【毕业学位论文】（Word原稿）几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究-高分子化学与物理

硕士学位论文 几种新型小分子荧光探针的合成 及性能研究 学 科 专 业 高分子化学与物理 学 位 类 型 科学学位 专业学位 研 究 生 姓 名 薛珊燕 导师姓名、职称 李海涛 教授 论 文 编 号 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一四年五月 分 类 号 密级 学校代码 10542 学号 201102121106 几种新型小分子荧光探针的合成 及性能研究 究生姓名 薛珊燕 指导教师姓名、职称 李海涛 教授 学 科 专 业 高分子化学与物理 研 究 方 向 有机合成 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一四年五月 I 摘 要 分子探针是一种将分子间的相互作用转换为光学信号传递给外界的工 具。因其专一的选择性，较高的灵敏度和操作简易等优点，近年来引起了广大研究者的兴趣，被广泛用于医药、化学及生物科学等领域。苯并噁唑、芴、吲哚菁等荧光染料由于有优越的光学和物理性能、量子产率高且稳定性好等特点，被广泛用作荧光基团用于分子探针的设计合成。本论文以苯并噁唑、芴及吲哚菁类化合物为荧光基团，分别构建了以半胱氨酸、汞离子、水合肼为目标待测物的分子探针。具体内容如下： （ 1）利用醛基与半胱氨酸特异性成环的反应机制，设计并合成了一种新型荧光增强型分子荧光探针。该探针对半胱氨酸的响应是基于 分子内电荷转移（ 原理：未加半胱氨酸时，探针的荧光很弱；当加入半胱氨酸后，探针结构中的醛基与半胱氨酸反应成环，因探针分子结构发生变化，探针分子内 荧光显著增强。该探针对半胱氨酸有很好的选择性和较高的灵敏度，检测下限可达 0。 （ 2）针对聚芴类荧光探针难纯化的缺陷，本文选用小分子芴作为荧光基团，通过 9位上修饰的羧基与噻吩甲胺的酰胺反应，合成了一种含有杂原子 N、 S、 O 的新型多酰胺识别基团的分子探针，能特异性的识别 未加入 ，探针有很强的荧光；当加入 ，探针识别基团中的 杂原子 O、 合，使 荧光基团芴环上的 电子作用，降低了共轭体系的电子云密度，导致荧光猝灭。据 ，设计并合成了一种新型的荧光猝灭型 光探针，该探针具有选择性高、检测限低、响应时间短等优点，并能用于实际环境水样中检测。 （ 3）本文针对单官能团转移策略设计的分子探针选择性差的缺点，设计并合成了一种基于双功能团转移策略的分子探针。选用近红外染料作为探针分子的荧光基团，将其与识别基团三氟乙酰丙酮通过苯酚基团连接，构建了一种近红外分子探针。由于三氟乙酰丙酮和肼发生 应 ，减小了探针分子的共轭结构，导致探针在 760 而可实现对水合肼的比色检测，并用于实际环境水样中水合肼的检测。 关键词： 荧光分子探针；半胱氨酸；汞离子；水合肼 is a of so in in as in to In as as (1) on of a is on of CT a 0. (2) In to of on in as , S of of , S of to a be to in (3) In to of by a on In a by Cl as a of to 60 be to in 目 录 摘 要 . . 第一章 绪论 . 1 光分子探针的结构 . 1 光基团 . 1 别基团 . 1 接基团 . 2 光探针分子的分类 . 2 据荧光基团进行分类 . 2 据识别基团分类 . 4 据识别机理分类 . 7 光分子探针在分析检测中的应用 . 9 类荧光分子探针 . 10 并噁唑类荧光探针 . 10 哚菁类荧光分子探针 . 11 文构思 . 11 第二章 苯并噁二唑类荧光探针的合成及对半胱氨酸的检测 . 13 言 . 13 验试剂及仪器 . 14 针 合成与表征 . 14 胱氨酸的测定 . 16 果和讨论 . 16 针的光谱性质 . 16 胱氨酸的检测原理 . 16 测条件的优化 . 18 针的分析性能 . 20 针与半胱氨酸反应比例 . 21 择性研究 . 21 论 . 22 第三章 一种新型含芴荧光探针的合成及其对 检测 . 25 言 . 25 验部分 . 26 学试剂及仪器 . 26 针 合成与表征 . 27 检测 . 28 果与讨论 . 28 针的光谱性质 . 28 针对 响应机理 . 29 测条件的优化 . 30 针的重复性考察 . 31 线的测定 . 32 检测分析 . 33 择性研究 . 34 样 检测 . 34 论 . 35 第四章 一种近红外分子探针的合成及其对水合肼的检测 . 39 言 . 39 验部分 . 40 学试剂及仪器 . 40 针 F 的合成及表征 . 40 果与表征 . 43 针的表征 . 43 合肼的检测原理 . 43 测条件的优化 . 44 针的分析性能 . 46 择 性考察 . 47 品检测 . 47 论 . 48 结论 . 52 参考文献 . 53 湖南师范大学学位论文原创性声明 . 60 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 . 60 几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究 1 第一章 绪论 荧光分子探针技术是荧光分析方法中重要手段之一。一般而言，当某物质周围的环境发生变化（如酸碱度、黏度、温度或溶液中的待测物等）时，导致该分子的荧光信号，如激发和发射波长、荧光强度、荧光寿命以及偏振等，发生相应的变化，这种分子就可称作某物质的荧光分子探针 1。其核心是把分子间的相互作用转变为光学信号传递给外界 2实际检测分析中，该方法具有诸多优势，具体体现在如下两方面：一，具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围；二，和传统的检测方法相比，具有操作简单、价格便宜、选择性专一等优点，并且能实现同时对单个或多个目标物的检测。因此，设计并合成灵敏度高，选择性好的荧光分子探针受到越来越多的研究者的关注。近几十年来，荧光探针技术得到了快速的发展，并在各个领域都有极广泛的应用。 光分子探针的结构 荧光分子探针主要是由三个部分组成，即荧光基团、连接基团和识别基团。荧光基团是发出光学信号的信息源，识别基团是可以与待检测物特 异性结合的基团，而连接基团是连接荧光基团和识别基团的部分。 光基团 荧光基团，又称为发色基团，是分子探针最基本的组成部分。在特定光的激发下，荧光基团能够吸收一定波长的光，产生能级跃迁，从而将分子识别信号转化为荧光信号。荧光基团的选择对识别信号的表达有很大的影响。对于不同的荧光基团，其发射波长、量子产率和斯托克（ 移都会有所不同。因此，设计荧光分子探针时，要根据实际检测的需要来选择不同类型的荧光基团。一般而言，所有具有荧光性质的化合物都可用作荧光探针的荧光基团。常见的荧光基团主要有： 菁染料类 6香豆素类 9稠环芳烃类 13吖啶衍生物类 16苯并噁唑类 19, 20、萘酰亚胺类 21氟化硼二吡咯（ 24。 别基团 识别基团，又可称为检测基团或受体，是为实现对目标被测物选择性识别而设计合成的结构单元。识别基团的选择和设计对荧光分子探针的性质和性能有很硕士学位论文 2 大的影响，并决定了探针的灵敏性和抗干扰能力。一般来说，识别基团是通过配位作用力、氢键、静电引力、 德华力或偶极 荧光基团的光化学性质和光物理性质产生明显变化。因此，在设计合成荧光探针分子时，必须根据超分子化学的一般原则，谨慎地选择合适的识别基团，使得识别基团与被测物在某些性 质上可以高度专一地相互作用。即识别基团的空穴大小和形状、配位原子的种类和数目等性质要与被测物的特性相匹配或者是该识别基团可与某检测物特异性反应。一般来说，常用的识别基团主要是吡啶类、多羧酸类、冠醚类或胺类化合物等。识别基团的广泛研究大大扩展了荧光探针的种类，在化学和生物传感领域发挥着重要作用。 接基团 连接基团是连接荧光基团和识别基团的桥梁。识别基团识别目标物后，连接基团会把识别基团的识别信号通过某种传递机制传递给报告器，随后转换为荧光信号。传递机制直接决定了信号的性能，影响着整个识别事件的表 达。迄今为止，已报道的探针中识别基团和荧光基团的连接方式主要有共价键连接和置换式两种。一般来说，将已报道的荧光基团和识别基团通过连接基团构建新的分子探针时，基本上可以预测该分子探针的选择性和荧光性质。但这并不是绝对的，因为荧光探针的设计和合成是个系统工程，其整体设计对探针的性质和性能有着至关重要的影响。如相同的识别基团连在不同荧光基团上，或者相同的识别基团和荧光基团通过不同的连接基团连接，可能会产生完全不同的效果，对不同的目标物具有专一选择性 27, 28。同时，环境的差异（如溶剂、温度、 相同的荧光基团的荧光性质也有很大的影响。正是由于探针设计的多样性和不可预测性，探针的设计和合成在很长一段时间内都将是科研工作者研究的热点。 光探针分子的分类 对于荧光 分子探针的种类，目前没有明确的分类界限。一般而言，我们可根据荧光基团的发射波长、识别基团和检测机理的不同进行分类。 据荧光基团进行分类 不同的荧光基团，具有不同的发射波长。按荧光基团发射波长的差异，我们几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究 3 可以将荧光探针分为紫外可见光区荧光分子探针和近红外荧光分子探针。目前已报道的紫外光区的荧光基团有芴类、苯并噁唑类、荧光素类等，而近红外荧光基团主要有吲哚菁类、卟啉类等（如图 1he of 类 芴是一种具有刚性平面、联苯结构的化合物。该化合物及其衍生物具有良好的热稳定、光稳定和化学稳定性，化学可修饰性强，荧光量子产率高，带隙能宽等优点，近年来被广泛用于电致发光材料和荧光传感。芴环结构中两苯环间的亚甲基由于受苯环的影响，使 9位的氢非常活泼，同时 2位和 7位上的氢活性也很高，通过对这三个位点进行修饰，可改善化合物的溶解性和结构，还可使激发和发射波长向长波方向移动。 并噁唑类 苯并恶唑类化合物，是一种重要的杂环化合物，主要用于医药、生物、光学材料等领域。由于苯并噁唑类化合物具有较强的荧光，且光稳定性好，激发和发射波长都处于可见光区，近年来已渐渐被开发和用作荧光染料。 光素类 荧光素，又叫做荧光黄，是具有光致荧光特性的一种染料。 1871年， 此以后，被广泛应用于化学、生物、医学等各个领域。该分子存在两种异构体形式：内酯型和醌型。两个苯环被氧桥键固定在同一平面上，使得分子具有共平面的刚性结构，在激发光下能产生强烈荧光。荧光素具有较高硕士学位论文 4 的消光系数和量子产率，良好的水溶性，无毒副作用且激发和发射波长都在可见光 区等优点。通过对荧光素的活泼氢和苯环上的氢进行取代或者在荧光素底环上引入羧基、氨基等各种活性基，可以实现对不同目标物选择性检测。 哚菁类 吲哚菁类染料是一种近红外染料分子，发射波长在 600结构通式是共轭甲川链两端连接有吲哚环。根据甲川链两端的连接基团是否相同，可以将吲哚菁类化合物分为对称型和不对称型两种。根据甲川链中是否有刚性桥环，吲哚菁染料还可以分为线性多甲川和刚性桥环多甲川两种。已报道的刚性桥环多甲川吲哚菁染料主要有两大类：一种是在共轭多甲川链中引入刚性环，如方酸环 、克酮环 29、环己环及多环等；另一种是在共轭甲川链中引入杂环，如呋喃环、噻吩环等。目前，已报道的刚性桥环多甲川菁染料一般是在多甲川链中引入环己环，以提高染料的稳定性。 啉类 卟啉化合物是含有四个吡咯结构的十六元环芳香环化合物。由于具有大的刚性芳香环结构，其激发和发射波长较长，在近红外区。卟啉类化合物还具有环内电子流动性较好、环平面易修饰等优点。目前，可以通过各种化学修饰的方法将其用作发光和荧光传感材料。但是，卟啉类化合物一般存在极严重的浓度淬灭现象，因此设计合成具有高荧光量子产率的卟啉类化合物一直是研 究者致力的方向。 据识别基团分类 荧光探针对目标被测物具有专一选择性，主要是探针中的识别基团与目标被测物可以相互作用或发生特异性反应。根据被测目标物性质的不同，识别过程可以分为如下几类：一，对球形物质的识别，主要有金属阳离子或卤素阴离子等。该识别过程基本上是利用球形物质的半径大小与识别基团空腔匹配螯合。二，对生物小分子的识别，如谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸等。改识别过程一般是根据这些物质和识别基团的特异性反应来实现。三，对化学小分子的识别，如水合肼、活性氧、活性氮等。 属离子的识别 几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究 5 对金属离子的识别一般是通过识别基团与和金属离子的络合来实现的。一般而言，氮、氧、硫杂原子与金属离子有较强的络合能力，已报道的能够识别金属离子的识别基团主要有冠醚和氮硫杂冠醚类、吡啶类和多羧酸类化合物。 0等用硫氧杂冠醚作为识别基团，设计并合成了探针 1，络合 会使探针荧光发生变化，实现对 选择性检测。 1等人设计了一类以多乙氨基吡啶为识别基团的探针 2， 与氮原子络合，导致探针荧光发生变化，从而实现对其检测。 1he of . 生物小分子的识别 对生物小分子的检测主要是对硫醇化合物的检测，一般是根据其与探针识别基 团特异性反应来实现的。其识别机理主要有以下几类： 1）基于亲核加成反应识别 ， 2011年， 2实验组在香豆素上引入烯醛结构，合成了探针 3，与半胱氨酸发生亲核加成反应，导致探针发生荧光比率，实现对其选择性检测。 2）基于磺酰胺或磺酰酯断裂识别。 2013年，本课题组报道了探针 433，当探针与谷胱甘肽或半胱氨酸发生亲核取代后，磺酰酯键断裂使香豆素游离出来，荧光恢复，达到检测的目的。 3）基于二硫键断裂识别。 4等设计并合成了一种以 ，与硫醇化合物反应后，二硫键被还原断裂，生成罗丹明 110，荧光恢复。 4）基于波 35课题组报道了一种以罗丹明为荧光基团， 。硫醇化合物与探针反应，使 断裂，使罗丹明游离出来，荧光增强，该探针能选择性检测硫醇化合物。 1 2 硕士学位论文 6 1he of , 4, 5 . 化学小分子的识别 近年来，研究者们对化学小分子（如水合肼，活性氧，活性氮，硫化氢等）的检测产生了浓厚的兴趣。越来越多的关于检测此类化合物的荧光探针被相继报道。 . 6等设计合成了一种检测水合肼的新型荧光探针 7，利用三氟乙酰丙酮与水合肼特异性反应生成五元环，使探针荧光增强，实现对水合肼的特异性检测。对双氧水的检测主要是基于氧化机理。如荧光探针 8，利用 与荧光基团中氨基连接的 二羟基硼基苄氧羰基）衍生物脱落，探针荧光发生变化，从而实现对 37。 1he of . 几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究 7 据识别机理分类 基于荧光分子探针的识别机理，我们大致可以将探针分为如下几类： 诱导电子转移（ 基于 甲基、乙烯基或不共轭的苯环等）连接的。如图 1示，识别基团 未与目标检测物结合时，由于 针的荧光被猝灭，但当识别基团识别目标物后，针的荧光恢复或增强，通过荧光的变化可实现对目标物的检测。可用前线轨道理论（图 1一步解释此机理：荧光基团受光激发后，识别基团 道上的电子会占据荧光基团的 道，使荧光基团 能产生辐射跃迁，荧光发射被阻断。当识别基团与目标物结合后，识别基团的 道能级降低到原荧光基团 致被激发的荧光基团 光产生。 前已报道了大量关于 理的荧光探针。 8课题组设计了两种基于 理的近红外荧光探针 9， 10。由于 程，探针分子的荧光较弱，当加入谷胱甘肽后， 断裂， 程中断，荧光恢复，可实现对谷胱甘肽的体外和体内检测。 1he of ET 1he ET ET 士学位论文 8 1he of 0. 子内电荷转移（ 荧光基团与识别基团是共轭连接的。因此也可把荧光探针当作是在荧光基团上连着强吸电子基和供电子基的电子推 探针分子被光激发后，分子内电荷从电子供体到电子受体的转移会增加。但当识别过程发生后，探针分子内的电荷转移会受到影响，一般会导致紫外和荧光发生变化，可实现对检测物的比率检测，避 免检测误差。近年来，越来越多的 针被相继报道。刘晓兵 39课题组设计合成了一种基于 理的荧光探针 11，利用 叠氮还原成氨基，探针分子内电子转移发生变化，致使探针溶液荧光增强，从而实现了对 1he of 1. 光共振能量转移（ 指两个不同的荧光基团间发生共振能量转移的过程。 程的发生必须要满足两个基本条件：一，一个荧光基 团的发射光谱和另一荧光基团的吸收光谱要有较好的重叠；二，两个荧光基团之间的距离要合适，一般是10为两个荧光基团间的距离越长， 率就越低。当供体荧光基团受光激发后，可通过非辐射过程把供体能量部分或全部传递给受体荧光基团，激发并诱导受体荧光基团发出荧光。此外，要找到合适的供体和受体荧光基团，几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究 9 还对其溶解性、荧光量子产率、消光系数和选择性等都有一定的要求。可见，找到一对合适的供体 针 1240是基于 探针选用 料和罗丹明染料作为一对供体 未加入半胱氨酸时，可实现荧光能量共振转移，探针发 红色荧光。但加入半胱氨酸后，连接基团中的硫醚键被切断，罗丹明以内酯的形式游离出来，没有荧光，针溶液表现出 绿光。通过荧光光谱的变化，可实现对半胱氨酸的比率检测。 1he of 2. 基缔合物（ 激基缔合物是指一个激发态的荧光基团与另外一个相同或不同基态的荧光基团接近时，由于 成激基缔合物，可观察到单个荧光基团和激基缔 合物的双重荧光。通常，要形成激基缔合物必须满足两个条件：一是两个荧光基团间必须存在轨道堆叠，二是激发态和基态分子间的 碰撞 距离必须在 此，在设计荧光探针时，合理控制好荧光基团之间的距离是设计激基缔合物机理类荧光探针的关键。一般而言，利用各种分子间的作用力可以改变两个荧光基团间的距离，促使激基缔合物的形成，通过目标检测物与探针结合前后单体和激基缔合物荧光的变化，实现对目标化合物的检测。常用于合成激基缔合物机理探针的荧光基团有萘、芘、蒽等。 1等设计合成了一类基于激基缔合物机理的荧光探针。通过识别基团将两个相同的荧光基团芘连接起来，当加入 ，与识别基 团中的 N、 O 原子络合，使两个芘单元的距离增大，导致激基缔合物发射峰发生猝灭，荧光消失，从而实现对汞离子的检测。 光分子探针在分析检测中的应用 荧光分子探针在分析检测中的应用极广。通常，荧光分子探针 主要是用于 重硕士学位论文 10 金属离子的检测、小分子化合物的检测、生物大分子的检测以及生物成像。对于不同类型的荧光分子探针，其在分析检测中的应用是不同的。 类荧光分子探针 芴及其衍生物是一种具有较高荧光效率、良好溶解性、较宽能隙带且具有双光子性质的一类荧光传感材料。通过对 2， 7， 9位进行结构修饰，可以改善其化学性质和物理性质。目前，以芴及其衍生物为荧光基团的荧光探针被报道的不是很多。利用芴及其衍生物的高荧光量子产率和双光子性质，用于生物成像、小分子和金属离子检测。 C. D. 2等合成了一种含噻吩的炔基芴类分子探针13。该探针有很高的量子产率和较好的双光子吸收，可用于 16细胞成像。 3等报道了一种水溶性的聚芴 于草酸的检测。未加草酸时，聚合物有较强的荧光，当加入草 酸后，草酸中的双羧基会引起聚合物交联形成紧密的 致聚合物自身荧光猝灭，从而实现对草酸的检测。. 4等用芴作为荧光基团，设计合成了一种双光子荧光探针 14。该探针选含 N、 合后，引起探针的荧光变化，实现对 双光子检测。 1he of 3 4. 并噁唑类荧光探针 苯并噁唑类化合物是一类含有 N、 杂原子的一类化合物。该类化合物荧光较强、光稳定性较好，对 2， 4位进行结构修饰，可改变其激发和发射波长。近年来，设计并合成基于苯并噁唑类荧光基团的小分子探针，用于离子检测 ， 逐渐受到研究者们的关注。 u20等设计合成了一类双苯并噁唑荧光探针，当加入的 与探针中的 N、 诱导激发态分子间的质子转移，导致荧光增强，从而实现对 检测。 2013年， o45等报道了一类硅烷乙炔基取代的苯并二噁唑类荧光探针，利用 断几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究 11 裂，导致探针溶液荧光增强，从而实现对 哚菁类荧光分子探针 吲哚菁类染料是一种近红外染料，在分析检测时可以消除紫外区的背景干扰，因此以吲哚菁类染料为荧光基团设计合成荧光分子探针深受广大研究者的喜爱。由于刚性桥环多甲川菁染料相比线性多甲川菁染料更稳定，因此，在设计探针时一般引用多甲川链中含环己环或苯环的吲哚菁染料。目前，已有许多关于吲哚菁类荧光探针被报道，且主要是用于金属离子和小分子的 检测。 2013 年，6等人合成了一种荧光增强型吲哚菁类分子探针。聚乙二醇 400 可将二价钯还原成零价钯，利用零价钯可催化 率检测钯离子。 7课题组设计合成了一种检测双氧水的吲哚菁类荧光探针。未加双氧水时，探针溶液呈黄色，荧光很弱。加入双氧水后，双氧水会切断与染料连接的醚键， 苯环变为醌式结构，探针溶液呈深蓝色，荧光增强，可实现对双氧水的比色比率检测。 文构思 荧光分子探针由于对目标待测物具有实时检测和空间分辨检测的能力，且样品损伤少等优点，越来越受到人们的关注。有机小分子荧光探针具有设计灵活和易于修饰等特点，很容易达到特殊检测的要求，已成为国际上研究的热点。本文的工作主要是