【毕业学位论文】（Word原稿）安全性评价及杀虫蛋白检测方法在安评中的应用-ELISA生物测试

北京大学硕士学位论文 1 摘 要 从苏云金杆菌（ 称 为抗原免疫家兔，得到高效价的抗血清。利用抗体 酶标抗体反应，建立了酶联免疫学测定方法（ 可定量检测转 建立的 叶片和转 叶片 、 花器 、 铃和蕾等部位，并同生物测试法相比较，发现两种方法有很好的相关性。同生物测试法相比， 作简便的 优点，并且可以精确定量。 烟草 、 杨树和马铃薯等多种植物，其中一些已进入中试和大规模商业化种植阶段，在育种中， 用 异显著。叶和 花瓣杀虫蛋白含量最高，铃和蕾次之。整个生长季中，杀虫蛋白的含量在盛花期较高，以后就开始下降。在生长的后期，各器官杀虫蛋白的含量都降至很低的水平，杀虫的效果也明显减弱。研究的结果对于棉铃虫的综合防治具有重要的指导意义。 研究还发现，在种子萌发的初期， 杀虫蛋白就开始表达，并随着时间的推移，表达量逐渐提高。而在未萌发的种子中，杀虫蛋白含量很低。 对棉叶提取液进行超滤处理， 检测结果显示，在胞浆中杀虫蛋白含量很低，而在膜系统处理液中含量较高，初步推测杀虫蛋白可能结合于膜系统上。 关键词 棉铃虫； 物测试 北京大学硕士学位论文 2 t we is t t it is is to of t Bt of as of In of is a We t t in t In Bt of is to of We t to in of of s it t is in in It is t is Bt 京大学硕士学位论文 3 前言 在世界范围内，害虫造成的损失约占农作物总收获量的 13%，每年大约损失数千亿美元。在我国，因虫害水稻减产在 10%以上；小麦减产近 20%；棉花减产在 30%以上，每年造成的损失达 60学农 药的问世，虽然在近半个世纪内对于农业持续稳定地发展起了不可估量的作用，但长期 、 广泛 、 大量 、 连续地施放化学农药，已经造成了一系列严重后果：一方面，导致害虫产生耐受性，用药量越来越大，形成恶性循环；另一方面，过量地使用农药，不仅杀灭害虫的天敌，对自然生态平衡造成严重的破坏，而且直接威胁着人 、 畜的安全 1,2,3,4。而生物防治则没有上述缺点，因而受到人们的高度重视和关注。其大致有三条防治策略，即生物杀虫剂 、 生态防治和培育抗虫品种。生物杀虫剂和生态防治虽然部分程度上克服了化学农药的缺点，但由于见效慢 、 杀虫谱窄 、 受环境条件影响大，因而限制了其广泛应用 5,6,7。培育抗虫品种不仅具有选择性强 、 使用安全 、 成本低等优点，而且对于植物的保护作用具有连续性 、全面性。但常规抗虫育种由于育种周期长，种质资源有限，加上抗虫机制不太明了等原因，其利用受到极大的限制。鉴于此，最理想的 、 有前途的方法是通过遗传工程手段培育农作物抗虫品种，即将抗虫基因通过一定的途径导入农作物中，使其在受体植物内稳定地遗传和表达，从而形成抗虫新品系或新品种。目前，在植物抗虫基因工程中使用的抗虫基因主要有两大类，一类是从细菌中分离出来的细菌抗虫基因，如 异戊基转移酶基因 (另一类是从植物中分离出来的植物抗虫基因，如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因( 马铃薯蛋白酶抑制剂 淀粉酶抑制剂基因 、 外源凝集素基因等。 8。 苏云金杆菌属于革兰氏阳性土壤杆菌。在芽孢形成过程中，苏云金杆菌可产生大量的伴胞晶体，伴胞晶体由具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成，这种蛋白通常被称为杀虫结晶蛋白（ 在昆虫中肠碱性和还原性环境下，原毒素被降解成 60些受体位于中肠上皮的微绒毛，现已证明为氨肽酶 N9,10和钙粘着蛋白 (似物 11。结合于受体的蛋白随之插入到细胞膜上并形成穿孔，使细胞膜周质和中膜腔之间的离子平衡被破坏，引起细胞肿胀甚至裂解，从而导致瘫痪或死亡 12。通过质粒消除实验及结合转移实验证明大多数 其基因的克隆及结构分析表明： 端是其活性部位 13,14,15，最小活性片段在于 9。 北京大学硕士学位论文 4 t)等在 1981年首次将苏云金杆菌 在 1985年完成其核苷酸序列分析。 1989年根据当时已报道的 42种 因编码的特定晶体蛋白质及其杀虫活性，把它们分成四种类型，分别用罗马数字 、 、 、来命名，这些数字代表了 型抗鳞翅目，类型抗鳞翅目和双翅目，类型抗鞘翅目，类型抗双翅目。）。在每一类型下用英文字母 A、 B、 后用小写 的英文字母表示同一基因型内由于核苷酸序列差异造成的基因亚型。按照此系统 ，编码 称 其编码的蛋白质称为晶体蛋白质(简称 16。此外，苏云金杆菌以色列变种（ Bt 码的 27显示出对无脊椎动物和脊椎动物细胞有毒性 17,18。 其基因结构与 命名为 但随着克隆杀虫蛋白基因的增多，发 现按照此系统进行分类在氨基酸序列和杀虫活性之间存在矛盾。因此，在第一届 的 1997 年止，已发现了超过 100 种的 1是氨基酸序列同源性小于 96%的 54种 表 1 氨基酸序列同源性小于 96%的 54种 t of 6% 虫蛋白基因 沿用的名称 编码蛋白质的分子量 (杀虫范围 一些靶标昆虫 a) 133500 L 烟草天蛾，欧洲玉米螟 b) 130615 L 棉叶夜蛾 c) 131000 L 小菜蛾 d) 131000 L 粉纹夜蛾 e) 131000 L 欧洲玉米螟 36500 L/C 大菜粉蝶等 36500 L 大菜粉蝶等 c) 138000 L 烟草天蛾等 32000 L 甘蓝夜蛾等 b) 130500 L 粉纹夜蛾等 29500 L 烟草天蛾等 29000 不明 不明 33236 L 斜纹夜蛾等 b) 130500 L 烟草天蛾等 30500 L 欧洲玉米螟等 31000 不明 不明 29500 不明 不明 30000 不明 不明 1200 L/C 烟草天蛾等 0000 不明 不明 29500 L 欧洲玉米螟等 北京大学硕士学位论文 5 31000 L 烟草天蛾等 详 不明 不明 0500 L/D 舞毒蛾，烟草天蛾等 0500 L 烟草天蛾等 9000 L 烟草天蛾等 2500 C 4300 C 2500 C 3000 C 34545 D 舞毒蛾等 26000 D 舞毒蛾等 a) 153500 N b) 143000 N 39000 C 25000 N 4000 N 26500 C 26500 C 28500 C 30000 C 27500 C 28500 L 27000 L 29800 L 5000 D 1500 D 详 D 39500 N 9000 N 32800 C 8000 L 7340 无特异性 9000 无特异性 注：表中 最先利用 们在 1986年将 b)经转座子 到植物的假单孢杆菌（根际微生物）中，创造了第一代 19。真正的 一个成功的例子是由比利时的植物遗传系统公司在1987年 6月报道的（ 1987），他们用农杆菌介导法成功地将完整的b)基因和 3端缺失后只保留 5端编码杀虫蛋白核心区（毒性片段）的不同长度的 b)基因导入烟草获得了抗烟草天蛾的转基因烟草植株。研究表明， 除 3端大部分而保留 5端编码核心区的不同长度的杀 虫蛋白基因在植物中的表达量有所提高。全长的原毒素基因导入植物，杀虫蛋白含量占可溶性总蛋白的百分比很低，常在 甚至更低。而以较短的 表达水平可提高 1020。 北京大学硕士学位论文 6 物属真核生物，其基因的表达调控，密码子的偏爱，转译起始部位的分子结构等都存在很大的差异。对于 果表明 于在植物细胞内某些 分含量过低，造成 植物细胞内未成熟终止转译的 外， 含有大量的 中存在有隐含的多腺苷序列 可能造成 虫蛋白不适当的位置上断裂，引起 二级结构 、 些都造成 为了获得高效抗虫的转基因植物，就必须对 除对高效表达不利的因素。这些措施包括： (1)的密码子。 1991年，美国孟山都公司的研究人员 行修饰，改变了 21%的核苷酸序列，消除了上述提到的对高效表达不利的因素，在 动子的控制下，人工合成全长的 转基因棉花植株中获得了高效表达，表达量从原来的占可溶性蛋白的 高到 增加了 50，获得了良好的抗虫效果 21,22。 在不改变杀虫蛋白氨基酸序列的情况下，用 T 序列，提高了毒素在宿主细胞中 的表达强度和抗虫性 23。 (2)高蛋白的表达量，从而提高转基因植物的抗虫性。 (3)常用的启动子是从花椰菜花叶病毒 (分离出来的 3524，其次是农杆菌 们都具有真核生物启动子的特点，能够提高外源基因在植物中的表达。如 5过农杆菌 得表达量较高的转基因烟草 25。 (4)化植物后提高表达蛋白的稳定性，也可获得具有良好抗虫性的植物。 将 体介导法是利用改造后的 过同源重组，质粒进入农杆菌，用这种含有质粒的农杆菌感染植物，可实现外源基因的转移。活体植株，植物器官如胚 、 子房等，愈伤组织和原生质体等都可以作为外源基因的转移受体。农杆菌是双子叶植物转移外源基因常用的载体，但不能感染大多数单子叶植物，这时就需要使用直接转化法。它包括一些物理方法和化学方法，例如电击法 、 基因枪法 、 花粉管通道法 、 显微注射法和聚乙二醇转化法等。它同载体介导法相比，有很多优点，一是可以基本上克服利用 相当程度上克服基因型不同所带来的困难；二是可直接将外北京大学硕士学位论文 7 源基因引入植物单个细胞或组织，避免了使用植物原生质体带来的完整植株再生的困难；三是可以利用胚轴茎尖分生组织或胚性悬浮细胞，尽可能避开通过愈伤组织获得再生植株所带来的变异 26 近年来转基因抗虫植物技术日趋成熟，向商品化，实用化发展。国外很多著名的生物技术公司投入大量的人力和物力开展这方面的研究，取得了可喜的成就。 1994年获得美国环保署 (批准在大田中应用， 1995年获得美国 、 日本和欧洲的专利发明权。 基因马铃薯 基因玉米 我国对这一领域的研究也非常重视，转基因抗虫植物的构建被列入国家科研攻关计划。从基因合成，载体的构建，转基因的方法，优良品系的选育到大田应用等方面都建立了完善的体系。在转基因抗虫棉花的研究方面获得了巨大的成功，将自行合成 、 改造的 ，得到抗虫棉优良株系十多个，这些株系不局限于国外的珂字棉品种，也适用于我国的主要栽培品种中的中字棉品种。 中国农业科学院生物技术中心以及江苏省农业科学院经济作物研究所，根据不改变 野生型序列合成了 虫蛋白基因 野生 )杀虫基因比较见表 2），到用于棉花转化的表达构建体 1）。载体中的 终止和增 强翻译能力有关的调控元件，包括加倍的增强子序列 、 35 序列 、 多联终止序列 、 拼接和加工序列以及 表 2 野生 )杀虫基因比较 t 野生 )杀虫基因 虫基因 蛋白 61508基 1845824变碱基数 0 329/1824( 修改密码子数 0 353/608( 图 1 A of 京大学硕士学位论文 8 E：增强子； 35动子； ：序列； 聚腺苷酸； ： 止子； 边界序列。 E: 35 : : : 合成的基因中提高了密码子 的含量（由 24%增加到 50%），更适合在植物中表达 32。构建的 因表达载体 于包含了以下一些表达调控元件，更能增强杀虫基因的表达水平。 5 端加倍的增强子元件。 5端 序列和 列。 5 端 序列在蛋白质翻译过程中，是核糖体的结合位点，它是提高蛋白质表达量的构建序列之一。 列是在真核 生物端含起始密码 一段序列。这一序列有助于 40S 核糖体小亚基与 60S 大亚基结合形成 80S 起始复合物，从而开始生成肽链。 3端 多联终止密码子序列。它为翻译的 虫蛋白能正确而有效地终止提供了保证。 3端 多聚腺苷酸 序列 (切割加工序列。它为提高杀虫基因 稳定性和蛋白质的翻译水平提供了必要条件 33。 通过花粉管通道法和农杆菌介导法，将人工合成的杀虫基因转移到我国棉花主栽品种中，获得了 20 多个高抗 、 丰产 、 品质优的转基因棉花品系。现已有两个优系通过了品种 审定，被命名为中国抗虫棉 1 号 (中国抗虫棉 95目前已在我国 9 个省 、 市 21 个基地进行试种 、 示范和商品化生产。 1998 年种植总面积超过 1 万 将逐步实现商品化生产 34,35。 转 虫蛋白基因棉花在应用中的潜在问题也日益受到人们的关注。首先 虫蛋白基因抗虫谱较窄是一个很大的缺陷，尽管已分离到的 虫蛋白基因，其抗虫谱几乎覆盖了所有鳞翅目 、 鞘翅目 、 双翅目等害虫，但就具体而言，每一种 虫蛋白基因的抗虫谱却十分有限；另一个严重问题是，害虫易对 虫蛋白产生耐受性。大约在三十年前人们就观察到了这种现象，最近实验室的实验结果进一步说明了问题的严重性。印度谷螟 (长期饲喂含有 虫蛋白的人工饲料后，其后代产生了对 虫蛋白的抗性， 虫蛋白的半致死剂量提高了 250 倍。除此之外，至少有八种昆虫在实验室条件下也产生了对 虫蛋白的耐受性。在长期使用 虫剂的田间也发现了抗 虫蛋白的小菜蛾 (印度谷螟产生抗性的原因是虫蛋白与其幼虫中肠筛状缘细胞上的特异受体亲 和力降低，引起了它对b)毒素敏感性的降低，但受体与 保持高亲和力，印度谷螟对这些毒素也依然敏感。抗 c)烟芽夜蛾（ 情况与此相反，它不但对 c)耐受，对 a)、 b)、 同样耐受。这些例子是在使用 虫剂时产生的， 虫剂是一种复合杀虫剂， 虫蛋白作用的时间短，残留量低，对昆虫的选择压力也小。而北京大学硕士学位论文 9 转抗虫基因植物往往使用单一的 虫蛋白基因，一年几代的昆虫 连续暴露在虫蛋白的作用下，增加了选择压力，使有耐受性的昆虫群体得到发展，以致在群体水平上昆虫产生了耐受性，使问题更加突出。如何有效防止害虫产生耐受性将成为 虫蛋白基因能否顺利应用于抗虫作物培育的关键 2。第三是虫蛋白基因在植物体内表达的水平和稳定性问题。目前已发现外源基因在植物体内的表达存在着基因“沉默” (象 36,37。也有外源 虫蛋白基因发生甲基化的报道 38。即使转入的基因能表达，但若表达的水平低，也不能有效地毒杀害虫。在目前所得的转 虫蛋白基因植物 中， 虫蛋白基因的表达水平普遍较低，这也是众多转 虫蛋白基因植物未进入商品化生产的主要原因之一。目前人们已设计了几种对策，以解决这些潜在的问题。首先，同时使用两个以上的 虫蛋白基因转化植物，这样即使害虫对其中一种产生耐受性，也不至于使植物丧失抗虫能力；其次，联合使用 虫蛋白基因和其它类型的抗虫基因，如具有广谱抗虫特点的豇豆胰蛋白酶抑制剂 (因。这些措施对防止或延迟害虫产生耐受性具有一定的作用，同时对于扩大转基因植物的抗虫谱也会有很好的效果；此外，使用调控型启动子与 虫蛋白基因构 成嵌合基因，然后转化植物，培育出 虫蛋白基因特异性表达的抗虫品种，使得 虫蛋白基因只在害虫侵害时或者只在作物易受害虫侵害的部位以及在一定的条件下（化学调节剂）高效表达，以减少产生耐受性昆虫种群的环境选择压，不利于耐受性昆虫种群的发展。如利用 虫蛋白基因和 病蛋白）基因的启动子构成嵌合基因，该启动子可受多种病源物的诱导和几种化学物（如水杨酸 、 聚丙烯酸）的诱导，然后用这种嵌合基因转化烟草可获得转基因植株，用化学调节物可以诱导 虫蛋白基因在转基因植物中高效表达，在短时间内以大剂量毒杀害 虫 8。 蛋白酶抑制剂（ I）基因以其广谱抗虫的特点，越来越受到人们的重视。蛋白酶抑制剂是自然界中含量最丰富的蛋白种类之一，存在于所有生命体中。在植物的大多数贮藏器官，如种子和块茎中，各种蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白的 1有些可达 30%。蛋白酶抑制剂在植物体内的功能主要有两个方面：（ 1）与蛋白酶相互作用，相互制约控制生物体内细胞 、组织和体液中有关的生理过程。（ 2）防止细胞 、 组织及体液中的蛋白成分被外源蛋白酶降解。蛋白酶抑制剂杀虫的机理在于： 它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用，形成酶 阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用。所以，一旦昆虫摄食进蛋白酶抑制剂，就会影响外来蛋白的正常消化；同时，蛋白酶抑制剂和消化酶形成的 刺激消化酶的过量分泌，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应，最终造成昆虫的非正常发育或死亡。目前，已有多种蛋白酶抑制剂基因或 克隆，并得到一批转蛋白酶抑制北京大学硕士学位论文 10 剂基因植株，转基因植株表现出良好的抗虫效果，其中有些基因有明显的应用前景。最引人注目的是豇豆胰蛋白酶抑制剂 (因。 熟的 0 个氨基酸组成的小分子多肽，分子中富含二硫键，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂 双头抑制剂，一个抑制剂分子具有两个抑制活性中心，可同时竞争性抑制两个胰蛋白酶分子。胰蛋白酶识别 基的侧链并以其肽键作为催化底物，一旦 能与活性中心的氨基酸之间产生 200余处非共价范德华力和氢键，使两者紧密结合，并使酶的活性中心对肽键的水解作用无法进行。 盖了许多能给农业造成重大经济损失的害虫，其中包括鳞翅目 、 鞘翅目及直翅目的某些害虫。已有将 马铃薯 、 杨树和棉花的报导，并显示出良好的抗虫性。抗虫测试表明，只要 上的转化植株，均表现出明显的抗虫性，而且 鉴定出的转 的棉铃虫进行抗性检测，四天后死亡率达 50%，存活的测试虫生长发育也明显地受到了抑制，而对照组则生长正常。目前，转 2,39,40。 伴随着转基因植物的发展，它的安全性越来越受到人们的关注。特别是随着转基因植物的商业化使用，引发了许多关于安全性的争论。一些国家制订了相应的法规，由特定的机构来管理转基因生物的试验和应用。美国在 1986 年公布了生物技术法规协调大纲，任何转基因植物，只要其供体 、 受体或所用载体含有植物病原体片段，就要受到该法规的约束。欧共体也在 1990 年发布有关转基因生物管理的指导，其中 90/219 针对封闭环境中的转基因生物的应用，90/220 针对转基因生物有目的的环境释放。我国也越来越重视转基因生物环境释放的安全问题 。原国家科学技术委员会于 1993 年 12 月发布了基因工程安全管理办法，要求转基因生物释放之前要进行安全性评价，农业部也已经实施了农业生物基因工程安全管理办法。我国自 1987 年以来已向环境中释放了大量转基因生物，但安全性评价环节还没能跟上科技的发展。由于转基因生物的释放可能造成全球性的环境问题，我国的大规模释放已引起国际上的关注，所以为了适应转基因植物的发展和应用的要求，我国必须迅速发展安全性评价 41。 在转基因植物进入商业化之前，必须考虑所引入的外源基因产物及中间产物对人及环境的影 响。对于转 虫蛋白基因棉花来说，主要考虑棉籽对哺乳动物及一些无脊椎动物的急性毒性和遗传毒性，此外还要考虑 白对土壤生物的影响。在实验室检测中，一般选择模式动物，喂饲大大超过期望剂量的纯化杀虫蛋白或棉产品，看模式动物有否急性中毒和遗传改变，以此来推测对目标生物的安全性。 北京大学硕士学位论文 11 在转基因植物的培育 、 筛选及安全性评价方面，检测手段都是十分重要的。在确定外源基因是否转入植物以及在对抗性种子进行筛选时，对于外源基因产物的检测都是必不可少的。在安全性评价方面，要分析外源基因在近源物种间的漂移，以及对其 产物在土壤 、 水体等介质中的扩散，也必须进行检测。国外在这方面的研究开展得较早，对于转 虫蛋白基因棉花，已发展了相应的检测试剂盒和检测试纸，但一般作为商业机密对技术和产品进行控制。国内在这方面则起步较晚，目前对于转 虫蛋白基因棉花中 虫蛋白的检测，通常采用的是生物测试法，以棉铃虫取食 组织后的死亡率 、 化蛹率 、羽化率 、 体重变化等作为指标。但它需要统一虫源 、 虫龄，统一饲养条件，并且占用的空间大，检测所需的时间长，环境因素干扰大，难以对大量的样品进行检测。另外，虫测所需样品量大，对苗期植株会造成伤害 ，影响后期生长。另一种方法是免疫测定（包括 纸条法），它利用抗原抗体特异性结合以及酶的高效催化原理，该法所需样品少，测定时间短，操作程序标准，检测极限高，可对大量样品进行检测 42,43。 在我国已有较大的推广面积，在育种和推广过程中，迫切需要一种快速 、 简便 、 准确的方法来检测棉花中杀虫蛋白的含量。现有的生物测试法已不能满足生产中的要求。本实验室在 863 项目的资助下，研究 杀虫蛋白的免疫学检测方法，制备出高效价的抗血清，研制出 测试剂盒，它对于研究杀 虫蛋白在棉花不同时期 、 不同组织的含量和分布，以及杀虫蛋白在土壤 、水体中的残留和扩散情况提供了一种可靠 、 方便 、 快速的手段。我们利用建立的 法，检测了 不同组织间杀虫蛋白含量的差异，以及同一生长季内， 不同时期杀虫蛋白含量的动态变化。可以对 育种和 后期的棉铃虫综合防治提供可靠依据。 北京大学硕士学位论文 12 材料与方法 1 材料与试剂 材料 青紫蓝兔：北京大学实验动物中心提供 科院动物所提供 棉种及棉组织：山西运城棉花研究 所，中科院植保所，南京农业大学提供 烟草组织：中科院遗传所提供 主要试剂 乙烯吡咯烷酮） 津天泰精细化学品有限公司 辣根酶标记山羊抗兔 司 司 司 血清白蛋白）： 弗氏完全佐剂： 弗氏不完全佐剂： 司 高分子量蛋白 主要仪器 高速冷冻离 心机： 酶标仪： 司 电泳系统：北京六一仪器厂 酶标板：天津有机玻璃厂 2 方法 苏云金杆菌晶体蛋白的提取 北京大学硕士学位论文 13 苏云金杆菌的培养 培养基 1号：鲜鲤鱼 100克，食糖 100 克，琼脂 30克，水 1000 毫升， 沸 15分钟。 培养基 2号：牛肉膏 3克，蛋白胨 10 克，食盐 5克，琼脂 18 克，蒸馏水1000毫升。煮沸 5,44。 将冷冻 号培养基上， 30复苏 48小时，然后以平推法将菌液涂布在 1 号培养基平皿上， 30保温，约培养 60小时，至芽孢和晶体分离（用石炭酸复红染色法观察） 16,45,46,47。 苏云金杆菌晶体与芽孢的分离 采用王瑛、白成 48的液体双相分离法，利用互不相溶的两种液体对晶体和芽孢的亲和力不同（即晶体、芽孢表面特性不同）达到分离目的。所用的两种液体为 1%硫酸钠水溶液与四氯化碳。具体的操作步骤如下： (1)收集菌，四层纱布过滤； (2)超声波破碎菌液，共 5次，每次 15秒。破碎过程注意冷却； (3)12,5005 分钟，去上清 ，沉淀用蒸馏水和生理盐水各洗一次并分别离心，收集沉淀物； (4)用蒸馏水将沉淀物打匀，用磁力搅拌器搅拌，去掉上层的泡沫，其中含有大量芽孢及较少的晶体与营养体碎片，重复多次，直至不再产生泡沫； (5)将去掉泡沫的悬浮液倒入分液漏斗，加入 1%硫酸钠水溶液与四氯化碳（悬浮液 :1%硫酸钠水溶液 :四氯化碳 =7:6:7）； (6)剧烈振荡 15温静置过夜，取上层水相； (7)12,5005 分钟，沉淀物即晶体蛋白。 分离后晶体显微镜下镜检，纯度在 95%以上。冷冻干燥后保存。 晶体蛋白 的分析 对晶体蛋白进行 49。 1品溶于 1品溶解液： 酸盐缓冲液内含 1%1%巯基乙醇， 10%甘油，酚蓝）。上层胶 3%，下层胶 7%。 从 生菌 30量为 65 晶体蛋白胰酶消化 取 0 的 冲液中， 37作用 2小时。 消化液同 2倍样品溶 解液等体积混合，在沸水浴中 3分钟终止酶反应， 北京大学硕士学位论文 14 50。 经 下的抗酶解多肽分子量约 60 晶体蛋白抗血清的制备 兔的免疫 用制备的晶体蛋白作为抗原，常规免疫年龄在 6个月、体重在 3体蛋白溶于 温过夜），以10析过夜 51。每次免疫每只兔子抗原量为1三次，第一次加弗氏完全佐剂制成油包水制剂 ,四脚掌注射，第二次加不完全佐剂制成 油包水制剂 ,背多点注射，第三次不加佐剂耳缘静脉注射，每次免疫之间间隔 30天 49,52。 透析袋的处理 : (1) 将透析袋剪成所需长度 ,约 10 (2) 将透析袋放入 1% 混合液中煮沸 10分钟 (3) 放入 1 液中煮沸 10分钟 , 用蒸馏水冲洗干净后放 入 70%酒精 4保存。 溶液配制 : 6000馏水中； 10钠缓冲液 ( 61%的 9%的 00 于100 1% 混合液 : 0g; 2蒸馏水 998 1 蒸馏水 998 在 800在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液的 需 20后定容至 1L，分装后高压灭菌备用。 抗血清的制备 兔颈动脉取血，放 4冰箱过夜 ,待血清充分析出 ,取血清，加入万分之二叠氮钠 (腐，分装后放入 箱长期保存 49。 免疫扩散实验（ 脂糖），测得抗血清效价为 1:64。 溶液配制： 北京大学硕士学位论文 15 脂糖 : 00的磷酸钠缓冲液 ( 实验步骤 在检测方法上，主要作了两个方面的改进，解决了假阳性的问题。 一是在样品提取液中加入可溶性 乙烯吡咯烷酮） ,沉淀其中大量的棉酚，降低其对杀虫蛋白检测的干扰；二是将抗血清用 掉抗血清中同棉花杂蛋白非特异性结合的 低检测的本底值。 检测的具体步骤如下 53： (1)取棉花样品，加 (2)8000上清，加可溶性 乙烯吡咯烷酮）， 10右 (3)8000上清，包被酶标板， 37保温 准蛋白：每孔 10 190 样品： 50 150 (4)用牛血清白蛋白封闭 1h； (5)加一抗， 37保温 (6)加辣根酶标记的羊抗兔二抗， 37保温 (7)加 (8)用 2 硫酸终止反应， 460 溶液配制 54： 冲液