【毕业学位论文】（Word原稿）体外共培养人脐带间充质干细胞对肝星状细胞增殖的影响

兰州大学硕士研究生学位论文 1 体外共培养人脐带间充质干细胞对肝星状细胞增殖的影响 前言 间充质干细胞 (初是由 1所发现的，它是干细胞家族重要的成员，来源于发育早期的外胚层和中胚层，是具有高度的自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。其广泛存在于上皮、骨髓、软骨、肌肉等众多中胚层来源的组织器官中 2，在一定的条件下它可以分化为中胚层起源的多种组织细胞，如软骨细胞、成骨细胞、肌肉、脂肪细胞、肌细胞、血管内皮细胞及神经星状细胞等。因其具有多向分化潜能、造血 支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，并且避免了胚胎干细胞移植所带来的免疫排斥反应及伦理问题，而日益受到人们的关注。目前， 骨髓来源的 且随着供体年龄增长其扩增及分化能力会出现明显的下降。近年来脐带间充质干细胞（ 渐进入我们的视野， 从人脐带中分离出 的胞含量、增殖 分化 能力 都 优于 骨髓间充质干细胞（ ， 因其 免疫 细胞较幼稚，免疫功能不成熟，免疫 原性比 病毒、病原微生物感染率也较低， 并且 其 具有取材方便，无 社会、法律、 伦理学争议等优点 。有研究表明 其是流式检测结果更是与骨髓、脐血等组织来源的 3。与成体阶段与多种细胞共同生存的 所生长的组织环境更加单纯，从而赋予了其更强的增殖能力与分化能力，强大的分泌因子能力、超低的免疫源性，大量的细胞来源、方便的提 取提纯以及易于体外培养等特性，使 在慢性肝病的发展过程中，肝脏纤维化的形成是一个复杂而缓慢的过程，是继发于各种慢性致病因素（如 ， 酒精性肝病、病毒性肝炎、某些代谢性疾病、肝寄生虫病 、 药物及化学毒物损伤等） 所 引起的反复的组织损伤、炎症反应 以 及损伤修复的结果 。肝纤维化的 实质是 细胞外基质（ 的改变。 肝星状细胞（ 是 主要来源 4， 它 是肝脏的一种非实质细胞，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的窦周 隙内 。兰州大学硕士研究生学位论文 2 激活是 肝 纤维化发生的中心环节， 肝脏 损伤时， 激活，转化为肌纤维母细胞 (由于 成与消除速度不平衡， 而 造成量增加，产生 了 大量以 I 型胶原为主的 且 分 泌血小板源性生长因子 （ 、转化生长因子 (等各种促 进 纤维化 的 因子， 从而 促进肝纤维化的形成 5。近年研究表明肝纤维化是可逆的过程， 其中肝星状细胞的增殖活化的抑制是其关键。多项研究表明， 各种原因所致的肝脏损伤有明显的修复作用，可以改善甚至逆转肝纤维化 6 肝纤维化发生过程是一个复杂的级联反应，各种原因所导致的肝实质细胞的损伤是 活的始动因素，再经过一系列细胞因子的调控活化，如 成纤维细胞生长因子 ( 内皮素 (T)、白介素 白介素 瘦素(1结缔组织生长因子 ( 8。这些细胞因子均通过相应的信号传导通路作用于靶细胞，产生生物应答。作用于这些信号及其传导过程或阻断这些信号传导级联反应的重要环节可作为防治肝纤维化的重要策略。目前研究较为清楚的相关信号传导通路主要有 、 导的 导通路、 路、 路及 路等。其中 是目前所公认的最重要的致肝纤维化的细胞因子 9。本研究进一步观察 过 、凋亡的影响。 兰州大学硕士研究生学位论文 3 材料与方法 验材料 带来自于甘肃省中医学院附属医院妇产科，已向家属告知，并签署同意书。 星状细胞 永生化人肝星状细胞株，由美国 授惠赠。 1. 2 主要试剂与材料 养基、 胎牛血清（ ：购自 司 ； 胰蛋白酶：购自 司； 料：购自 司； 自 司； 剂盒：购自 R&D 公司； 荧光定量 剂盒：购自大连 司； 提试剂 自大连宝生物公司； 细胞裂解液：购自碧云天生物技术研究所公司； 购自 司； 光试剂盒：购自 司； 白浓度测定试剂盒：购自北京 司； 抗体、 体、 体：购自 司； 体：购自 司； 记的山羊抗兔 自 司； 其他试剂纯度均为分析纯。 25胞培养瓶、 6 孔、 96 孔培养板， 15心管及 100胞培养皿、 自 司； ：购自 司。 1. 3 主要试剂配制 酸盐缓冲溶液（ ：在电子天平上分别称取氯化钠（ 8.0 g、氯化钾（ 0.2 g、磷酸二氢钾（ 州大学硕士研究生学位论文 4 g、磷酸氢二钠（ 去离子水溶于 1000 量瓶中，定容至 1000 且在充分溶解后，高压灭菌， 4冰箱内保存。 蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶粉末 于 100 杯中，搅拌均匀，过滤灭菌后，用 15心管分装， 箱内保存。 %多聚甲醛：称取多聚甲醛 2g，溶于 50ml ，加热至 60，滴加 1l 的 颜色清亮，冷却后补充 1004 冰箱内 保存 。 液 (5mg/称取 入小烧杯中，加入 50电磁力搅拌机上搅拌 30完全溶解， m 的滤膜过滤除菌。 4 冰箱内 保存 。 离胶：去离子水 0:4 10%过硫酸铵 缩胶：去离子水 0:4 10%过鏻酸铵 l， l。 白电泳缓冲液：称取 于 1L 去离子水中，备用。 膜缓冲液：称取 去离子水 定容至 800入150醇， 去离子 水定容至 1000用 。 称取 入 离子水定容至 1L， 至 入 1 1. 4 主要试验仪器 胞培养箱：三洋公司； 倒置相差显微镜： 司； 超净工作台：苏净集团安秦公司； 高压灭菌器：上海申安医疗器械厂； 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司； 台式高速离心机： 司； 低温冰箱：海尔公司； 流式细胞仪： 司； 干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司； 电热数显恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司； 电子天平 ：上海梅特 勒 兰州大学硕士研究生学位论文 5 酶标分析仪 ： 司； 移液枪： 司； 电泳仪 ： 司； 荧光定量 循环仪： 司； 曝光机： 司； 血球计数板：上海医用光学仪器厂。 验方法 离、培养、鉴定与冻存 分离与培养：取正常足月新生儿脐带约 10脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成 5.0 小块，贴于 含 10%胎牛血清 （ 10养皿底， 放入 37 、 5%养箱中培养。倒置显微镜每天观察细胞生长情况 。 3d 后首次换液，以后每 3d 换液 1 次，至细胞长至 80%，按 1： 2 传代，至第 4 代备用。 鉴定： 取 胞， 无菌 涤 3 次，用 蛋白酶消化 ， 调整细胞 密度为 106 0 6/为每管 0.1 性对照管加入鼠 它管分别加入鼠抗人抗体 温孵育 30式细胞仪计数 5000细胞。 冻存：将生长至 80%以上的细胞，吸除培养基，用无菌 洗 3 遍，将 尽，加入 蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 化约 1出后，倒置显微镜下观察细胞形态，发现细胞回缩、细胞间隙明显增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10%复多次吹打瓶壁细胞，制备成细胞悬液 。将悬液吸出，转入 151500 转 /心，去除上 清，加入 600 悬后，将细胞液转入已提前加好 100 l 二甲基亚砜（ 300 一次性无菌细胞冻存管中。冻存液 1： 3： 6。将冻存管封口标记，放入冰箱， 4 2h， 2h， 8h，最后转至液氮罐内长期保存。 苏、培养、传代与冻存 复苏、培养与传代： 将 冻存的 胞 放入 37水浴锅，快速摇晃至融化，转入 15心管（内含 打混匀， 1000 转/心，去上清，转入 25养瓶，并加入含 10% 州大学硕士研究生学位论文 6 放入 37 ， 5%的 养箱中培养 ，隔天换液， 继续培养，后 每 3d 换液 1 次 ，细胞生长融合 至 80%，即可传代。完全弃去原培养液，以无菌 冲洗 3 遍，吸尽 加入 蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 养箱中 消化约 30出后，倒置显微镜下观察细胞形态，发现细胞回缩、细胞间隙明显增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10% 复多次吹打瓶壁细胞，制备成细胞悬液， 传代备 用 。 冻存： 将生长至 80%以上的细胞，吸除培养基，用无菌 遍，将 尽，加入 蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 化约 30出后，倒置显微镜下观察细胞形态，发现细胞回缩、细胞间隙明显增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10%复多次吹打瓶壁细胞，制备成细胞悬液 。将悬液吸出，转入 151500 转 /心，去除上清，加入 700 悬后，将细胞液转入已提前加好 100 200 一次性无菌细胞冻存管中。冻存液 1： 2： 7。将冻存管封口标记，放入冰箱， 42h， 2h， 8h，液氮罐内长期保存。 长曲线 分别 取 90%融合的 备单细胞悬液调整细胞 密 度为 1105 个 /种于 96 孔板 ， 每孔 30 l， 置培养箱培养 ， 每 3d 更换培养液。从第 2 天起每隔 24h 随机取 3 孔细胞 ， 色法测各孔光密度值 ( ) ，连续测 9 天，以时间为横坐标， 为纵坐标绘制各细胞的生长曲线。具体操作：测定前每孔加入 液 20 l， 37孵育 4 h，尽量吸掉上清液，每孔加入 150 l 温振荡 10 择 490长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的 ，并求其平均值。以时间为横坐标、光密度 (D)为纵坐标绘制细胞生长曲线。 细胞计数方法：终止培养，将培养液吸除，用无菌 洗 1 次。蛋白酶消化液，置于 37 ， 5%的 养箱中 消化 （ 30 1取出后，倒置显微镜下观察细胞形态，发现 细胞回缩、细胞间隙明显增大后，立即倒掉胰蛋白酶消化液，然后用加入 含 10%复多次吹打瓶壁细胞，制备成细胞悬液 。在细胞计数板中央放置计数专用盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上的计数板凹槽处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。置于显微镜下，计数四角大方格内的细胞总数，对于压线的细胞，只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。细胞密度 =（ 4 个大格细胞总数 /4） 104 个 /加入适量含 10% 7 调整密度。 培养 应用 6孔塑料细胞培养板，在孔径 层接种1 105在下层接种 胞 (1 105 立上下双层细胞共培养体系。实验分组： (1)空白对照组：其上层只含培养基 )； 其上层只含培养基 ) (2) 实验组： 采用 37 ， 5 %养液为含 10 % 上述体系培养，观察 24、 48h，各时间段于倒置相差显微镜下动态观察活体细胞形态学改变。 测指标 （ 1）用 测各组的细胞增殖抑制率； （ 2）采用 色法，直观观察 殖抑制情况； （ 3）采用流式分析技术检测各组 亡情况； （ 4） 采用 检测各实验组细胞上清液中 蛋白的表达 ； （ 5） 采用荧光实时定量 测各组细胞中 、 （ 6）采用 检测各组 、 白 表达。 实验指标检测具体方法及步骤 测各组的细胞增殖抑制率 第一步：分别将各组培养 24h、 48h 细胞取出，将上层 室内液体吸出， 1500 转 /心，将上清转入对应下层培养板内。 第二步：每孔加入 400 5mg/放入 37 ， 5 %养箱内4h。 第三步：弃去培养液，每孔加 l 避光震荡 10蓝色结晶物充分溶解。 第四步：取出 96 孔板，将 6 孔板内液体转入， 150 l/孔，每 6 孔板设 10个复孔 。 第五步：酶标仪检测。选择 490长测定各孔吸光值，以仅加入 检测仪上比色测定并记录各孔光吸收值（ A 值）。 第六步：计算细胞生长抑制率 =（ 1 值 /对照组 A 值） 100%。 兰州大学硕士研究生学位论文 8 色法，直观观察 殖抑制情况 第一步：分别取共培养 24h、 48h 后细胞进行处理。将上层 室移除，将培养基吸除，加入多聚甲醛 2定 30 第二步：无菌 洗 2 遍，每次 5 第三步：加入 料 500 l/孔，避 光孵育 6染料吸除，于荧光显微镜下观察。 式分析技术检测各组 亡情况 第一步：分别于 24、 48h，将 6 孔板内培养基吸除，无菌 洗 3 遍，酶消化，吸除胰酶，加入 分吹打至细胞脱壁。 第二步：转入 15心管内， 1500 转 /心，去上清， 加入 300 l 的 1浮细胞 ，转入上样管。 第三步： 每管内 加入 5 光，室温孵育 15 第四步： 上机前 的 5加入 色 5 l。 第五步：上机前 补加 1l。 检测各实验组细胞上清液中 蛋白的表达 第一步： 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设 置 标准孔 8 孔，在每孔中 分别 加入标准品稀释液 100 l，然后再 在 第一孔加入标准品 100 l， 充分 混匀后用枪头吸出 100 l， 转 移至第二孔。如此反复 ，作 对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出 100 l 弃 除 ，使每孔均为 100 l。第八孔为空白对照孔（不加样品及酶标试剂）。 第二步： 加样：加样前将样品从 冰箱取出， 在室温 下 平衡 30酶标包被板 的 上样品待测孔的底部分别加 入 各组样品 100 l。 第三步： 加酶：每孔加入 酶联亲和物 50 l，充分混匀，空白对照孔 内 不加。 第四步： 温育：用保鲜膜封好酶标包被板后，放入 37 温箱内温育 约 1h。 第五步： 洗涤： 在 1h 后，倒掉板内 所有 液体，将板内液体 放 在滤纸上 反复扣干，在每孔中 均 加满洗涤液，静置后， 将 洗涤液倒去， 再次在 滤纸上完全扣干残余液体， 反复 清洗 6 次，方法同前 。 第六步： 显色：每 孔 内 加 入 底物 50 l， 之后 加入底物 50 l，充分混匀，室温下避光显色 约 15 第七步： 终止： 在 15，每孔 内 加 入 终止液 50 l，充分混匀 。 第八步： 比色：加入终止液 后 30 内，使用酶标仪 ， 在 450长 检测 各孔的 （以空白对照孔调零）。 兰州大学硕士研究生学位论文 9 第九步：根据标准品检测结果 绘制标准曲线， 再根据样品 算出各指标具体的 浓度 。 用荧光实时定量 测各实验组的细胞中 、 表达 总 提取： 第一步：将培养 24h、 48h 细胞取出，吸除培养液，用无菌 洗 1 次，6 孔板每孔内加入 平放置片刻，充分吹打使 细胞完全脱落，转入离心管内，再次反复吹打至无沉淀，室温下静置约5 第二步：放入离心机 12000 转 /心，将上清转至 心管内。 第三步：每管内加入氯仿 200 l，双手剧烈震荡 20s，至充分乳化。室温下静置 5 第四步：再次放入离心机 12000 转 /心，小心取出离心管（可见已分层），将上清转移至新的离心管内（切忌吸到白色部分）。加入等体积的异丙醇，上下颠倒，充分混匀。室温下静置 10 第五步：放入离心机 12000 转 /心，取出后可见沉淀 。小心吸去上清，沿壁缓慢加入 75%乙醇 1触及沉淀），轻轻的上下颠倒洗涤管壁。 第六步：放入离心机 12000 转 /心，取出后小心吸去上清。室温下放置干燥 5 第七步：每管内加入 30 l 以溶解沉淀，轻轻混匀后，放入 箱保存。 度及浓度测定 第一步： 纯度 测定 ：吸出 提前制备好的 解液 2 l，加 入 高温消毒过的 98 l， 50 倍稀释后备用，将微量比色杯先用 冲洗干净，并在杯中加入 ，在紫外分光光度计上测定波长260 280 品的 。空白管 内 为不含 。 纯度用 比值 R 值反映， 反映 的是 的蛋白质等有机物的污染程度，纯度较好的 值 应该 在 间，当 R 值 ， 则 说明 经被水解成 了 单核苷酸。 本实验所有提取的总 R 值均在 兰州大学硕士研究生学位论文 10 第二步： 计算 度： 度 =释倍数 g/ l。 逆转录反应 反应液配置见表 1 表 1 逆转录反应液配置 试剂 使用量 5 l l 0 M) l 00 M) l l l 逆转录反应条件：使用 转录试剂盒， 反应条件为 37 15 85 5 s， 反应体系为 10 l 。 引物设计 根据实验要求，在 询所需 基因相应的 列 ， 使用物设计软件 进行 引物设计，由 生工生物工程（上海）有限公司 合成 。引物序列 见表 2。 表 2 荧光实时定量 物序列 基因 引物序列 (53) F: : : : : : 光实时定量 应 按照 司 )的使用 说明进行实验 操作 。 反应液配制（在冰上进行）见表 3 表 3 增反应液配置 试剂 使用量 兰州大学硕士研究生学位论文 11 x (2 ) 5 l 10 M) l 10 M) l 板 1 l 菌蒸馏水 ) l 0 l 应条件：采用两步法扩增 ：预变性： 95 30 s， 1 个循环 ； 应：95 变性 5 s， 60 30s， 40 个循环 反应。反应结束后 确认 扩增曲线和融解 曲线， 进行 量时制作标准曲线。 利用 为内参基因，应用最常用的简便计算 对数据结果进行相对定量分析，即基因表达差异（ =2 的基因 参基因） 的基因 参基因） 检测各组 、 白 表达 蛋白提取（在冰上进行） 第一步：将分别培养 24h、 48h 的细胞取出，移除上层 孔内培养基吸净，无菌 洗 1 次。 第二步：每孔内加入蛋白裂解液 150 l，用细胞刮刀纵向刮取，转移入无菌离心管内。 第三步：用 1管吹吸 20。 第四步： 12000 转 /心。将上 清转移至新的离心管，标记， 存备用。 蛋白定量 使用 白浓度测定试剂盒进行蛋白定量 第一步：配制工作液：根据标准品和样品数量，按 1 体积 剂加 50 体积 剂（ 1： 50）配制成 作液，充分混匀（混合时可能会出现浑浊，但充分混匀后浑浊会消失）。 作液在 24h 内稳定。 第二步：稀释标准品：取 准品 10 l 用无菌 释至 100 l，使其终浓度为 标准品按 0， 2， 4， 6， 8， 12， 16， 20l 分别加入到 96 孔板的蛋白标准品孔内，并加如 足至 20 l。 第三步：将样品作适当的稀释（ 5， 10， 20 倍稀释），稀释后加 20 l 到 96孔板的样品孔中。 兰州大学硕士研究生学位论文 12 第四步：各孔内分别加入 作液 200 l， 37下放置 15酶标仪在波长 562进行测定，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 样品处理 第一步：根据蛋白浓度计算出上样量。 第二步：计算出加入 1： 3）的量， 100 10水煮样。 一步：上样 第二步： 泳： 100 30h。 第三步：膜平衡：用于转移的膜先在甲醇中浸 泡 30s，然后转移到转膜缓冲液中冰浴下平衡 30 第四步：胶平衡： 束后，把胶取出，置入转膜缓冲液中平衡30时将滤纸和海绵也放入转膜缓冲液中冰浴下平衡30 第五步： 组装电转装置：海绵 海绵， 100h（转膜缓冲液需 4保存，电转时冰浴）。 第六步：封闭：把膜放入专用塑料盒中，加入含 5%脱脂奶粉的 在 37摇床中封闭 2h。 第七步：一抗杂交：封闭结束后，用 洗 1 次，加入含 5%脱脂奶粉的 入所需检测相应抗体（ 8 37孵育过夜。 第八步：洗脱：用 洗 3 次，每次 10床室温）。 第九步：二抗杂交：加入含 5%脱脂奶粉的 入二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体） 2 l， 37孵育 2h。 第十步：洗脱：用 洗 3 次，每次 10床室温）。 第十一步： 曝光：加显色液和发光液（超敏发光液）各 100 l，上机曝光。 计学处理 采用 件，计 数资料比较采取卡方检验，计量资料比较采用 t 检验， 以 P 差异有显著性统计学意义。 兰州大学硕士研究生学位论文 13 结 果 培养与鉴定 相差倒置显微镜下 观察， 1织块部分贴壁 ， 6外观呈纺锤形或多角形，可见细胞核。 10多， 已有成片聚集 ， 聚集处呈火山喷发状。细胞多为长梭形或扁平形的成纤维样细胞 ， 核仁明显。180%， 细胞密度较低时成扁平单层细胞 ， 细胞密度较高时趋于融合细胞变细长类似成纤维细胞呈平行或旋涡状生长 ，如图 1。 此时消化、传代去除组织块 传代后细胞生长能力明显增强 ， 至 贴壁速度增快，生长迅速，细胞排列整齐，分布均匀，生长一致， 隔天细胞即需传代。 经流式细胞仪检测， 表达造血干细胞所标记的 表达内皮细胞标记的 图 1 0%融合， 细胞变细长类似成纤维细胞呈平行或旋涡状生长 （ 10） 培养 相差倒置显微镜下可见初 复苏 的 圆球状、细胞质透亮且内含丰富黑色折光的脂滴颗粒， 体积小于肝细胞，大于库普弗细胞。 2，细胞开始贴壁生长，呈扁圆或梭形，细胞质内脂滴明显，部分细胞已开始向外伸展。 24大片状伸出伪足 。 2d 后，细胞质中的脂滴逐渐减少甚至消失，细胞呈片状伸展，伪足很长，胞内可见细丝状结构，可见新增殖分裂的细胞，见图 2。 兰州大学硕士研究生学位论文 14 图 2 0%融合， 细胞呈片状伸展，伪足很长，胞内可见细丝状结构，可见新增殖分裂的细胞 （ 10） 长曲线 胞一般 8 天左右能达到 80%以上融合。细胞传代后 1 2 天为滞留期， 3 天后达对数生长期，第 5 天进入平台期。 明显的增殖迟滞期 0 2 天， 3 天后达到对数生长期， 而且在第 7 天之后出现平台期 。 外培养生长曲线，见图 3。 490 3 4 5 6 7 8 9生长时间（天） 测各组的细胞增殖抑制率 本实验利用前述公式计算细胞增殖抑制率。与 相比 ， 培养 24 h， ， n = 10， p ， 随着培养时间延长 ， 州大学硕士研究生学位论文 15 增殖活性受抑制更明显 (48 ， n =10， p 。 相差倒置显微镜下 表 4 共培养后 殖抑制率（ % n=10） 分组 24h 48h 值 pp色法，直观观察 亡情况 与对照组相比共培养组可见较多凋亡细胞，且 48h 多于 24h。（凋亡细胞染色质固缩，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染）见图 4444 图 424兰州大学硕士研究生学位论文 16 图 424图 448图 448式分析技术检测各组 殖抑制情况 采用流式细胞仪 I 双染法检测 培养 24h 及 48h 后 凋亡情况如图 5555 兰州大学硕士研究生学位论文 17 图 5共培养组 24兰州大学硕士研究生学位论文 18 图 5单独 4表 5式分析 24h 单独 养组与共培养组 分组 细胞数 16192 不同状态细胞数及构成（ %） 死亡细胞 晚期凋亡 正常细胞 早期凋亡 培养 8029 8163 4 （ 2 （ 21（ 28（ 7819（ 7884（ 185（ 249（ 如表 5示：经卡方检验显示共培养组凋亡细胞多于单独 养组。 2=p=p 异有统计学意义。 图 5共培养组 48兰州大学硕士研究生学位论文 19 图 5单独 8表 5式分析 48h 单独 养组与共培养组 分组 细胞数 16519 不同状态细胞数及构成（ %） 死亡细胞 晚期凋亡 正常细胞 早期凋亡 培养 8451 8068 2（ 7（ 10（ 33（ 8359（ 7893（ 80（ 135（ 如表 5卡方检验显示共培养组凋亡细胞多于单独 2=p 异有统计学意义。 用 检测各实验组细胞上清液中 蛋白 浓度 表 6 测各实验组 24h、 48h 上清液中 浓度（ n=3） 分组 24h 48h 值 p=p=表 6 所示 ： 共培养组 与 养组 24h 比较， p共培养组 与 养组 48h 比较， p独 养组 浓度过低，低于酶联免疫试剂盒最低检测值，故测不出。 用荧光实时定量 测各实验组的细胞中 、 表达 兰州大学硕士研究生学位论文 20 图 6 荧光实时定量 组细胞中 、 表达 。可见单独 于共培养组， p独 养组 于共培养组， p=独 养组 于共培养组， p=用 检 对各组 、 白 表达 2444848 图 7 各组 24、 48、 白 的表达 表 7 检对各组 、 白 表达（ n=3） 组别 24h 48h 州大学硕士研究生学位论文 21 共培养组 t 值 p 值 表 7 所示： 、 白表达， 24h、 48h 共培养组与 比较，p 均 异有统计学意义。 兰州大学硕士研究生学位论文 22 讨 论 肝硬化是 我国 常见的慢性、弥漫性、进行性肝病，由一种或几种病因反复或长期作用导致的肝 脏弥漫性损害，肝细胞变性、坏死、再生和再生结节形成 是 其基本病理 的 改变， 同时 伴有结缔组织增生和纤维隔形成，最终 引起 肝小叶结构破坏 、 假小叶形成 10。肝功能减退和门静脉高压引起的两大群表现 是该疾病 失代偿期的主要临床表现。 肝硬化是各种慢性肝脏疾病的终末期，是一种严重威胁人类健康的疾病。 肝纤维化是肝硬化的早期状态， 是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和 所 必经 的 途径 11。 大量研究表明，肝纤维化是可以逆转的 12 肝纤维化的形成是一个缓慢而复杂的过程，是 继发于 各种因素引起的反复的 肝脏炎症损伤或 损伤 后 修复的结果， 是肝脏纤维结缔组织过度沉积的结果， 其实质是 变 。 身并非单纯 的 作为一种组织结构 而 存在，它具有广泛的生理功能， 是 对 于 细胞、组织、器官的形态、生长、分化 及 代谢等结构 、 功能有重要影响的生物大分子 15。肝纤维化 发生 时， 改变涉及量、质两方面。量的改变 主要 表现为肝内过量胶原 的 形成以及沉着， 的改变表现为 局部 的 重建或重 新 分布， 期主要沉积在 的 内皮下 ， 随后 在 内皮下形成连续的基底膜 ， 内皮窗孔消失，即肝窦毛细血管化 16。 于 隙内， 紧贴着肝窦内皮细胞（ 肝细胞 ， 主要来源， 肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时 被 激活并转化为 达 合成 种致纤维化因素均把 激活后的 泌 如 各种促纤维化 的 因子，促进 了 肝纤维化的形成 17 同时 功能受 到 免疫