【毕业学位论文】（Word原稿）四倍体棉种起源与演化的FISH研究作物遗传育种硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 四倍体棉种起源与演化的 究 on .) on .) I 摘 要 多倍体的形成在生物进化过程中占有重要的地位，但是我们对其多倍化后基因组究竟发生了哪些变化还知之甚少。棉属（ 较适合于基因组起源与演化的研究，它共约有 51个种，分为 9个基因组类型。先前的研究已表明， 四倍体棉种 (异源多倍体，它包含 A 基因组和 D 基因组。 随着研究手段的创新，在四倍体棉种起源、演化和分类等重大基本理论上已基本形成共识。但是，四倍体棉种的具体供体种 及其起源过程的种质歧化、棉属染色体组之间或组内各棉种的同源程度等仍有分歧。 本研究使用 法对此进行初步探讨，主要包括：四倍体棉种供体种研究、四倍体棉种多元进化和单元进化的研究以及 究结果如下： 1 以四倍体棉种 A 基因组可能的供体种阿非利加棉、亚洲棉的 其 D 基因组可能的供体种雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉、戴维逊氏棉、拟似棉的 别与四倍体棉种的体细胞（ 花粉母细胞（ 行 以 发现 A 基因组的一些重复序列入侵到 D 基因组上，并且 A 基因组与四倍体 基因组与四倍体 在以 现戴维逊氏棉与陆地棉 D 基因组的关系最近，雷蒙德氏棉与海岛棉 D 基因组的关系最近，从而推测四倍体棉种是多系起源而不是单系起源的。并发现拟氏棉是 D 基因组棉种中一个特殊的种。 2 在（ 1 价体多，偶尔也有 明阿非利加棉染色体（ 陆地棉的 A 组染色体尽管基本上相同，但还是存在着差别。在（ 2 2 从信号显示的情况看，雷蒙德氏棉比瑟伯氏棉与海岛棉 3 以 45S 探针，分别以陆地棉、海岛棉、黄褐棉为靶 行 验，发现陆地棉和海岛棉的 45S 部同步进化为 黄褐棉的 45S 基因组类型的 说明在四倍体中， 45S 且在四倍体中， 45S 部位于染色体短臂的端部，从而推测二倍体棉种的 45S 多倍 体中像转座子一样能够在染色体上移动。 I 关键词：棉花，原位杂交，同步进化 a in of is us to in is a 1 It - to of D to be to on of of of of et in is to of in of or of as 1 In of as of as as of is to of of is to of be in as is is is 2 in 1A 1-a A AA in 2D 1 2D 5 , D in is of 3 In 45S as as In to of 5S in on of of 5S to on or to in 录 第一章 文献综述 . 3 1 1 四倍体棉种的起源与分布 . 3 1 1 1 四倍体棉种的起源 . 3 1 1 2 四倍体棉种的分布 . 2 1 2 四倍体棉种起源与演化的地理学 . 4 1 3 研究棉花起源与演化的学科或方法 . 5 1 3 1 种间杂交研究 . 5 1 3 2 核型研究 . 5 1 3 3 种子蛋白质研究 . 5 1 3 4 分子标记研究 . 6 1 3 5 原位杂交研究 . 6 1 3 6 其它研究方法 . 9 1 4 四倍体棉 种的供体种 . 9 1 4 1 四倍体棉种 . 9 1 4 2 四倍体棉种 . 10 1 5 本实验研究目的意义 . 12 第二章 材料与方法 . 13 2 1 实验材料 . 13 2 2 实验方法 . 15 2 2 1 探针 . 15 2 2 2 染色体制片 . 17 2 2 3 探针的制备 . 17 2 2 4 变性和杂交 . 17 2 2 5 洗脱和信号检测 . 18 2 2 6 荧光观察 . 18 2 2 7 数据统计 . 18 第三章 结果与分析 . 19 3 1 以 . 19 3 1 1 以雷蒙德氏棉 针的 . 19 3 1 2 以戴维逊氏棉 . 23 V 3 1 3 以瑟伯氏棉 . 24 3 1 4 以拟似棉 . 24 3 1 5 棉属种间杂种 . 25 3 2 以 . 26 3 2 1 以阿非利加棉 . 26 3 2 2 以石系亚一号 . 27 3 2 3 棉属种间杂种 . 28 3 3 以 45S 探针的 . 28 3 3 1 陆地棉 45S . 28 3 3 2 阿非利加棉 45S . 29 3 3 3 草棉 45S . 29 3 3 4 雷蒙德氏棉 45S . 29 3 3 5 黄褐棉 45S . 30 3 4 棉花 验中的一些特殊现象 . 31 第四章 讨论 . 33 4 1 四倍体棉种 . 33 4 2 四倍体棉种 . 33 4 3 二倍体棉种 A、 、 . 34 4 4 以 A、 信号比较 . 35 4 5 拟似棉在四倍体起源与演化中的地位 . 36 4 6 棉花基因组中的弥散重复序列和基因组入侵 . 37 4 7 四倍体棉种 A、 的易位 . 39 4 8 四倍体棉种的 . 40 4 9 棉花 验中封阻问题的探讨 . 45 4 10 棉花原位杂交中部 分技术问题的探讨 . 46 4 10 1 棉花染色体原位杂交研究中的制片技术的改进 . 46 4 10 2 杂交后的正确洗脱强度 . 47 4 10 3 基因组原位杂交探针及其标记方法的选择以及 . 48 第五章 结论 . 49 参考文献 . 50 致 谢 . 59 作者简历 . 60 V 第一章 文献综述 棉属（ 被子植物锦葵目（ 锦葵科（ 棉族（ 最新提出的棉属分类系统为 4 个亚属，共 51 种（亚种） (992年 )。包括 46 个二倍体种（ 2n=2x=26）， 5 个四倍体棉种 (2n=4x=52)。二倍体棉种的草棉（ 亚洲棉（ 四倍体棉种的陆地棉（ 海岛棉（ 栽培种，其余 47个种均为野生棉。 早期的棉属植物分类研究，基本依据是棉属植物的形态特征和地理分布。由于不同的分类学家所偏重的形态特征不尽相同，因而，早期分类始终未能摆脱混乱的局面。 940、 1942)在棉属分类学中做出了划时代的贡献，他根据杂种后代减数分裂时染色体的配对情况，在总结前人已积累的棉属细胞遗传学知识的基础 上，结合他本人进行的大量种间杂交研究成果，参照棉种的地理分布，提出了划分染色体组的细胞学分类原则：即凡种间染色体同源性较高的棉种归为同一染色体组，反之则列为不同的染色体组。据此将二倍体棉种分为 A、 B、 C、 D 和 E 等 5 个染色体组，分别代表亚洲棉、非洲棉、澳洲棉、美洲棉和阿拉伯棉种的染色体组。四倍体棉种被认为是 A 染色体组和 D 染色体组种间杂交产生的双二倍体种，将其定为 色体组。至此，现代棉属的分类框架才最终得以形成。 目前，随着研究方法的创新，在棉花物种起源、演化和分类等重大基本理论上已形成共识。但是，四倍体 棉种的具体供体种及其起源过程的种质歧化、棉属染色体组之间或组内各棉种的同源程度等仍有分歧。各国学者提出一些推论，多不一致，因而对其研究仍方兴未艾。 1 1 四倍体棉种的起源与分布 1 1 1 四倍体棉种的起源 四倍体棉种的起源途径曾是棉属系统发育中的中心问题之一。多数科学家接受了四倍体棉种是由染色体组 A 和染色体组 D 结合而成，因之美洲四倍体种为异源多倍体的起源理论。 1933， 1934， 1937）和 1935）对美洲棉种间杂交进行研究，在减数分裂中发现了 13个二价染色体和 13 个单价染色体，这个结果和异源四倍体理论相符合。 1940， 1941）用美洲二倍体棉（瑟伯氏棉）和亚洲二倍体棉（草棉）进行种间杂交，经染色体加倍后合成异源四倍体，再用四倍体栽培棉（陆地棉）与人工合成的异源四倍体进行杂交，根据杂种及后代的育性表现证明四倍体棉种的染色体组是由 A 染色体组和 D 染色体组提供的。另外，对染色体形态中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 方面的研究也证实了美洲异源四倍体起源的理论。经典的细胞遗传学研究表明美洲四倍体种是异源多倍体，它包含来自非洲或亚洲的 A 染色体组和与美洲二倍体种染色体组相似的 D 染色体组。此后，科学家 们采用不同的方法来验证此理论， 1953， 1958）和 1963， 1964，1966）采用观察杂交合成的多倍体在减数分裂时的染色体配对情况的方法， 1998）等根据同工酶标记分析的方法， （ 1999）根据遗传学作图的分析方法， （ 2002）根据 列比较分析等方法对四倍体棉种的起源进行了探讨研究，结果都证实了四倍体棉种是异源多倍体起源的理论。 (1994)对陆地棉、亚洲棉、雷蒙德氏棉（ H +2因结构进行分析 , 编码其亚基的两个基因 四倍体棉种中 ,因在 A 亚组具有 2 个拷贝 , 在 D 亚组具有 1 个拷贝， A 亚组和 D 亚组中各具有 2个拷贝，认为在形成四倍体栽培种以前，二倍体棉种可能存在多倍体化的可能。 (1999)认为四倍体棉花的演化由 A、 D 基因组从一个共同祖先发生偏离，在一个共同核中再结合，共同演化产生了新的核型，并超越了其二倍体祖先的基础。 (1999)认为从分子细胞遗传学表明棉花陆地棉至少是八倍体起源 。 000)认为棉花的“二倍体”祖先本身就是基因组结构已显著二倍化了的古四倍体，因此由四倍体杂交再经多倍化形成的棉花应是八倍体，而不是四倍体，从这一点看，棉花的多倍性水平被低估了。 1 1 2 四倍体棉种的分布 目前，世界上分布最广的四倍体棉种是陆地棉 ,其次是海岛棉。陆地棉种起源与墨西哥高原地区，在墨西哥南部及尤卡坦地区，陆地棉种被当地土著民族的先辈们利用栽培。此棉种向前扩展到巴拿马地峡地带，和东北扩展到亚利桑那沙漠，向东及东北扩展到佛罗里达、安的列斯群岛及巴哈马群岛。在美洲被发现以后，这个 棉种获得头等重要意义，在全世界广泛扩展，在亚洲、非洲、欧洲及南美等各个产棉国家广泛种植，并不断排挤当地棉种。陆地棉在进化的后阶段，即欧洲人发现美洲以后，形成了适于亚热带气候的早熟果枝型棉花。该种的热带类型集中在南墨西哥、尤卡坦及巴拿马地峡地区；而亚热带类型（美棉）几乎在全世界亚热带植棉国家中分布，极早熟类型已进入温带栽培。海岛棉种起源于南美洲北部秘鲁等地区，在欧洲人发现美洲之前，海岛棉已在安的列斯群岛栽培，并广泛地分布在南美，从智利边界直到厄瓜多尔。这个种向东扩展到大西洋沿岸，又经过巴拉圭、巴西及哥伦比亚到 达西印度群岛种植。欧洲人把海岛棉、陆地棉带到世界各地，但海岛棉仅在几个国家获得很大的经济意义，如埃及、前苏联、美国、尼日利亚，以及自己的发源地秘鲁及西印度群岛。海岛棉种多样化的热带类型分布在秘鲁及南美其他国家。亚热带类型的分化，显然是在欧洲人发现美洲以后， 18 世纪末到 19 世纪初，在美国形成海岛棉，在埃及形成埃及棉；以后又分布到西印度群岛（海岛棉）及秘鲁（埃及棉品种）以及其他国家。最早熟的海岛棉类型及品种是近几十年在前苏联棉区形成的，但也遭到陆地棉的竞争。其它四倍体棉种中，达尔文氏棉（ 要分布在加拉帕戈斯群岛，从地理分布来看，它极可能是海岛棉的变种。黄褐棉（ 要分布在巴西东北部。毛棉（ 要分布在夏威夷 (992)。今年来，研究者（ 1989； 1990； 1992； ， 1994, 1995a； ， 1996； ， 1999；）从四倍体棉种的系统发育方面的分析结合其地理分布将四倍体棉种分成三组，即陆地棉和毛棉归为一 组，海岛棉和达尔文氏棉归为一组，黄褐棉独立归为一组。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 表 . of 名 中 译 名 染色体组 地理分布 棉 东和非洲 洲棉 东和 印度 续表 1 . 名 中 译 名 染色体组 地理分布 桑纳尔棉 B 非洲 常棉 洲 叶棉 洲南部 顶棉 得角群岛 叉棉 B 非洲 特提棉 洲中部 岱华棉 洲东南部 宾逊氏棉 洲西部 洲棉 C 澳洲中北部 尔逊氏棉 C 澳洲中部 宁汉氏棉 C 澳洲最北部 伯氏棉 利桑那州 根棉 西哥，加里福尼亚 克尼西氏棉 西 哥，加里福尼亚 维逊氏棉 西哥，加里福尼亚 劳茨基棉 拉帕戈斯 地棉 科利马地区 蒙德氏棉 鲁 似棉 互哈卡州 片棉 米却肯州 裂棉 西哥西部 散棉 哥雷罗 纳氏棉 索诺拉州 沃恩蒂曼氏棉 西哥 笃克氏棉 拉伯地区 马里棉 非 雷西棉 也门 白棉 拉伯南部 纳钬尔棉 E 北非 雷切狄氏棉 E 北非 伦生棉 E 索马里 萼棉 洲东部 克氏棉 洲中部 生叶面棉 K 澳大利亚金伯利地区 壳棉 K 澳大利亚金伯利地区 叶棉 K 澳大利亚金伯利地区 丽棉 K 澳大利亚金伯利地区 绒棉 K 澳大利亚金伯利地区 地棉 K 澳大利亚金伯利地区 小棉 K 澳大利亚金伯利地区 敦德里棉 K 澳大利亚金伯利地区 全特氏棉 K 澳大利亚金伯利地区 贵棉 K 澳大利亚金伯利地区 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 叶棉 K 澳大利亚金伯利地区 地棉 ( 中美洲，世界广泛栽培 岛棉 ( 南美，世界广泛栽培 棉 ( 夏威夷 褐棉 ( 巴西 尔文氏棉 ( 加拉帕戈斯群岛 1 2 四倍体棉种起源与演化的地理学 现代棉 花分类学家 992)认为，四倍体棉染色体结构为 以许多遗传学家和细胞学家的工作，尤其是以 1940， 1941）的开拓工作为基础而定型的，即四倍体结合了 A 染色体组（旧世界栽培二倍体种）和 D 染色体组（新世界野生二倍体种）的遗传物质。据此研究结论，四倍体棉种的 A、 D 两组染色体，一组来自非洲，一组来自南美洲。这两组相隔遥远的棉种如何相遇并进行结合的问题，有不同的假说。 一种假说是 A 染色体组棉种的种子，从起源地非洲漂流过大西洋到达南美洲。如果是这样，可能是非洲野生棉（ 的种子由南非南部随大西洋赤道潮流漂浮过去；或者是绿顶棉（ 佛得角群岛随北大西洋潮流漂浮过去（据研究，绿顶棉与草棉可能有关联）。大西洋赤道的这股潮流沿着北大西洋和南美洲以及中美洲的加勒比海岸流动，而在南美洲的西北部或中美洲 A 组与 D 组相会，这在更新世以前， A 染色体组的种子经此路线传播是完全可能的，然后它们进一步进行杂交而形成 色体组的美洲四倍体棉种。 另一种假说是，在白垩纪后期或第三纪初期，南美洲的东岸和非洲的西岸是连接在一起的，A 组和 D 组棉种是可 以靠近的，两者发生杂交，然后自然加倍，形成了异源四倍体类型，后来发生了大陆漂移运动，非洲与南美洲之间被大西洋隔开，四倍体类型在中美洲及南美洲走上了自己分化发展的途径。 1939）曾提出太平洋陆桥的假说，既在古代新世界与旧世界之间，在太平洋地区曾存在着陆地桥梁，两地之间有陆地相连接，新旧世界二倍体的各种类型的棉种的分布地区是相连的，或相互之间是相重叠的，这些种在这里产生杂交而形成双二倍体种。后来太平洋陆桥下沉，被太平洋海水淹没，双二倍体棉种就在新世界分化与发展。这种假说的根据是，因为在太平洋岛屿 上还存在着波利尼西亚种。但这种假说后来被许多学者所否定。另外一种意见认为，可能由于人类活动携带亚洲棉 A 染色体组的种子，经过太平洋到达新世界，在栽培过程中与D 染色体组的一个或几个种相互杂交而形成四倍体（ ， 1947）。 1953）和1964）根据非洲南部现存的草棉野生类型是亚洲棉花唯一真正的野生类型，提出了非洲草棉通过太平洋传播的途径。 为新世界棉不存在野生的类型，栽培的草棉是人带到南美洲北部来的，并在那里种植，可能与雷蒙德氏棉杂交产生海岛棉。 随后草棉又被带到墨西哥，与拟似棉或三裂棉杂交产生陆地棉。 1975）也认为由人类把草棉带至新世界的热带地区，在那里成为栽培种，并且不止和一个 D 染色体组种杂交形成了天然杂种。 1992）对整个生态情景进行分析后，认为与人类活动无关，他发现野生二倍体棉种为大陆性（为陆地包围的）荒漠地区所特有，而野生四倍体棉种则分布在植被稀少的沿海地区，并且通过海滨地区向外扩散。他认为四倍体棉种起源于更新世的某个时期，当时由冰河的交替前进与消退造成水平面的升降，这种多变的海岸线不仅成为异源四倍体的新旧 世界亲本相遇到一起的途径（其传播途径主要是通中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 过海水传播， 研究证明棉种种子具有高耐盐性，尤其对于毛棉种子在人工配制的盐水中浸泡 3 年后仍具有发芽能力），而且还造成一种开放的环境，以便新形成的异源四倍体可以在那里定居下来。一旦定居下来，这个地方就会成为使它远离起源地传播到别处海滨的中转站。 2002）和 （ 2003）近年的研究结论也为异源四倍体更新世起源的理论提供了更充分的证据，他们估算四倍体棉种形成大约在 1万年前，祖先 A 染色体组种通过大西洋传播到新世界后才发生的。 在新世界是早期从事农业的人发现了四倍体棉并驯化了它们，但并不是由人类创造了它们。四倍体的分化，至少种一级别的分化是发生在驯化之前，可以在自然选择过程中来寻找这种趋异的作用。 1 3 研究棉花起源与演化的学科或方法 1 3 1 种间杂交研究 1933， 1934， 1937）和 1935）对新世界棉种间杂交进行研究，证实了新世界棉的异源四倍体起源的理论。 1944， 1951， 1958， 1966 年）对以四倍体棉种杂交后代进行遗传研究的基础上确定，雷蒙德氏棉与四倍体 栽培棉种的关系比瑟伯氏棉（ 及其它任何美洲野生棉种都更为接近。 1953）通过将雷蒙德氏棉 陆地棉，瑟伯氏棉 陆地棉等杂交组合作比较，证实了 观点。另外， 1958）通过比较分别以亚洲棉、草棉与四倍体棉种杂交加倍合成的两种六倍体的多价体出现频率，认为草棉与自然产生的四倍体棉种的 A 基因组的亲缘关系更近。周宝良等根据海岛棉与 D 染色体组 7 个种杂种 减数分裂中期 I 的染色体配对结果，认为拟似棉（ G.海岛棉的关系最远 ，雷蒙德氏棉可能是海岛棉染色体亚组的供体。 1 3 2 核型研究 聂汝芝等（ 1985）根据对 3 种野生和 4 个栽培棉种的核型分析，指出草棉是 A 组的供体种，亚洲棉是草棉易位衍生而来，陆地棉和海岛棉的 D 组可能来源于不同的供体，雷蒙德氏棉与陆地棉的 D 染色体组、瑟伯氏棉与海岛棉的 D 染色体组相似。聂汝芝和李懋学（ 1993）开展了 D 染色体 8 个种与 8 个陆地棉半野生种系的核型分析，根据染色体相对长度、臂比及其类型，认为三裂棉（ 鲍莫尔棉的供体。瑟伯氏棉是阔叶棉、墨西哥棉的供体，雷蒙德氏棉是雷奇蒙德氏棉、 尖斑棉、尤卡坦棉、玛利加郎特棉、莫利尔氏棉的供体。王坤波和李懋学（ 1990）开展了 D 染色体组 11 个种与陆地棉、海岛棉的核型分析，认为拟似棉可能是海岛棉 D 染色体的供体种，戴维逊氏棉（ 能是陆地棉 D 染色体组的供体种。 1 3 3 种子蛋白质研究 1970）根据种子蛋白质电泳图谱分析，认为海岛棉是由草棉和 D组的雷蒙德氏棉杂交而起源的。陆地棉是由鲍莫尔氏棉与具有 染色体组的原始型或该染色体组中一个或多个更原始的类型杂交而起源的。毛棉是被人类或洋流从中美洲起源 中心带到夏威夷的。陈松等根据蛋白质电泳图谱分析，认为 D组棉种是陆地棉、海岛棉、达尔文氏棉的供体。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 1 3 4 分子标记研究 1989）分析了 A、 D、 色体组叶绿体 制位点的差异，发现在大约 56个限制性位点变异中有 28 个限制性位点在 A、 色体组间未发现差异，明显区分于 D 染色体组，而 2 个插入突变（大约 150在 D 染色体组中的叶绿体 现， A、 色体组叶绿体 此插入突变，据此 为，四倍体棉种细胞质供体种是来源于 A 染色体组中 似的棉种。 （ 1994）运用 图的方法对四倍体棉花的基因组进行研究，发现依据重复位点的类型可以在棉花基因组中识别出 11 对部分同源的染色体，对这部分同源染色体上连锁群（ 分布式样进行比较发现，只有两对部分同源染色体在基因排列顺序上表现明显的共线性（ 另有 4 对至少发生过一次倒位，有一对发生过一次明显的易位；对棉花二倍体祖先的基因组（ A 和 D）进行比较，可以看出它们在基因排列顺序上是非常相似的，但在四倍体基因组中它们彼此之间就表现明显的差异，由此可以 证实正是多倍化促进了这种进化改变的发生。宋国立（ 1998）对包括 4 个栽培种的 32 个种和 7 个陆地棉野生种系 析，得出四倍体棉种是由与草棉类似的棉种作母本供体种，与戴维逊氏棉类似的棉种作父本合成的异源四倍体种。 （ 1999）将亚洲棉（或草棉）、雷蒙德氏棉和陆地棉三者的16 个核酸位点共计 14， 705 碱基对长度的序列进行对比分析，发现 A 基因组二倍体棉种的该序列与四倍体棉种的该序列的趋异率为 而 D 基因组二倍体棉种为 这些结果说明亚洲棉（或草棉）与四倍体棉种 A 基因组的相似程度约为雷 蒙德氏棉与四倍体棉种 D 基因组的相似程度的 。 2001）等对二倍体棉种和四倍体棉种的 析中，陆地棉和海岛棉共有 368 条多态性片段，其中的 143 条是和 A 基因组二倍体棉种共有的， 84 条是和 D 基因组二倍体棉种共有的，由此推论异源四倍体棉种的 A 染色体组与二倍体棉种的 A 染色体组的亲缘程度比其 D 染色体组与二倍体棉种 D 染色体组的亲缘程度更近。 郭旺珍 等（ 2003） 利用 子标记技术，对棉属 A、 D 染色体组二倍体及四倍体代表棉种进行了遗传多样性分析 ，所得到的结果支持拟似棉是 D 染色体组最原始棉种 。 1 3 5 原位杂交研究 原位杂交技术（ in 1969 年由 出的（吕忠进等，1993；吴殿星等， 1994；贾继增， 1996；奇文清等， 1996； s， 1998）