【毕业学位论文】（Word原稿）镰形扇头蜱肌钙蛋白I基因的克隆及表达预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 镰形扇头蜱肌钙蛋白 I 摘 要 蜱是一种重要的体表寄生虫，是许多人和动物疾病的传播媒介，经蜱传播的病原体有病毒、立克次体、螺旋体以及原虫。 为了寻找新的抗蜱免疫候选抗原 ,我们 从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺 库筛选目的 列 ,通过 法获取该 长序列。 用 析该基因在蜱体内的 分布 , 并 研究该基因 是否含内含子 。将该基 因 连接 到 ）表达载体， 并转入宿主菌 经 导 表达 ,并对表达产物进行 析。结果从该文库的 的肌钙蛋白 I（ 因疑似序列 ,经 5法得到了 该基因的全长序列。基因全长 852编码 219 个氨基酸 ,预测分子量约为 25经同源性比较，该基因 预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白 I(I:14041807)有很高的同源性（同源性为 ,肌动蛋白结合位点位于 147基酸处 ,且 与长角血蜱肌钙蛋白 I 肌动蛋白结合位点完全相同，表明该基因是镰形扇头蜱 肌钙蛋白 I 基因。 析表明，该基因在镰形扇头蜱卵、幼蜱、若蜱、成蜱以及壳、唾液腺、肠均有表达。 以 镰形扇头蜱基因组 模板扩增到编码肌钙蛋白 序分析，该序列不含内含子。 因 可以在 高效表达 ,融合蛋白分子量大小为 45析表明，抗 组蛋白兔血清可以识别蜱体内的 在 226间有两条带，说明在蜱体内可 能同时存在两个大小不等的 上所述，本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱肌钙蛋白 I 基因，并对其功能进行了初步研究，为该基因的进一步研究打下了基础。 关键词 : 镰形扇头蜱；肌钙蛋白 I；克隆；表达 a of of as To a a of of we in by ,)we of a (ST of 5219 5of a I:14041807)of in . at 47. nI nI in NA nI CR NA as no 45 26nI at in To a in a be to ; 录 第一章 引言 1 第二章 材料与方法 6 材料与试剂 6 镰形扇头蜱的实验室饲养 11 镰形扇头蜱总 取及鉴定 11 镰形扇头蜱肌钙蛋白 I 基因 列的获取 12 镰形扇头蜱肌钙蛋白 I 基因 5端的克隆 13 镰形扇头蜱肌钙蛋白 I 全长基因的克隆 17 析肌钙蛋白 I 在镰形扇头蜱的分布情况 19 肌钙蛋白 I 基因组序列分析 20 镰形扇头蜱肌钙蛋白 I 基 因的原核表达 21 融合蛋白的纯化 25 融合蛋白的复性及浓度测定 27 蛋白质免疫原性分析 28 第三章 结果与分析 31 镰形扇头蜱的实验室饲养 31 总 提取 31 列结果及序列分析 32 目的基因 5端的克隆 32 全长基因的克隆 35 肌钙蛋白 I 在不同发育阶段和不同解剖部位的 分布情况 37 基因组序列分析 38 基因的原核表达 39 重组 蛋白浓度的测定 41 析 43 第四章 讨论 44 镰形扇头蜱的实验室饲养 44 5法在获取未知基因方面的应用 44 鉴定阳性克隆的方法 45 融合蛋白的纯化 45 肌钙蛋白 I 46 五章 结论 48 参考文献 49 附录 54 致谢 56 作者简介 57 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 定引物 定通用扩增引物 烯酰胺 ， N苄青霉素 bp 基对 血清白蛋白 补的 碳酸二乙酯 磷酸脱氧核苷酸 EB 化乙锭 二胺四乙酸 达序列标签 丙基硫代 LB B 培养基 OD 密度值 合酶链式反应 酸盐缓冲液 of 速扩增 端 转录 二烷基磺酸钠 丙烯酰胺凝胶电泳 （羟甲基）氨基甲烷 泳缓冲液 氧核糖核酸末端 转移酶 肌钙蛋白 I 43 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 一 . 蜱类简介 蜱是一类营专性寄生生活的不完全变态的节肢动物 ,隶属于节肢动物门蜱螨亚纲寄螨目蜱亚目蜱总科 ,包括硬蜱科、软蜱科和纳蜱科 3 科，其中最常见、危害最大的为硬蜱科，其次为软蜱科，纳蜱科仅在非洲南部发现一种。 目前，世界上已发现的蜱超过 800 种，在中国已记录的蜱有 110 种 ，主要分为硬蜱和软蜱两大类。蜱的发育需经过卵、幼虫、若虫和成虫 四个阶段，其中幼虫、若虫和成虫这三个阶段都要在人或动物身上吸血，在幼虫变为若虫以及若虫变为成虫的过程中，都要经过蜕皮。根据各发育阶段吸血时是否更换宿主可将硬蜱分为一宿主蜱、二宿主蜱和三宿主蜱。蜱的繁殖能力很强，一般硬蜱一生产卵数千粒，璃眼蜱属和花蜱属中有些种类产卵数可达 20000 粒以上，软蜱一生产卵多次，一般情况下可产卵 1000 余个。蜱的活动具有明显的季节性，在季节变化分明的地区，他们一般都在一年中温暖的季节活动。在同一地区，不同种类的蜱活动季节各不相同，而同一种蜱在不同地区，由于气候和环境的不同，活动时间 的长短也有差别。 蜱类绝大多数寄生在哺乳动物体表，少数寄生在鸟类、爬行类以及两栖类。蜱不仅吸食大量血液，刺激叮咬部位发炎，有的还可以引起宿主呈现功能麻痹性瘫痪，更为重要的是它是许多病原体的传播媒介和保虫宿主，它已成为人类疾病的第二大传播媒介 , 仅次于蚊子。它是许多细菌、病毒、真菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、原虫和线虫的传播媒介或储存宿主，其中大多数是人、畜禽和人畜共患病，如森林脑炎、莱姆病、出血热、 Q 热、蜱传斑疹伤寒、野兔热、布氏杆菌病等。蜱及蜱传播疾病引起的经济损失十分巨大，据 计，世界上有 80%的牛被 蜱侵袭，仅硬蜱给畜牧业造成的损失，全球每年就高达 70 亿美元。 蜱的防治 方法 主要有以下几种：化学防治、生物防治、遗传防治和免疫防治。（ 1）化学防治：化学防治是最主要的防治方法，过去 国内外 常用 有机氯制剂 , 有机磷制剂 , 有机氮制剂来灭蜱，这些药物虽然有效 , 但对人、畜毒性大 , 残效期长 , 造成极大的环境污染 , 有的现已被相关管理部门禁止使用。目前多采用拟除虫菊酯类化合物 (如灭菊酯类 ) 和抗生素类药物 (如伊维菌素 )。由于化学药物的长期使用而出现的 食品安全、环境污染以及蜱的抗药性问题，促使人们设法寻找新 的防治策略。（ 2）生物防治： 自然界中有些动物可大量捕食蜱类。如一些鸟类、啮齿动物、家禽、蚂蚁、寄生蜂等。曾发现有 5 种膜翅目的跳小蜂寄生于蜱体内 ,它们将卵产于蜱体内 , 待发育成成虫时 , 才从蜱体飞出 , 寄生后不久 , 蜱即死亡。据 000)报道 ,昆虫病原真菌 (109孢子体/杀死附尾扇头蜱 (彩饰花蜱 (全部幼虫、 80%若虫和 80%成虫。（ 3）遗传防治：利用 遗传学方法改良牲畜品种及利用辐射、化学不育剂、激素等可使蜱产生染色体异位 , 失去生殖能力 , 然后将它们释放到野生种群中 , 在那里让处理的成虫与野生成虫交配。这样 , 下一代的数量就会大大的减少 , 使蜱的自然种群不断衰减。（ 4）免疫防治： 澳大利亚学者利用从微小牛蜱的肠上皮发现的 成重组疫苗，对微小牛蜱有一定的保护效果，成为到目前为止唯一的商业化的抗蜱疫苗。抗蜱疫苗在蜱类防治中具有很大的潜能 ,它比传统的化学防治更有应用前景 ,但目前尚未实现大面积应用 ,主中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 要原因是由于对疫苗的认识尚十分缺乏、技术不成 熟和成本等问题，目前的研究重点集中在分离、纯化、鉴定与蜱类生理功能密切相关的目标抗原 ,并对其生物功能进行研究。 镰形扇头蜱（ 于硬蜱科扇头蜱属。该蜱是三宿主蜱，在我国 3份在宿主体上发现成虫，主要寄生于水牛，也能寄生于黄牛、猪、山羊、绵羊、犬、野猪、野兔、水鹿等动物，有时也侵袭人。该蜱是我国南方的优势蜱种，分布全国 15 个省，主要传播牛的巴贝斯虫病、马巴贝斯虫病、吉氏巴贝斯虫病。 二 与其它的吸血节肢动物相比，硬蜱 的吸血时间特别长，一般在 1014 天才能达到饱血状态。在蜱的长时间吸血过程中，必然引起宿主一系列免疫排斥和防御反应，为了克服宿主的排斥反应，进行长时间吸血，蜱产生一些抗凝血因子、免疫调节分子、抗菌多肽等功能分子来使其持续吸血，这些功能分子都具有候选疫苗价值。随着分子生物学技术的不断应用，已经从蜱的唾液腺、血淋巴、肠道等组织、器官分离了许多重要的功能分子，它们在抗凝血、免疫调节、固定口器、维持蜱的正常生理代谢等方面起重要作用，其中部分功能分子显示出了抗蜱免疫候选抗原的重要价值，有些已经成功的被制成基因工程苗。 从现有的研究看，蜱体内的功能分子有如下几类 : (1)抗凝血分子 与其它吸血昆虫一样 ,蜱的吸血会立即引起宿主的凝血反应 ,从而阻止了蜱的持续吸血 ,为了完成持续的吸血以及病原的传播 ,蜱分泌了具有抗凝血作用的功能分子来达到目的。 1990年 白钝缘蜱 (离鉴定了第一个蜱抗凝血分子 分子量为 6人类凝血因子 迄今为止已经从 毛白钝缘蜱分离鉴定了 6种 抗凝血分子 ,从 萨氏盾缘蜱 分离鉴定了 3种 抗凝血分子 ,从肩突硬蜱分离鉴定了 2种 抗凝血分子 ,从 微小牛蜱 、 美洲花蜱、附尾扇头蜱、 截形璃眼蜱 、 变异革蜱各 分离鉴定了的 1种抗凝血分子。 (2)免疫调节分子 蜱可以调节宿主的天然免疫和获得性免疫。 1982 年 一次报道了蜱对宿主具有免疫调节作用，随后，许多实验室用蜱的唾液或唾液腺粗提物免疫宿主，观察唾液相关分子对宿主免疫应答反应的影响，结果表明蜱具有的免疫调节作用为：阻断补体的激活 ；降低痒觉反应；削弱 减少抗体反应；抑制 调宿主前炎症巨噬细胞和 巴 细胞的细胞因子反应。 (3)粘合剂蛋白分子 粘合剂蛋白分子在固定口器，保证蜱持续吸血方面起重要作用。蜱的唾液腺粘合剂，主要由蛋白质构成，以脂蛋白和糖蛋白的形式存在，绞粘成牢固的分子结构，只有强酸强碱才能溶解。999)从长角血蜱 (液腺 库克隆表达了一个分子量为29细胞外间质蛋白质 ,用 组蛋白免疫兔 ,取得了良好的免疫效果， 蛋白质结构分析表明它是一种粘合剂类分子 。 (4)酶及酶的抑制剂分子 蜱为了能够消化血液 ,获得营养， 会分泌许多有生物活性的酶，已分离鉴定的酶有：蛋白酶 (如中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 丝氨酸蛋白酶，铁蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶等等 )，蛋白酶抑制剂 (如丝氨酸蛋白酶抑制剂 )，过氧化物酶， ，羧酸酯酶等等。有些酶及酶的抑制剂分子已用于抗蜱疫苗的研究。 从附尾扇头蜱中肠纯化了两个天门冬氨酸蛋白酶， 从微小牛蜱中肠纯化了一个天门冬氨酸蛋白酶和一个组织蛋白酶 L 样半胱氨酸蛋白酶。 从附尾扇头蜱克隆鉴定了 3 种丝氨酸蛋白酶和 4 种丝氨酸蛋白酶抑制剂，并从长角血蜱克隆鉴定了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。 陈灵芝等克隆并 表达了镰形扇头蜱的 因，根据同源性比较的结果分别 将它们 命名为组织蛋白酶 列号为 列号为 (5)抗菌多肽 抗菌多肽广泛存在于生物体内 , 并在天然免疫防御系统中发挥重要作用。 现已从多种蜱体内分离出抗菌样物质，在蜱天然免疫中发挥重要作用。 （ 2001）首次从变异革蜱血淋巴中分离到一个分子量为 42抗菌肽 ,该抗菌肽具有很强的抗菌作用。几乎同时 （ 2001）也从毛白盾缘蜱克隆表达了两个抗菌肽基因，随后，他们又从毛白盾缘蜱克隆表达了另外两个抗菌肽基因，这些抗菌肽基因主要在中肠表达。最近， （ 2004）从希伯来花蜱 (淋巴分离了两种抗菌肽，这两种抗菌肽均具有抗 G 菌和 G 菌作用。 白霞等克隆并表达了微小牛蜱的一种抗菌多肽基因，经过初步体外抗菌实验证明具有一定的抗菌活性。 (6)结构蛋白分子 (1989)从微小牛蜱克隆和表达了肠上皮细胞表面保护性抗原分子 的基因工程苗成为第一个商业化的寄生虫疫苗。随后分离 的 然它们单独使用达不到预期的效果，但它们任何一个与 用，都可提高疫苗的保护效果。 000)从阿根廷株微小牛蜱克隆和表达了肠上皮细胞表面保护性抗原分子 抗性和敏感的微小牛蜱株都有免疫效果 ,被认为是比 广谱的抗微小牛蜱抗原。 三 研究进展 肌钙蛋白（ n）是横纹肌兴奋收缩耦联的主要调节蛋白，分子量为 80由三个亚单位组成 , 肌钙蛋白 C(、肌钙蛋白 T(和肌钙蛋白 I(这 3 个部 分形成一个复杂的蛋白质 ,细肌丝中每隔 40并与原肌球蛋白分子密切结合。 以与 异性结合， 原肌球蛋白具有高度亲和力， 能抑制肌球蛋白的 活性。 当胞液内 度增加到 10 时 , 合 ,引起 象发生变化 , 合力增强 ,肌动蛋白结合力被削弱 ,使肌动蛋白与 离 ,变成应力状态。与此同时 ,原肌球蛋白移动到肌动蛋白双螺旋沟的深处 ,消除了肌动蛋白与肌球蛋 白结合的障碍 ,于是肌动蛋白便与肌球蛋白的头部相结合 ,产生有横桥的肌动球蛋白。在肌动球蛋白中 ,肌动蛋白使肌球蛋白的 活性大大提高 ,于是肌球蛋白催化 解 ,水解产生的能量迫使横桥改变角度 ,而水解产物的释放又使横桥的位置恢复 ,再与另一个 合。如此循环往复，细肌丝便沿粗肌丝滑行，肌肉发生收缩。当胞液内 度降低（ 10）时， 离， 与肌动蛋白结合，从而使肌动蛋白恢复静止状态；同时，原肌球蛋白亦恢复原来的位置，从而使肌动中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 蛋白与肌球蛋白无法结合，肌肉又转为舒张状 态。 肌钙蛋白 尤其是 1987年 引起人们的极大关注 ,1995年美国 作为急性心肌梗死的最新实验指标。 人心肌 4以两种形式存在于心肌细胞内 ,即小部分游离于胞质中 ,为可溶性 ,大部分以结构蛋白形式固定于肌原纤维上 ,为不溶性 ,当胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时 ,游离的 而结合的 成为游离的以急性 早的在血中出现 ,并持续较长时间 ,成为诊断心肌损伤很特异且很有前景的生化指标。 有两种大小不同的同种型 ,一种的分子量为 27要存在于胚胎期 ,另一种分子量为 要存在于成年鼠的心肌中 ,这两种同种型的 一些节肢动物中也发现类似的情况，它们的 3如龙虾、 鲎 和喇蛄 ( 用全蜱蛋白作抗原，鼠抗 以看见有 270明长角血蜱肌钙蛋白 上可以推断 包括蜱在内的吸血节肢动物的 报道很少， 首次从长角血蜱克隆表达了一种 0的蛋白质，多种试验结果表明 0 就是长角血蜱的 蛋白广泛分布于肌肉，唾液腺、肠、壳也有分布 , 在长角血蜱肌钙蛋白 I 的免疫保护实验中，发现肌钙蛋白 I 可以明显延长幼蜱和成蜱的饱血时间，降低幼蜱的饱血率，而且成蜱所孵化的卵的重量比对照组也有明显的下降，说明肌钙蛋白 I 在抗蜱免疫中起到了较明显的作用。 四 本实验室张维谊等构建了镰形扇头蜱唾液腺 她们用 剂提取镰形扇头蜱唾液腺总 反转录合成 链，应用 成双链 其形成两端分别带有 粘性末端。经 集 400将其连接到带有 经体外包装后 , 以 达文库。经测定 , 该文库库容量为 105,重组率为 。扩增后的文库滴度为 1 09m L。从该文库中随机挑选 个单个噬菌斑到在受体菌 把质粒化的菌液涂于含羧苄青霉素的每个平板上随机挑选个菌落，将阳性菌落测序 ,最终获得个有效这些 在 现其中有一条编号为 基因序列非常相似，说明这条 基因片段。 本研究拟在已有工作的基础上，克隆镰形扇头蜱肌钙蛋白 以后的研究工作奠定基础。本研究将首先把含有 且测通，以期获得最大长度的肌钙蛋白 后通过 而得到全长基因，最后采用原核表达系统对该基因进行表达。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 综上所述，肌钙蛋 白 I 广泛存在于蜱的肌肉等多种组织中，并在蜱的生长发育中起着重要的作用，它与蜱的运动、吸血等过程密切相关，它很可能成为抗蜱疫苗的一类候选分子。所以本课题以中国南方的优势蜱种 镰形扇头蜱作为实验材料，对蜱的肌钙蛋白 I 基因进行克隆和表达，为肌钙蛋白 I 的深入研究提供基础。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 材料与方法 6 第二章 材料与方法 料与试剂 要仪器 ： 司 电子天平 海精密科学仪器有限公司 电热恒温水槽 ：上海精宏实验设备有限公司 紫外透射反射分析仪 型（ 312上海康禾光电仪器有限公司 电泳仪 ：大连捷迈科贸有限公司 立式压力蒸汽灭菌器 司 玻璃仪器气流烘干器 b 型：郑州市上街区仪器厂 恒温振荡器 ：江苏太仓市实验设备厂 低速离心机 ：上海安亭科学仪器厂 垂直板电泳槽、转印电泳槽及电泳仪： 司 微型涡旋混合仪 ：上海泸西分析仪器厂 型霉菌培养箱 ：上海跃进医疗器械厂 恒温培养箱 ： 司 操净工作台 ：上海淀山湖净化设备 高速冷冻离心 机 3： 司 分析天平 ： 司 脱色摇床：江苏兴化市分析仪器厂 紫外呈像仪： 司 去离子水 :司 分光光度计系统 845 2A 1000 ： 实验材料 实验动物 : 镰形扇头蜱来自本实验室人工饲养。 新西兰大白兔购自中科院上海实验动物中心。 菌种和质粒 :大肠杆菌菌株 质粒 )均为中国农科院上海家畜寄生虫病研究所第二研究室提供。 体购自 司。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 材料与方法 7 要试剂 剂 , 5剂盒 ,蛋白预染 司 合酶 , 回收试剂盒 限制性内切酶 以及 司 司 白分析试剂盒 司 质粒纯化试剂盒 司 基因组 取试剂盒 赛百盛公司 4接酶 司 氨苄青霉素 , 琼脂糖 , 上海生工生物工程有限公司 弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂 司 低分子量蛋白 中科院上海生物化学研究所 硝酸纤维膜 , 司 蛋白胨 ,酵母提取物 司 要试剂配制 取、 变性电泳相关试剂 理的去离子水 00拌数小时 (4h)， 50心管分装， 121 ， 20菌两次，以使 发除去， 存备用。 75%乙醇 无水乙醇 75理水 25分混匀， 保存备用。 10电泳缓冲液 称量 于 100杯中，加约 70理水，搅拌溶解。用 2N 节 至 向溶液中加入下列试剂： 理 ) 2M 理 ) 2 理水定容至 100 避光保存。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 材料与方法 8 1上样缓冲液 10电泳缓冲液 100l 甲酰胺 500l 甲醛 178l 理水 222l 充分混匀， 保存备用。 酚蓝 溴酚蓝 理水 1分混匀， 保存备用。 10mg/化乙锭（ g 去离子 水 100分搅拌数小时使溴化乙锭完全溶解， 将溶 液转入棕色瓶中，室温 保存备用。 泳缓冲液 钠盐 g 0 力搅拌器上搅拌溶解 ,称 2g 粒 ,逐次加入 ,调 到 解后定容至 100 50冲液（贮存液） 242g 冰乙酸 100力搅拌器搅拌溶解后，定容至 1000温保存备用。 克隆转化相关试剂 1 液 4g 00解后，用 装成 1份， 贮存备用。 体培养基 蛋白胨 1g 酵母提取物 g 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 材料与方法 9 加 解，定容至 100 121 高压蒸汽灭菌 204 保存。 体培养基 体培养基 100脂粉 匀后， 121 高压蒸汽灭菌 20至 50 左右，加入抗生素，旋转混匀，倒平板，待凝固后，倒置，保鲜膜包 装， 4 保存。 泳相关试剂 30%烯酰胺 (29g N， N 1g 用 解，再定容至 1004 ，避光保存。 0浓 至 容至 1004 保存。 0.5 g 2O 80浓 至 容至 1004 保存。 10%0g 0 容至 100温保存。 10%过硫酸胺（ 过硫酸胺 2O 120 保存，或 4 避光保存。 电泳缓冲液（ 10贮存液） 44g 0g 2O 800国农业科学院硕士学位论文 第二章 材料与方法 10 用去离子水定容至 1000温保存备用。 样品缓冲液（ 2贮存液） 2油 20% 酚蓝 4匀溶解，加少量 容至 104 保存。 染色液 考马斯亮蓝 醇 50乙酸 10ml 2O 40解过