【毕业学位论文】（Word原稿）中国绿豆种质资源遗传多样性分析及初选核心种质构建作物遗传育种硕士论文

密级 ： 论文编号 ： 中国农业科学院 学位论文 中国绿豆种质资源遗传多样性分析及 初选核心种质 构建 of of ) of of )I 摘 要 绿豆（ 我国主要食用豆类作物，全国各地都有种植 ，其 出口量 居世界 首位。我国绿豆 资源丰富，种类繁多， 然而，在我国绿豆一直 被 视为小作物，研究水平 远落后于水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。 为研究中国绿豆 种质资源 的遗传多样性分布规律，构建 绿豆 核心种质 及 筛选 多态性 记 ，本研究以 5072 份国内绿豆资源为实验材料，利用常规 方法及分子标记技术进行分析， 旨在 为绿豆种质资源保护，优异基因资源发掘利用和遗传研究奠定基础。 1 研究发现 ， 我国绿豆种质资源分布在约 28 个纬度、 60 个经度内，其中 29 41 N 107123 E 范围内分布最多，占 资源 总数的 6 个质量性状中 荚色的遗传多样性指数最高，而 8 个数量性状中百粒重的遗传多样性指数最高。 35 37 N 111 115 E、 37 39 N 111115 E、 39 41 N 115 119 E、 41 43 N 115 119 E 4 个小区 平均遗传多样性指数较高， 初步推断中国绿豆资源遗传多样性中心在 35 43 N 111 119 E 范围内。 2根据 14 个农艺性状， 用 13 种方法构建 绿豆初选核心种质， 通过 对 2 种分组方法、 3 种确定取样数法和 2 种个体选择法进行 比较 ， 结果表明 ，聚类选择取样优于随机取样 ； 按照性状群分组 优于按省分组；多 样性指数法确定取样数优于平方根法和比例法。最终 经 性状群分组，利用 多样性指数确定取样数，聚类选择个体， 构建起包含 719 份绿豆种质 的 初 选 核心 种 质，性状符合度达 100%。 3 从 719 份 初选核心种质中选出 12 份 农艺性状差异较大的绿豆种质 ， 对 41 对 绿豆 物， 28 对绿豆 （ 物 ， 8 对 小豆 (物 、 27 对 豇豆 (物 和 24 对 菜豆 (物 进行筛选，结果表明 绿豆 物的有效扩增率最高， 为 菜豆 物的有效扩增率最低 ，为 最终获得 10 对可用于绿豆遗传多样性分析的多态性引物 ，其中绿豆 物 6 对 ，绿豆 物 2 对，豇豆物 1 对，菜豆 物 1 对。 利用这些多态性引物 分析 初选核心种质中的 192 份绿豆种质 ，共检测到 47 个等位变异， 平均每 对 引物 ，聚类分析可以将南方 种质 和北方 种质 分成不同的亚类。 关键词 绿豆 ， 种质资源 ， 遗传多样性 ， 核心种质 ， 子标记 is as a in In we of 072 a an A of CR of to an of to of as 1. of 9 41 N 07 123 E. 5 37 N 11 115 E， 37 39 N 11 115 E， 39 41 N 15 119 E， 41 43 N 15 119 E， so it 5 43 N 11 119 E. 2. 4 13 to of on to to in of an by to By a a 19 00% of 3. to CR SR , SR . In we of be of of is is In 7 92 by by on 录 第一章 引言 . 1 豆种质资源的利用现状及研究进展 . 1 豆起源与演化 . 1 内外生产概况 . 1 内外研究进展 . 2 传多样性研究进展 . 4 形态学水平分析遗传多样性 . 4 细胞学水平分析遗传多样性 . 5 同工酶水平分析遗传多样性 . 5 平分析遗传多样性 . 5 心种质研究进展 . 7 据的收集整理 . 8 质资源的分组 . 8 心样品的取样策略 . 9 样比例的确定 . 10 心种质的代表性评价 . 11 究目的和意义： . 11 第二章 中国绿豆种质资源遗传多样性 分析 . 12 料和方法 . 12 料 . 12 法 . 12 量性状赋值 . 12 量性状类型划分 . 13 区划分 . 13 传多样性指数计算 . 13 果与分析 . 13 国绿豆种质资源的地理分布 . 13 国绿豆种质资源的遗传多样性 . 15 传多样性的地理分布 . 18 论 与 小结 . 19 第三章 中国绿豆种质资源初选核心种质构建 . 20 材料和方法 . 20 料 . 20 法 . 20 据处理 . 20 类分析 . 21 关计算公式 . 21 13 种取样方法构建 初选核心样本 . 21 果与分析 . 23 同取样方法的比较 . 23 同取样方法品种间平均相似系数比较 . 23 同取样方 法 性状符合度比较 . 23 同取样方法与总资源的数量性状变异系数比较 . 23 同取样方法与总资源的遗传多样性指数比较 . 24 同取样方法的综合比较 . 25 心种质评价 . 25 论 与 小结 . 26 第四章用于绿豆种质资源遗传多样性分析的 记的筛选 . 28 料与方法 . 28 料 . 28 法 . 33 取 . 33 增 . 34 增产物的检测 . 34 火温度、反应物质浓度筛选 . 35 态性引物筛选 . 35 果与分析 . 36 种引物的扩增状况分析 . 36 态性引物分析 . 37 传多样性分析 . 38 论 与 小结 . 39 第五章 全文总结 . 41 参考文献 . 42 致 谢 . 48 作 者 简 历 . 49 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 绿豆 是豆科（ 形花亚科（ 豇豆属（ 洲豇豆亚属（ 主要栽培豆种， 又名 菉豆、 植豆、文豆等， 学名 )文名 它的 染色体数 为 2n=22， 属一年生草本植物 （ 龙静宜等， 1989；郑卓杰等， 1997； 程须珍等， 2002） 。 绿豆在温带、亚热带 和热带高海拔地区 被 广泛种植 ，以 亚洲的栽 培最多，主要 分布在印度、中国、泰国、菲律宾等国家， 是这些以 谷物为主食国家 的 重要蛋白质来源 （ ， 1996） 。非洲、欧洲、美洲仅有少量栽培 （ 郑卓杰等， 1997）。 绿豆是我国主要食用豆类作 物和传统的出口物资， 其 出口量 居世界首位 （林汝法， 2002） 。它具有 生育期短，播种适期长，适应性广，抗逆性强 的优点 ， 且 具有 良好 的固氮能力，是禾谷类、棉花、薯类等作物间作套种的适宜作物和前茬，也是良好的救荒和填闲作物 。 绿豆 营养丰富， 医食同源，是人们理想的营养保健食品。另外，绿豆 用途广泛， 经济价值高，已成为当前农业种植结构调整和经济欠发达地区农民脱贫致富的首选作物。 豆 种质 资源的利用现状及研究进展 豆起源 与演化 1886 年德 孔多尔（ 早 提出绿豆的起源，他 认为 绿豆起源于印度及尼罗河流域。 瓦维洛夫（ 1935）在育种的理论基础一书中 提到 绿豆起源于“印度起源中心”及“中亚中心”。 （ 1991）对来自亚洲不同国家的 581 份绿豆种子进行蛋白质电泳分析后认为，绿豆种子蛋白的多样性中心在西亚（阿富汗、伊朗、伊拉克），并提出绿豆从印度传到东部的有两条可能路径：一条是从印度到东南亚国家，另一条是从印度或西亚经过丝绸之路传播到中国。在我国云南、广西、河南、山东、天津等地都曾发现野生绿豆，中国也可能在绿豆的起源中心之内（郑卓杰等， 1997）。 内外 生产 概况 绿豆在 中 国已有 2000 多年的栽培历史。 南北朝时代的农书齐民要术（公元 535就有绿豆栽培经验的记载（程须珍等， 1996）。绿豆在全国各地都有种植， 50 年代初，其栽培面积、总产量和出口量均居世界首位。 50 年代末绿豆种植面积开始减少，到 70 年代中期只有零星种植， 70 年代后期随着耕作制度的改变和国内外市场需求的增加，种植面积逐年恢复。 20 世纪80 年代后期，随着绿豆改良品种的推广应用，我国绿豆生产有了突飞猛进的发展。 2002 年我国绿豆播种面积 达 97 万公顷， 同时 绿豆 总 产量 也 创下了 119 万吨的 最高纪录 （表 1 2002 年以后，我国绿豆播种面积呈现逐年小幅下降态势， 但由于单产提高， 总产量 下降不大。 2005 年全国绿豆种植面积为 公顷， 总产量 达 101 万吨 （中国粮食产业网 。 中国绿豆产区主要集中在黄河、淮河流域及东北地区（林汝法等， 1998）。近年来以内蒙古、吉林、安中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 徽、河南、山西、黑龙江、陕西、湖北、河北等省种植较多（表 1 表 1国绿豆近年来生产情况 （单位： 10,00010,000t） he of in 10,00010,000t) 年份 种面积 产 份 种面积 产 986 002 993 003 000 005 据来源：中华人民共和国农业部编中国农 业统计资料 1986of of of s 1986 1003 年中国主要绿豆产区生产情况（单位： 10,00010,000t） he of in 003(10,00010,000t) 省份 种面积 产 份 种面积 产 蒙古 川 林 庆 徽 宁 南 苏 西 西 龙江 东 西 西 北 它 北 湖南 计 界上其它种植绿豆较多的国家有印度、泰国、缅甸、印度尼西亚、巴基斯坦、菲律宾、斯里兰卡等。印度是世界上绿豆种植 面积 最大的国家，但单产较低。近年来印度绿豆生产发展较快，2001 年种植面积达 710 万公顷，总产量 257 万吨。 在 泰国 ，绿豆是 种植面积最大的豆类作物，但近年来随着甘蔗、玉米、棉花等作物 播种面积的增大，绿豆种植面积有所减少（ ， 2002）。缅甸近年来绿豆单产增长较快，从而带动其种植面积从 1980 1981年的 1049992000 年的 10 104全国豆类生产面积的 28%。 内外研究 进展 自 1978 年起，绿豆等食用豆类被正式列入国家重点研究课题 （程须珍， 1998） 。经过中国农业科学院前作物品种资源研究所、河南省农业科学院、山东省潍坊市农业科学院、山西省农业科学院、河北省农林科学院、湖北省农业科学院、安徽省农业科学院等 25 个有关单位广大科 技人员的共同努力，共收集到国内外绿豆种质资源约 6000 份，其中 5699 份已编入中国食用豆类品种中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 资源目录 1 ， 5217 份已交国家种质库保存，完成蛋白质和淀粉分析各 2877 份，脂肪分析 1452份。 程须珍等（ 1998）对 4719 份绿豆品种资源的分布情况和主要农艺性状及部分品种的重要特性进行了综合分析。结果表明绿豆品种数量较多的省份依次是河南、山东、山西、河北、湖北、安徽等省。早熟类型品种主要分布在河南省，大粒型品种以山西、山东、内蒙古、安徽等省较多，而河北、安徽、吉林等省的绿豆资源单株荚数较多。高蛋白型品种 主要在湖北、山东、北京和河北省，高淀粉型品种则在河南、山东和内蒙古。山西、山东、内蒙古、吉林和湖北等省的绿豆抗旱性较好，山东的品种耐盐性较好。国外引进品种比国内绿豆资源抗叶斑病能力强，抗根腐病性能较好的品种主要在山东、安徽和河北，内蒙古和山西的品种较抗蚜虫。 对 资源进行 评价鉴定的同时 ，还筛选出 一批 具有早熟、大粒、多荚、丰产特性，或不仅农艺性状优良且高蛋白、高淀粉、耐旱、耐盐、抗主要病虫害的优异种质资源 ，并编入食用豆类优异种质资源目录（胡加蓬等， 1998） 。 程须珍 等（ 1999） 对丰产、早熟、矮秆、多荚及大 粒类型的 66份绿豆优异种质资源 在山东、河北、河南等省 进行农艺性状鉴定及综合评价， 评选出 904647、潍 9002、 绿 1 号、豫绿 2 号、潍 9005、冀绿 1 号、几十个具有特殊利用价值的种质资源。 （ 2001）利用三元交叉测试（ 究表明，绿豆的单株产量、单株荚数、单荚粒数和千粒重存在加性、显性和上位性遗传。 上位性分割显示加性 加性（“ i“型）交互作用是影响单株荚数的重要因素。杨春玲等（ 2005） 利用 2002 年国家绿豆试验数据，选取了产量水平较高的 4 个品种、 20 个试验环境，每性状相互集对 80 对数据 ，利 用常规相关、偏相关、通径分析方法进行分析。 结果 表明株高与荚长、荚粒数、产量分别呈极显著、显著正相关关 系；荚长与荚粒数，单株荚数与产量亦呈极显著正相关；产量三要素中以单株荚数与产量关系最密切。因此，在选育高产绿豆品种时，单株荚数对产量形成 有 重要作用。 近年来 国内外 在 绿豆 抗豆象特性研究方面取得了一定进展 。 （ 1988）以抗豆象野生绿豆种 父本，分别以 感豆象母本，成功进行了人工杂交试验，并将所得 体及其亲本进行了室内接虫鉴定试验，结果发现 豆象特性符合 3:1 的分离规律；同时对 因型进行了可能性分析，所得的结果符合 R/R:R/r:r/r=1:2:1 的结论。 （ 1992）以 58 个 感虫栽培种的杂交 为材料进行 子标记试验，结果发现了一个与目标抗性基因距离为 标记。程须珍等（ 1998） 用中绿 1 号为母本，父本配制感抗亲本之间的杂交组合，将得到的 种子进行人工室内接虫，并对接虫结果进行抗性评价，得出的结果也基本上符合孟德尔遗传 3:1 的分离规律。 （ 1998）利用479 个随机引物，分别在抗感亲本间筛选，得到 8 个多态性较好且与抗豆象基因连锁的 记。日本研究者（ ， 2002）在野生绿豆中发现抗豆象物质，并用这种野生绿豆和栽培绿豆品种杂交，培育出了抗病虫的新品系。 （ 2004）以抗豆象野生种 感豆象栽培种 体， 载体建立了第一个绿豆细菌人工染色体文库（ 其容量可以涵盖 绿豆基因组大小，并利用 针与其亚克隆杂交寻找到 2 个与抗中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 豆象基因连锁的基于 记。程须珍等（ 2005）对 16 个绿豆品种（系）进行了遗传分析，获得一个可能与 抗豆象基因位点紧密联锁的 记。陈庆三等（ 2005）从绿豆抗虫品系 发现一种命名为 蛋白质 ，此种蛋白 具有 高 抗豆象 的能力 。在 抗豆象研究中所取得 的进展可以推动绿豆的遗传多样性研究，比如开发出的一些分子标记 可以用来进行绿豆遗传多样性分析。 总体来说， 目前国内外对绿豆种质资源的 遗传多样性研究水平较低 ，尤其是 国内 对 绿豆 的 分子标记研究 还 处于起步阶段 ， 曾经应用过的 分子 标记仅有 种（程须珍等， 2005） ，且涉及的种质数较少， 对 其他 分子 标记的研究均为空白 。 传多样性研究进展 随着世界人口的 不断 增长和 人们 对粮食种类 需求的多 元 化 ，粮食 短缺 成为摆在 人们面前的一个 日益严峻 的问题。 解决这个问题 的 关键在于 作物的改良和创新 。 作物种质资源 是 作物 改良 和创新 的基石 ， 也 是人类生存和发展最根本的 物质基础和战略资源。 事实上，在认识到作物种质资源多样性 的重要性之前，人们曾经有过惨痛的教训。 19 世纪 40 年代马铃薯晚疫病 大 流行 导致了爱尔兰 “ 大饥荒 ” 的爆发 ； 中国小麦 “ 碧玛 1 号 ” 推广数千万亩，在 1964 年突遇锈病大发生而损失惨重 ； 1970 年 发生在 美国南部 的 玉米小斑病 ， 使美国玉米减 产 165 亿公斤 ， 给农民造成数亿美元的损失 （ 。 这些 灾难 都是种植品种 单一， 多样性 缺乏 导致的 。 从 20 世纪中期开始，保护作物遗传多样性 一度成为 国际社会共同关注 的 焦点， 在 全球范围内兴起了 收集和保存作物种质资源的热潮。 20 世纪 70 年代初期种质库数量 还 不足 10 个 ， 贮存的种质数量也仅有 50 万份 ， 但 截止到 1996 年 ， 世界上已建设了 1300 多座种质库 ， 保存了 610 万份种质资源 （ 含部分重复 ） （ 卢新雄等， 2001） 。 充分 分析 种质资源 的 遗传多样性是 作物 育种和改良的基础和前提。 遗传多样性的分析方法随生物学，尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善，然而目前任何检测遗传多样性的方法在实际研究中都有各自的优点和局限， 它们 都从 不同角度和层次揭示 了 物种的多 样性 ，但 还找不到一种能完全替代其他方法的技术 （ ， 1991） 。 形态学水平 分析 遗传多样性 从形态学或表型性状上来分析遗传变异 具有简单直观的特点， 目前 仍 在 遗传学研究 中 广泛应用 。 表型性状 包括 质量性状 （如花色 、叶形、生长习 性、果形等） 和 数量性状 （ 如株高、生长期、百粒重 等 ） 。在许多 情况下 ，利用形态性状来估测遗传变异是最现实 可行 的方法，尤其是当需要在短期内对变异性有所了解或在其 它 生化方法无法开展 时 （ ， 1991） 。 李自超等（ 2001）利用 27 个 数量和质量性状研究了云南稻种资源的遗 传多样性 ，结果表明滇西南和滇东南地区遗传多样性最大，粳稻多样性大于籼稻 。 （ 2004）利用 15 个表型性状分析了中国栽培大豆的遗传多样性 ，并提出了中国栽培大豆的遗传多样性中心 。形态学标记的 缺点是易受环境条件 及基因显隐性的 影响， 且数量有限 ， 因此， 在遗传育种 深入 研究中有一定的局限性 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 细胞学 水平 分析 遗传多样性 染色体是生物最主要的遗传物质载体 。 随着显微镜技术的不断改进， 染色体核型分析和带型分析技术 被 有效的用于宏观物种分类和 鉴定核型演化。 核型主要包括染色体数目、臂指数、着丝粒指数等 ，它们 代表 一 个物种的染色体特征 ， 染色体数目的不规则变化 在物种内还会 形成非整倍体 （朱军， 1980） 。 染色体分带技术是指利用染色和荧光技术 使 染色 体臂显示不同的带数， 这些条带具有种属特异性， 它 们 可用于鉴定许多物种核型中的任 意 一条染色体 （李竞雄等， 1993） 。染色体缺失、易位等也是 常用的细胞学标记。 显然，细胞学标 记 的数目也是非常有限的，对于染色体数目相同的物种 ，难以用细胞学标记区分。 同工酶 水平 分析 遗传多样性 同工酶 ( 是指 有机体产生的能够催化同一种反应但分子形式不同的酶 的总称 。 它 们通常以共显性 方式遗传 。 由于同工酶 技术 较 简单 且 结果易于比较， 是 一种有效的遗传标记，成为近年来检测遗 传多样性 的 普遍 方法，