冲液 5液变浑浊，故 磷酸盐缓冲液不能作为三氮脒体外释放的 介质。 馏水 取双重蒸馏水 5 1三氮脒溶液混合，两溶液混溶，未出现浑浊。 理盐水 精密称取氯化钠定量，配置成 化钠溶液 500生理盐水 5 1量浓度为 溶液混溶，未出现浑浊。基于体液更接近生理盐水，故采用生理盐水为 三氮脒体外释放的 溶出介质。 氮脒体外分析方法 测波长的选择 精密称取 生理盐水配置成浓度为 10g/时将制剂所用辅料 (壳聚糖、甘油磷酸钠和 照处方比例用同种方法稀释，经 空滤膜过滤，以生理盐水为对照，按紫外分光光度法在 200描结果见图2。结果表明三氮脒在 370此波长下辅料无干扰。 A B 图 2 三氮脒及空白辅料在生理盐水中的紫外扫描图谱 2 A) B) in A. B. 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 动相的选择 精密称取三氮脒适量于 100生理盐水稀释定容，配制成 50g/为选择 流动相的样品。分别以水：甲醇 =91:9、 酸溶液：甲醇 =91:9、 磷酸溶液（用三乙胺调节 ）：甲醇 =91:921、水：甲醇 =30:7022、 磷酸溶液（用三乙胺调节 ）：甲醇 =30： 70为流动相，流速为 温 30，观测样品峰的分离效果。结果表明 磷酸溶液（用三乙胺调节 ）：甲醇 =30:70 较为理想，故继续调节其比例，流速调节为 磷酸溶液 （用三乙胺调节 ）：甲醇 =58:42。故最终选用流动相为 磷酸溶液（用三乙胺调节 ）：甲醇 =58:42，流速为 温 30。 谱条件 色谱柱： 18柱（ 250 5m）；流动相： 三乙胺调节 为 3）：甲醇 =58:42；流速： 测波长： 370温： 30；进样量： 20 l。在上述条件下，三氮脒能得到有效地分离，分离效果如图 3 所示。 A B 图 3 三氮脒的高效液相吸收色谱图 A. 标准品 (10g/ B. 样品 3 of . 10g/ B. 标准曲线的绘制 标准溶液的配置：精密称取三氮脒 25于 50生理盐水溶解、稀释、定容，作为标准贮备液 （ 500g/密吸取上述标准液 20 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 浓度 C（ g/纵坐标，峰面积（由于峰面积 用 A*横坐标）为横坐标，进行回归分析，得线性回归方程为： C= C 5g/相关系数 C= g/ C 100g/相关系数 A. C 5g/ B. 5g/ C 100g/ 4 三氮脒生理盐水溶液的标准曲线 4 of in . C 5g/ B. 5g/ C 100g/ 精密度与回收率 密度 精密称取 0生理盐水稀释定容，制得 100g/ 100g/液 1 10量瓶中，稀释定容，得 10g/液；取 10g/0生理盐水稀释定容，即得 所得溶液过滤，作为供试品溶液。每份样品连续测试 5 次 ,计算高、中、低浓度样品的日内精密度(%)。分别于连续三天内配制上述不同浓度的样品溶液， 算高、中、低浓度的日间精密度。日内、日间精密度结果 见下表 1。 表 1 方法精密度 of （ g/ %) 10 100 平均 %） 收率 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 按测试“日内精密度”的方法考察相对回收率。高、中、 平均 品稳定性 用标准贮备液依照“ 法制备 100g/10g/三氮脒标准溶液，分别在室温下放置 12 小时，每隔三小时采样测定峰面积，计算峰面积的相对标准偏差。结果见表 2。结果表明，三氮脒水溶液在 12小时内稳定。 表 2三氮脒生理盐水溶液的稳定性 of in (g/A ) 0h 3h 6h 9h 12h 2552 32484 32187 30757 30502 31696 10 370676 377282 413707 428623 428663 403790 100 6205108 6209513 6209561 6200519 6201497 6205239 氮脒原位凝胶注射剂的处方设计 白凝胶的制备 参考相关文献（李杰 , 2008），本试验初步拟定空白原位凝胶注射剂的处方为： 0 盐酸中 (3%, w/v)， 油磷酸钠溶解于 10离子水中 (18%,w/v)，混合便得空白凝胶。的盐酸中，搅拌 24小时使其成澄清溶液（ 3%， w/v）；在冰水浴中，将处方量的高速搅拌下将 拌 5便得空白凝胶 。制备工艺流程图 5： 图 5 空白凝胶的制备工艺流程 5 of in P 溶液 高速搅拌 盐酸溶液 壳聚糖 壳聚糖溶液 高速搅拌 空白凝胶 滴 加 冰水浴 甘油磷酸盐 蒸馏水 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 凝时间的测定 将 液装到 5 37水浴中保温；每隔 30秒倾斜西林瓶，观察能否流动，将体系由自由流动液体变成半固体（ 需要的时间记为胶凝时间（ 23。三个空白凝胶胶凝时间为 凝前后的 对照结果如图 6所示。 A B 图 6 胶凝前后比对图 A. 室温 (22) 37 ) B. 常胶凝时间越 长，药物突释效应就会越大，可导致不必要的毒副作用。故本试验考虑添加适当辅料以缩短胶凝时间。所用辅料分别为 油、磷酸二氢钠。首先考察上述试剂对壳聚糖溶液胶凝的影响。分别将试验溶液按一定比例在高速搅拌下加入到壳聚糖溶液中，观察壳聚糖溶液的变化，试验结果见表 3。 表 3 不同物质对壳聚糖溶液胶凝时间的影响 of to s 验溶液 聚糖溶液 验现象 : 1 稍变粘稠，但无胶凝 : 1 变粘稠，无胶凝 甘油 1 : 1 变乳浊，无胶凝 : 1 无明显变化 油 =1:1 1 : 1 无明显变化 由表 3 可知， 改变壳聚糖溶液的粘稠度，可能会改变壳聚糖 /此用 调查其能否缩短壳聚糖 /液的胶凝时间 ,试验结果见表 4。结果表明 能缩短壳聚糖 / 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 表 4 不同物质对壳聚糖 /液胶凝时间的影响 of to P s 验溶液 壳聚糖 /试验现象 ml a 5 7 s 胶凝 上层有透明液体 6 s 胶凝 液变 浑浊 3 3 s 胶凝 温放置 2凝 0l+1 4 s 胶凝 0l+1 5 s 胶凝 注： a: 示 壳聚糖 /液的加入量分别为 1 物容量考察 精密称取三氮脒定量于 10得 此溶液分别加入到壳聚糖 /聚糖溶液和磷酸二氢钾 溶液中，观察混合时的变化，结果见表 5。加入量的三氮脒生理盐水溶液在壳聚糖 /系中发生浑浊。但当壳聚糖 /液和三氮脒的混合比例是 250悬颗粒粒径明显减小，约 1选择将 50液混合，即 2 表 5 三氮脒溶解性能考察 of in 氮脒溶液 现象 壳聚糖 /10l 溶液变浑浊，粒径约 5聚糖溶液 10l 无明显变化 磷酸二氢钾溶液 10l 析出沉淀 壳聚糖 /20l 轻微混悬，粒径约 1 稳定性考察 由于加入量的三氮脒在壳聚糖 /系中成混悬状态，选择加入助悬剂增加试验制剂的稳定。选用 1% 西黄耆胶为助悬剂，按表 6的加入量搅拌混合，室温放置，观察混悬液的稳定性。结果表明，适量的 仅仅能缩短凝胶的胶凝时间，还能对试验制剂起到稳定作用。 通过 以上实验可以基本确定三氮脒温度敏感型原位凝胶注射剂的处方组成： 2 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 胶 +50l 0l 三氮脒水溶液 。 表 6 三氮脒壳聚糖 /甘油磷酸盐温度敏感型原位凝胶稳定性考察 A P in 溶液组成 稳定性 1 15040 小时后沉降 0l 三氮脒溶液 混悬，冰箱 12耆胶 +50混悬，冰箱放置数分 钟开始胶凝 50l 0l 三氮脒溶液 混悬， 4分 14秒胶凝， 9 天后开始沉降 505l 三氮脒溶液 混悬， 12小时有沉降 13天开始胶凝 50l 三氮脒溶液 混悬， 40小时后沉降 100l 三氮脒溶液 混悬， 6 小时后沉降， 分层，上层为絮状液 50黄耆胶 +100外释放试验及释药机制 将 2.1 林瓶中，于 37水浴中保温。待胶凝后，将其转移到转蓝（底部垫有一张滤纸）中，放置于 1000预定时间点和固定位置取样，每次取样 时补加等温的空白释放介质。用 算累积释放量和释放率。 三批次三氮脒原位凝胶注射剂平均胶凝时间为 连续采样 5 以累积释放率为纵坐标，时间 t(h)为横坐标作图 ,结果见图 7。 图 7 三氮脒原位凝胶体外释放曲线 A in 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 分别采用 型对三氮脒体外释药数据进行拟合，各模型拟合方程如表 7所示。 表 7 体外释放实验模型拟合方程 in =kt+b n（ 100=b =+b =Q is of in t; k is b is n is of 对相同处方和制备工艺的三个三氮脒原位凝胶注射剂样品体外释放的实验数据分别用上述 方程拟合，结果见表 8。相对而 言，体外释药曲线对 型拟合度较好，相关系数的平方 别为 n= 表 8 体外释药模型拟合结果 of in in 2 级释放 架型缓释类型 n=散机制 n=n= n= 架溶蚀机制 n=4. 讨论 备工艺 由于壳聚糖属氨基多糖，具有亲水性 24，在水中可溶，在酸溶液中易溶，因此将其溶解于稀盐酸溶液中。但由于其溶解速度比较慢，一般需要在高速搅拌的情 况下将其缓慢加 王彦军：三氮脒原位凝胶注射剂 入稀盐酸溶液中，室温搅拌约 24h，直至溶液变得澄清。甘油磷酸钠在环境温