【毕业学位论文】（Word原稿）肉仔鸡对小肽的吸收转运及其调控研究动物营养与饲料科学博士论文

i 密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 肉仔 鸡对小肽的吸收 转运 及其调控研究 要 本课题研究了 肉仔鸡 对小肽吸收的机理和日粮、激素和活性因子对小肽转运 载体 的调控作用，并比较研究了不同蛋白质原料在肉 仔 鸡消化道生成 可吸收 小肽的 规律 。 试验一 研究 了温度、酸度、培养液成分、样品前处理等理化 因素对 稳定性的影响。将 别进行含 养 液溶解 、 恒温培养 30 高氯酸溶液稀释 、 含 养 液 稀释并煮沸 5 高氯酸溶液稀释 并煮沸 5处理。结果表明，上述处理后 3 种二肽的回收率均在 97%以上。 试验二 研究了 鸡离体小肠各段的水解以及肽酶抑制剂抑制二肽水解的效果。将 12 只成年产蛋 鸡分为 4 组，每只为 1 个重复，取小肠分为十二指肠、空肠前段、空肠中段、空肠后段和回肠，制备外翻肠囊，分别在含有不同二肽（ 添加和不添加肽酶抑制剂（ 理组成的 4 种培养液中培养。结果表明，鸡离体外翻肠囊培养液中存在迅速而强烈的二肽水解现象，培养 5 部被水解，而 25则被完全水解，其中以小肠前段的水解作用更为强烈。添加 10 能抑制 水解，但可有效抑制 水解， 培养 25仍有 40%的 被水解。 试验三 研究了日粮氮源形态对肉仔鸡离体小肠 收转运及血清小分子肽含量的影响。 选取预饲 氨基酸、酪蛋白水解物 和 酪蛋白氮源的 等能等 氨基酸 纯合日粮 3 周的肉仔鸡各 9 只，取 十二指肠、空肠和回肠，制备外翻肠囊， 分别在空白培养液、氨基酸培养液和 养液 培养 25定黏膜液、浆膜液和组织匀浆液中的 量。结果表明， 日粮氮源形态显著影响肉仔鸡离体小肠对 吸收，酪蛋白 组 吸收 多， 酪蛋白水解物 组 吸收最少。离体小肠不同肠段吸收 能力有显著差异，十二指肠吸收能力显著低于空肠和回肠。 日粮氮源形态影响鸡血清肽分子量分布， 氨基酸 组 血清小分子肽比例显著高于酪蛋白水解物和酪蛋白 组 。 试验四研究了鸡肽转运载体 因表达的 定方法以及 肉仔鸡 小肠 分布规律。 根据鸡肽转运载体 看家基因 列，分别设计 物各 1 对，并通过 度、循环数等 件的优化，建立了包括 取、反转录、 鸡小肠 因表达检测方法。采用该方法研究了肉仔鸡 因在小肠各段的表达差异。结果显示，肉仔鸡小肠 达水平 随小肠近端到远端逐渐 降低，回肠表达水平显著低于十二指肠和空肠，十二指肠和空肠差异不显著。 试验 五 研究了外源 激素和生长因子对肉仔鸡 因表达的调控作用。 25 日龄肉仔鸡 30只随机分为 5 组，分别接受 表皮生长因子、甲状腺素、胰高血糖素、甲巯咪唑刺激，330 g， 25mg/重 ， 对照组注射蒸馏水，刺激为每日 1 次，连续 5d， 取小肠测定肽转运载体 度。结果表明，甲状腺素和胰高血糖素在 转录水平 显著上调鸡肽转运载体 因表达，而甲状腺素抑制 剂 甲巯咪唑 和表皮生长因子 则有下调 因表达的趋势。 试验六比较研究了不同蛋白质饲料在肉仔鸡消化道内水解释放小分子肽的特性。 35 只 21 日龄肉仔鸡，分为 7 组 ， 分别强饲 70%待测 饲料（豆粕、鱼粉、菜籽粕、花生仁粕、玉米蛋白粉、血粉、棉籽粕）和 30%淀粉的混合物 50g，研究各种饲料在消化道水解释放小分子肽（ 花生仁粕 血粉 玉米蛋白粉 豆粕 鱼粉 菜籽粕。 关键词 ： 肉仔 鸡 ， 小肽 ， 吸收 ， 基因表达 ，调控 ix to of of by of on of in of of in to of by BS 0 f 57% to in of in of or of in at of of 5in of 0 in 0% 5 to of on of in of in of 1 of in 5in in in of by of to of in of to by iv to of in in no to of in 5 by d, in on to to of in of 1 0% 0% by of in No of v 目 录 第一章 绪论 1 1 小肽的吸收和转运特点 1 2 小 肽的吸收和转运机制 2 3 小肽转运的营养意义 7 4 小肽吸收转运的研究方法 9 5 本论文的立题依据和研究目的 11 第二章 试验研究 13 试验一 理化因素对二肽稳定性的影响 13 1 前言 13 2 材料和方法 14 3 结果 15 4 小结 16 试验二 鸡离体小肠中 水解 17 1 前言 17 2 材料和方法 17 3 结果 18 4 讨论 19 5 小结 20 试验三 不同氮源日粮对 肉仔 鸡离体小肠 收转运的影响 21 1 前言 21 2 材料和方法 21 3 结果 24 4 讨论 26 5 小结 27 试验四 半定量 评定鸡小肠肽转运载体 因的表达 28 前言 28 2 材料和方法 28 3 结果 30 4 讨论 32 5 小结 32 试验五 外源表皮生长因子、甲状腺素、胰高血糖素对 肉 仔鸡 小肠肽转运载体因表达的调控 33 1 前言 33 2 材料和方法 33 3 结果 35 4 讨论 36 5 小结 37 试验六 不同蛋白饲料在肉 仔 鸡消化道中释放小肽的特性 38 1 前言 38 2 材料和方法 38 3 结果 40 4 讨论 41 5 小结 43 第三章 结论 44 参考文献 46 致谢 57 作者简历 58 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 传统蛋白质营养 理论认为，饲料完整蛋白质首先在胃酸的作用下变性，暴露肽键，然后在胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等内切酶的作用下降解为长短不等的多肽链。在小肠中，多肽经羧肽酶和氨肽酶等外切酶的作用生成游离氨基酸而备吸收利用。在此过程中，肽仅仅是蛋白质消化过程中的中间体 ，并无任何营养意义。 直到二十世纪五、六十年代首次提出肽完整吸收的证据后，人们才开始注意到肽潜在的营养意义。 1957 年至 1962 年间所进行的研究发现，在蛋白质消化过程中，除了生成游离氨基酸外，还有大量的小肽生成，而且肽可完整进入肠黏膜细胞，并在黏膜细胞中进一步水解成氨基酸，而后进入血液循环（ 1962）。随后 （ 1968）进一步证实小肠可大量摄取肽。（ 1984）首次在小肠黏膜上发现了小肽载体， （ 1994）则成功地克隆了 I 型小肽载体（ 至此，小肽能 被小肠吸收的观点才被广泛接受，小肽营养成为蛋白质营养研究的新领域。 1 小肽的吸收和转运特点 大量的研究表明，进入小肠的日粮蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化，生成氨基酸和小肽的混合物，小肠中蛋白质消化产物的吸收主要以小肽形式而非氨基酸的形式进行（ ，1984）。而 动物对肽的吸收有其完全不同于氨基酸吸收的机制。 已知氨基酸逆浓度梯度的主动转运因中性、碱性、酸性氨基酸和亚氨基酸四类氨基酸而存在四种转运系统，其转运是通过不同的 或非 转运系统进行的，其中以依赖 的耗能转运方式为主（ ， 1980； 1991）。 与氨基酸转运系统相比， 由于肽转运系统具有耗能低而不易饱和的特点，哺乳动物对肽中氨基酸残基的吸收速度大于对游离氨基酸的吸收速度（ ， 1984； 1988； 1992），吸收效率也更高。 1984）报道，来源于小肽的氨基酸吸收速率较游离氨基酸更快更稳定，表明肽转运系统的容量大于氨基酸转运系统，不易饱和。 （ 1980）采用肠道灌注技术研究表明，人对水解酪蛋白和乳清蛋白水解物中 吸收多于等摩尔组成的游离氨基酸混合物，各种氨基酸之间的吸收差异也较小，即氨基酸的吸收更为均匀或平衡。 （ 1984）的实验结果也表明，大鼠对鸡蛋白蛋白酶解产物的氨基酸利用效率比相应游离氨基酸高，因而具有更高的营养价值。 （ 1988）报道，对饥饿 8 小时的猪在十二指肠灌注乳水解产物，发现其中氨基酸的吸收量比等摩尔相同氨基酸组成的游离氨基酸混合物更多，吸收速度也更快。乐国伟等（ 1997）研究麻醉条件下公鸡十二指肠灌注酪蛋白水解寡肽 与 游离氨基酸对门静脉血液中氨基酸和肽的影响也发现，鸡对寡肽中氨基酸 的吸收速度显著快于游离氨基酸。赵昕红（ 1998）从仔猪十二指肠灌注二肽（ 等量氨基酸混合物，观测肝门静脉中氨基酸含量的变化。试验发现，仔猪肝门静脉对二肽中来的赖氨酸的摄取速度及吸收量要远大于对游离氨基酸混合物中赖氨酸的摄取；来源于肽的甘氨酸吸收总量也高于游离氨基酸混合物。 另一方面，氨基酸以小肽形式吸收可避免某些游离氨基酸在吸收时对转运系统的竞争，从而中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 提高转运效率。赵昕红（ 1998）发现，灌注二肽（ ，仔猪对其他大部分氨基酸的吸收量也高于灌注等量的两种游离氨基酸。 （ 1994）则认为，肽载体转运能力可能高于各种氨基酸载体转运能力的总和，并且在蛋白质消化过程中，以肽形式存在的氨基酸浓度远比游离氨基酸存在的浓度大，而且肽的吸收速度也快。 （ 1993）报道，小牛经消化道的肽结合氨基酸流量大约比游离氨基酸流量高 。 还有研究表明，肽形式存在的氨基酸可降低高浓度时某些氨基酸的毒性作用。在饥饿、限饲、胃肠疾病、手术后的伤口愈合期、动物的快速增长与高产期及某些氨基酸吸收障碍的先天性疾病中，以小肽形式补充氨基酸，可改善动物或人的氨基酸吸收，满足机体对氨基酸和 氮的需求。如胱氨酸尿症患者不能吸收游离精氨酸，但可以正常吸收 ， 1975）。而患有 传性氨基酸代谢病）的患者不能吸收游离的中性氨基酸，但可以吸收肽结合的中性氨基酸（ ， 1976）。感染隐孢子虫对大鼠肠道的损伤导致氨基酸营养吸收障碍，但对二肽的吸收能力代偿性增强（ ， 2003）。此外小肽（特别是二肽、三肽）的低抗原性，也使得食后不会引起过敏反应；小肽较氨基酸更低的渗透压，也 有利于减少 腹泻等不良反应。 基于氨基酸以小肽形式转运的诸多优点，预示 着小肽可能在人类和动物蛋白质营养方面发挥着重要作用。 2 小 肽的吸收和转运机制 研究证明，小肠肽的转运是有转运载体蛋白参与的二肽和三肽的跨膜转运。已知肽的跨膜转运是生物的共同特征。肽跨膜转运的显著特点主要表现为在生物进化过程中转运蛋白及其肽转运机制的保守性。有机物质的跨膜转运往往与跨膜的离子梯度相耦联。对于微生物，氨基酸、糖和肽转运的主要驱动力是跨膜质子梯度，而动物界氨基酸和糖的跨膜转运的驱动力进化为 度，但小肽转运机制则在进化过程中被保留下来，成为一种完全有别于其它物质的独特转运机制。 生物同时具备肽 转运的质子驱动力和氨基酸转运的 动力对于维持最佳的蛋白质营养具有重要作用，这样就可以防止氨基酸和肽转运中对能量的竞争，从而保证两种转运系统能够同时发挥作用。 肽转运载体 目前已发现的高等动物体内的肽转运载体蛋白有 5 种，包括 鼠的肽 /组氨酸转运载体（ 人的肽 /组氨酸转运载体 (韩飞等， 2003）。其中研究最多的是 表达部位主要在消化道，在肾脏中也有微弱的表达， 表达部位则主要在肾脏。 小肠对小肽（主 要是二肽和三肽）的吸收是通过位于小肠上皮细胞刷状缘膜的 H+耦合的肽转运载体（ 行的（ 1996），而质子是作为肽转运的驱动力发挥作用的（ 1985）。 迄今为止， 唯一被克隆的小肠肽转运载体。目前已经从人类（ ， 1995）、大鼠（ ， 1995）、小鼠（ ， 2000）、家兔（ ， 1994； ， 1994）、绵羊（ 2001）、 鸡（ ， 2002）、猪（ ， 2005） 和人结肠癌细胞 ，1998）中克隆出该载体蛋白。此外也在猪、牛、鸡、羊和鳗鲡（ ， 1999； ， 1999；， 2000）小肠以及人胰腺癌细胞 ， 1998）和其他人类癌中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 细胞（ ， 1997 和 2000）中测得 能性研究发现， 转运系统还存在于人类肠细胞 1988），以及猴（ ， 1977）、 仓鼠（ ， 1975）、天竺鼠（ 1980）、蟾蜍（ ， 1987）、豹蛙（ 1974）、斑泥螈（ 1982）的小肠中。由此可见 运系统是脊椎动物蛋白质代谢的共同特征。 肽的转运是一个复杂的生理过程。大量研究表明， +-/肽耦联的转运载体（ 1991）。该载体利用从肠腔（ 1975）到肠细胞（ 1984）的质子梯度转运二肽、三肽（ 1972； 1990； 2005）。 与 K+， 关（ 1994； 001； 2002），而该质子梯度是由肠细胞腔面膜的 H+泵所建立和维持的（ 1999）。根据研究结果推测， H+和肽分子一起穿过上皮细胞腔面膜被 合于腔面膜的 H+交换系统再将 H+泵出 细胞，同时将 换入细胞，以维持跨细胞膜的质子梯度驱动力，同时结合于基底膜的 K+a+泵出细胞，以维持胞外到胞内的 度（ 1985）。因此从总体来看，肽的转运也是一个耗能的过程。 也有不同于上述假说的一些观点。 1997）认为， H+泵产生的 能还有碱性载体（如 ）参与这一过程。也有学者认为肽的转运不是单向的。 2002）采用膜片钳研究 一些二肽如 向细胞外转运，并且可能通过影响周转速率增强内向电流。 1993）和 1999）也观察到小肽分子经基底膜的反向转运现象。 对肽转运过程详细机制的了解仍然不多。目前仅仅知道质子耦联的肽转运是一个有序而同步的转运模型，其中先与 1996）。 对 自不同物种的 中鸡的序列最长，为 714个残基（ 2002），兔和牛的最短，为 707个残基（ 1994；2001），但其分子量均为 79且分子结构也大体相同。据预测，不同物种的 2个跨膜区（ 1994； 1995； 1995； 2000； 2001；2002），在第 9和第 10个跨膜区之间存在一个大的亲水环。氨基酸序列分析表明，在大的胞外环上有 3（兔 1994）到 7个（ 1995）潜在的 部 分物种的 和一个蛋白激酶 人的 有 则有 4个 个 同物种的 鼠 7%和88%的同源性（ 1995）。兔和人的 1%的同源性（ 1995）。鸡 、小鼠、大鼠和绵羊的 同源性，绵羊 鼠和兔的 3%、 81%和 78%的同源性（ 2005）。 不同动物 所研究的所有动物小肠都有 在肌肉、心脏未检出 他部位的表达情况则因动物而异。鸡的全部小肠、肾脏和盲肠中都有 囊、腺胃和肝脏没有（ 1999）。兔除了小肠，还有肾脏、肝脏都有少量表达，大脑有微量表达，但胃和盲肠没有表达（ 1994）。大鼠的肝中也无表达，肾脏有中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 4 微量表达。人则肝、肾、胰有表达，大脑未见 表达（ 1995）。绵羊和泌乳奶牛的 胃和瘤胃中表达，而真胃、肝脏、肾脏、盲肠和结肠以及奶牛的乳腺中未检测到1999）。其在肠黏膜主要表达在吸收细胞的刷状缘膜，肠绒毛的底部没有表达。测定 996； 1998）和 1998）。有报道则认为， 1999； 1993）。这些报道之间的差异可能与细胞分化程度有关（ 1999）。从其在肠道的表达强度来看，不同动物也存在差异。鸡以十二指肠为主，猪以空肠为主，而反刍动物以空肠和回肠为主（ 1999）。 同组织对肽的吸收和利用状况。 响小肽吸收和转运的因素 已知肠道对肽的吸收转运是一个复杂的生理过程，激素、生长因子、肠道损伤、小肽底物分子结构、饲粮类型、营养水平可能都在肽的转运中起着调控干预作用。 物 肽载体 底物分子具有广泛的适应性，能够转运几乎所有的二肽和三肽（ ，2001）。除此之外， 转运多种肽类衍生物，其中包括 青霉素、先锋霉素等） （ ， 1999） 、 血管紧张素转化酶抑制剂（ 1989；， 2000）、肾素抑制剂（ ， 1990）、凝血酶抑制剂（ ， 1995）和类二肽抗癌药物 士欣）（ ， 1992）等，以及多种药物前体物，如 伐西洛韦，缬更昔洛韦和 ， 1989； ， 1998； ， 2000）等。肽转运载体的这些特点不但在营养上具有重要意义，而且在医学和药学领域都有巨大的应用前景。 但体外细胞培养试验发现，肽载体如 底物也有一定的选择性，它可选择转运不同分子结构的底物。首先，肽的转运具有立体构型特异性。据 （ 1995）和 （ 1996）的报道，中性氨基酸和 （ 1995）研究发现， 肽转运系统完全没有亲和力，而 保留了与 当的亲和力。（ 1996）则认为，底物分子对 胞系 亲和力顺序为 且尽管 转运系统有亲和力，但它既不能被 胞摄取，也不能穿过培养的单层 胞，也就是说没有发生该肽的转运。对 行侧链修饰则能显著提高其亲和力和转运速率（ ， 1997a； ， 2001）。 末端基团是影响肽分子是否能被转运的另一个重要因素。最早认为，最适于转运的二肽或三肽应当具有游离的氨基端和羧基端（ 1987）。一般而言， N 端 换该基团会降低转运效率。但也有研究证实，缺乏 u 和 1988）发现，巯基替代 （ 2002）报道，表达于仓鼠卵母细胞的绵羊 估计肽载体对底物分子结构的选择性可能与其转运活性中心有关，但至今对肽载体蛋白的三维结构及其活性中心尚不了解。 研究还发现， 物之间存在竞争抑制关系。 （ 1