【毕业学位论文】（Word原稿）利用噬菌体展示技术鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位预防兽医学硕士毕业论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 利用噬菌体展示技术鉴定猪 瘟病毒 白 抗原 表 位 2 2 国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 1 - 第一章 绪 论 在抗原分子表面具有特殊立体结构和免疫活性的化学基团称为抗原决定簇（ 由于抗原决定簇通常位于抗原分子的表面，因而又称为抗原表位（ 戴和平等， 2002），是 具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够与抗体或细胞识别的部位 。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、定点改造蛋白质分子以降低蛋白质药物的免疫原性，设计无毒副作用的人工疫苗以及免疫治疗剂等有重要的意义。例如， 基于多个表位的疫苗可以避免由于病毒的变异而造成的免疫失败，又很容易与野毒株区别开来，为疾病的净化提供条件。 猪 瘟 （ 猪 瘟 病毒（ 起 猪的一种高度接触性传染病 ， 临床上主要以稽留高热、皮肤和粘膜出现大量出血点为特征（ et 1991）。猪瘟 被 世界动物卫生组织（ 列入 病名录（ ， 为 须申报 的（ 动物 传染病 ，我国 也 将其列为一类传染病 。 自 1983 年爆发 的百余年 来， 已经遍布全世界（除北美洲和大洋洲外）， 给养猪业带来了巨大的经济损失。尽管世界各养猪大国对 但是由于 参差不齐的疫苗质量 、 不合理的免疫程序 以及 野猪 群中 携带 的 猪瘟病毒 等因素 ， 致使 前 仍 是 威胁各国养猪业的一个极重要的传染病 ， 每年用于预防接种、治疗、扑杀的费用数以亿计，因其影响畜产品的 贸易所造成的间接损失更是不可估量。 瘟病毒 概述 于黄病毒科（ 病毒属（ 员（ et 1992），与其同属的还有牛病毒性腹泻病毒 I 型 （ ， 、牛病毒性腹泻病毒 2 型（ ， 绵 羊边界病病毒（ 长颈鹿瘟病毒（ of 。 因组为单股正链 约 et 1996； et 1996； et 1996）， 5端无帽子结构， 3端也没有多聚腺苷酸（ ）尾。含有一个大的开放性读码框（ 由其编码一条约 3 898 个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下，多聚蛋白在翻译和翻译后加工过程中形成 12 种成熟的病毒蛋白，在聚蛋白上从 N 端到 C 端的顺序依次为： C、 C、 于 复制是必不可少的（ et 1996）。四种结构蛋白 C、 ，只有 以诱导机体产生中和抗体，抵御强毒攻击。 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 2 - 瘟病毒 结构 蛋白的结构和功能 C 蛋白 C 也称 病毒的衣壳蛋白，由病毒 的 成，是一 带 大量碱性电荷的蛋白质。其主要区域在瘟病毒中极为保守，同源性大于 91%（ et 1991）。 端由 称 水解作用而产生， C 端可能是由宿主细胞的信号肽酶作用所致（ et 1993）。 称 8，旧称 病毒囊膜糖蛋白。由 227 个氨基酸残基（ 成，分子量约为 44诱导产生中和谱很窄的中和抗体。 有疏水的膜锚定结构，为可分泌蛋白。它在由细胞以出芽或胞吐方式分泌的病毒颗粒囊膜上并不稳定，在细胞培养 却含有大量被分泌出的 仅是一种结构蛋白，而且也是一种功能性蛋白，它与 宿主细胞的嗜性以及致病力有密切关系，但该蛋白不是细胞培养所必需的（ 1997），失活后可引起细胞病变（ et 1998）。 性（ et 1994； et 1996），可降解病毒和细胞的 活性可能是维持 细胞致病性所必需的，因为通过使 性失活得到的突变病毒在其感染的宿主细胞出现了 导致免疫抑制， 完全抑制由刀豆素 导的猪、牛、羊和人淋巴细胞的增殖，强烈抑制动物淋巴细胞内蛋白质的合成（但不损害细胞膜 )，引起淋巴细胞的凋亡，但是却不能引起上皮细胞的凋亡 et 1998；。由于 具有的底物特异性，即针对尿苷的嗜好性以及其活性受 影响，因此这种选择性引起细胞凋亡的特性是可以理解的。 宿主嗜性也与 关，用 和单抗可有效阻断 易感动物细胞的感染（ et 1997）。 表现出神经细胞毒性和抗凝集活性， 染动物后所产生的 近有研究表明， 变后失去 性，并使病毒毒力降低（ et 1999）。 称 病毒囊膜糖蛋白。由 195 个氨基酸残基（ 成， 常和 成异源二聚体，在免疫沉淀试验时共沉淀出来。一般认为 聚化后包埋在病毒囊膜内，不能诱导猪产生中和抗体，也不能保护猪抵抗致死量 攻击。最近有实验证实，含 力遗传确定因子（ et 2005）。 膜糖蛋白，也称 编码 370 个氨基酸残基 （ ，分子量约为53非糖基化的肽链骨架分子量为 面有 5 个 常有 34 个位点被糖基化，因此随糖基化程度的不同而呈现出不同的分子量 et 1999 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 3 - 与病毒对细胞的感染过程，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，是 et 1990），常以二聚体形式存在于病毒粒子及 染的细胞表面，其二聚体包括分子量为 100同源二聚体及与 成的分子量为 75体外， 诱导产生病毒的中和抗体，在体内可诱导抗 保护性免疫，保护猪抵抗致死剂量 攻击。 3 个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。保护性抗原 白上存在 4 个不同的抗原区域 A、 B、 C、 D（ et 1993； 1994）。 A 区 可进一步分为 区， 守， B、 C、 D、 易变异。 B 和 C 区域的抗原表位可诱发动物的保护性免疫反应。在 A、 B、 C 3 个中和区中，各有一段与中和性密切相关的高频突变序列或位点。这些序列或位点的突变株将逃脱中和性单抗的中和作用，免疫血清对这类突变株的中和作用也会降低（ 谢庆阁 等， 1996）。 以前并不认为 一个主要的 T 细胞抗原（ et 1993），近来， 用稳定表达 d/胞作为靶细胞在 d/验中鉴定出 细胞毒性 et 2005）。 是 毒力确定因子，因为只用株的 换就足以使 毒株致弱（ et 2005）。 值得注意的是， 子内部有一抗原表位，它在猪瘟病毒各毒株间保守，即从 结合单抗为 但是这段区域在 株间却非常易变，因此它具有一定的诊断价值（ et 2000； Yu et 1996）。另外， 病毒吸附进入细胞方面也发挥了重要作用，只是它不 像 细胞表面具有相应的受体而呈特异性结合，它的结合是非特异性的（ et 1998）。 瘟病毒抗原表位的研究 进展 早期 对 利用 对猪瘟病毒抗原表位进行了大致的分区（ et 1989； et 1993； 1994），并没有进行精确地定位。随着免疫学理论、蛋白质工程技术的发展，及生物物理学的发展和生物物理技术、计算机技术的广 泛 应用，人们对蛋白质抗原表位的研究方法和思维方法有了新的进 展。 2糖蛋白是 能独自诱导机体产生中和性抗体，保护机体免受强毒的攻击，尤其是 为近年来研制新型疫苗和血清学诊断抗原及 2000）通过基因缺失突变的方法发现， 绪 论 - 4 - （ 2006）利用噬菌体展示随机肽库将此表位精确定位于 该表位 在猪瘟病毒 毒株间 高度保守，而在 且 示该表位具有潜在鉴别诊断 用价值 。 1996）通过靶基因表位文库和噬菌体展示随机肽库，同时使用人工合成表位肽进行验证，结果 表明在 端存在一个线性表位，核心序列为 。 但此表位 接近 能 充分暴露 于 病毒粒子表面， 故 不与完整病毒粒子反应。这一表位在瘟病毒属的不同成员中是高度保守的，因此被认为是瘟病毒共有的抗原表位。 2002）也通过多肽疫苗证实 2蛋白氨基酸序列中的 一抗原表位。 （ 2006） 构建了 6 个 涵盖 白 A 抗原区重叠的多肽疫苗，将此 6 个多肽 疫苗分别免疫猪只，结果多肽疫苗 以诱导机 体产生潜在的保护率，而其它表位疫苗表现出很弱或者无保护率。表明 间内存在线性中和决定族，但在此研究中作者未对两个抗原决定族进行精确的定位。 （ 2005） 通过构建多肽疫苗鉴定出在 白 B/C 抗原区（ 以诱导机体产生多肽特异性的中和抗体，并且可以保护 机体抵抗致死量的 的攻击。作者在2006 年对此区间的多肽构建了 5 个截短多肽疫苗，分别进行猪体免疫结果表明在 存在 线形中和表位，但 没有精确定位。 （ 2002） 通过构建多肽疫苗 鉴定出在 蛋白 N 端（ 在一个线性中和表位。随后在 2006 年（ et 2005）的研究中，构建了 4 个表位多肽疫苗，动物实验结果表明表位疫苗 以诱导高水平的中和抗体，由此表明 白 N 端的一个中和表位。 2001）应用大肠杆菌表面展示技术，构建猪瘟病毒 行 性表位 的 分析， 结果 在 （ 2001）表明该表位具有鉴别诊断功能，它不仅能够将 且 在以 够将疫苗免疫猪和野毒感染猪鉴别开，具有很好的应用前景。 2004）等 将 87株多聚蛋白 构建了截 短 的 重叠氨基酸片段分段表达于大肠杆菌中，然后 利用猪瘟病毒抗血清通过 们 的活性，发现都位于以这三个区间存在抗原决定族。 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 5 - 1995）通过构建一系列含 定出 为 细胞的表位，位于 表位也是第一个鉴定出来的 10进行 结果 发现 35个具有 中的 9肽 （ 和 15肽（ 用最强，作者已将所有这些序列申请专利保护。 2002）人工合成重叠多肽，分别 免疫 动物，通过测定 多肽的 现多肽 二次刺激后能诱导 干扰素的产生，在 细胞毒性试验中， 淋巴细胞能溶解含有该段多肽的靶细胞，提示该肽段存在 细胞抗原表位和 目前已知的 于单克隆抗体针对的表位不够广泛，因此所反映的抗原信息受到一定程度的限制，从而不能鉴定出所有的 于多数已鉴定的表位，未阐明关键性氨基酸的分布及表位氨基酸变异与其免疫反应性的相关性。目前，有关 实上，只有大约 10%左右的表位为线性表位， 90%左右是构象依赖型的。目前对于构 象表位来说，缺乏简单可行的精确定位方法。相比而言，噬菌体展示技术是当前较为适合筛选构象表位的工具。 原表位研究方法 抗原表位有两种分类方法：一是根据细胞抗原受体不同，分为 细胞抗原表位。另一是按结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位，前者又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成；后者又称构象型表位，是由那些一级结构上不连续的氨基酸残基，经过肽链的折叠在空间聚集在一起而形成的一定的空间结构（沈倍奋， 2001）。 以其表面的 蛋白抗原表位（抗原决定簇）结合，此过程与抗原 抗原表位的预测法 该法适用于已知一级结构的蛋白质或多肽抗原的线性表位的预测。人们通过观察抗原表位与已知氨基酸序列的蛋白质某些结构特征关系 ， 发现一些蛋白质的序列或结构特征与抗原表位有关。从 80 年代 出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来（ et 1981）， 已有许多参数、算法发表对 B 细胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推动作用。中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 6 - 现已被大众认可并具有较好预测效果的方法 ， 主要有以下 6 种 ： (1) 亲水性方案 （ 常用的有五种方法 （ et 1983）： 中以 案最为有名。蛋白质抗原各氨基酸残基可分为亲水残基和疏水残基两类。在机体内 ， 疏水性残基一般埋在蛋白内部 ， 而亲水性残基位于表面 ， 因此蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有密切的联系。案是以残基由有机相环 境转移到水相环境的自由能为依据计算各个氨基酸的亲水性 。 现已明确 ， 亲水性部位与抗原表位并无很好的一致性 ， 即高亲水性部位不一定是表位 ， 表位也不一定是亲水性部位。 (2) 可及性方案 （ 如 及性参数 ， 指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性 （ 1990） 。它反映了蛋白质抗原内、外各层残基的分布情况。 (3) 抗原性方案 （ 对 20 个已研究得很透的蛋白质的 69 个连续位点的 606 个氨基酸统计分析 ， 立了抗原性刻度 （ et 1985） 。每个氨基酸用出现在抗原区的频率描述 ， 此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中的频率就可推出此刻度值。该法研究表明 ， 疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。缺点是其所用的数据库有限 ， 并且连续位点内的残基被认为是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低相关性。 (4) 可塑性方案 （ 指蛋白抗原构象不是刚性不变的 ， 其多肽链骨架有一定程度的活动性 ， 活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点 ， 易形成抗原表位。 于已知结构的 31 个蛋白质的 温度因子 ， 发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法 （ et 1985） 。 (5) 电荷分布方案 （ 认为对碱性抗 原特异的抗体多趋于酸性，对酸性抗原特异的抗体多趋于碱性 （ et 1997） 。 (6) 二级结构预测方案 （ 认为转角结构为凸出结构 ， 多出现在蛋白质抗原表面 ， 利于与抗体嵌合 ， 较可能成为抗原表位。而螺旋、片层结构规则不易形变 ， 较难嵌 合 抗体 ， 一般不作为抗原表位 （ 来鲁华 ， 1993） 。可预测蛋白质转角的有 中各种方法预测的成功率均不超过 65%。一般认为 对于已知折叠类型的蛋白质 （ 类、 类和 /类） 正确率高达 95%， 对于未知结构类型的蛋白质 ， 可用 3种类型分别预测 ， 3类预测一致的转角对预测表位有帮助。 用上述各种方案单一的来预测表位，其准确率均不高，最好将多种方案综合考虑。概括而言，作为 利于与抗体结合。另外，具有一定柔韧性，因中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 7 - 为抗原与抗体结合时蛋白 构象有一定的变化。用软件预测出的抗原表位需用实验进一步验证。在实际应用中，常用 克隆、表达，检测表达产物与抗体的反应性，但常因表位预测不准或表达产物没有糖基化、不能正确的折叠而不与抗体反应。 化学 “ 切割 ” 法或酶解法 将纯化的蛋白质多肽用某种化学试剂或蛋白酶切割成若干小片段，经 分离开来，然后转印到硝酸纤维素膜上，再用单克隆抗体或高免血清进行 测小段多肽与抗体是否有反应，有反应的多肽片段中就含有抗原表位。使用这种方法需要知道蛋白质的一级 结构，并且事先清楚切割片段的大小。在实际工作中可以将蛋白质序列输入用工具栏中的 “ “ 可以列出几种试剂（或酶）的切割位点和切割片段的数量，例如： 以从甲硫氨酸（ M）处将多肽切割成若干小片段。 肽探针扫描技术（ 术） 术 是指合成连续的重叠的短肽，与相应的抗体反应，分析检测结果以确定阳性反应片段。这一技术要求有明确的抗原一级结构，并且检测结果为线性抗原表位，对 构象型表位则无法获知，而且合成多肽的费用较高。 白雪帆等（ 2000）利用单抗对人工合成的 15 肽和 8 肽两个阵列进行了免疫学的检测，从而确定了汉坦病毒的抗原表位。（ 2000）利用一系列交叉重叠的多肽鉴定了狂犬病毒 N 蛋白中一个位于 抗原表位。 肽库 （ 肽库是大量的某一长度范围的短肽集合 ， 它包括了该长度的短肽的各种可能的序列或其中的绝大部分 ，是一种强有力的用于快速研究蛋白质蛋白质之间相互作用的工具（ et 2002） 。 肽库基本可以分为以下 3 种类型 ： 有机合成肽库、基因工程肽库和突变体肽库 。有机合成肽库就是直接利用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽集合。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等几率出现。每个载体上只含有一种序列的短肽，其优点是构建方法简单快速；缺点是不能扩增，价格昂贵。基因工程肽库是指先利用基因克隆技术将合成的一组寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至噬菌体基因组中，使之以融合蛋白的形式在噬菌体的外壳蛋白的氨基端表达（有关噬菌体 展示 肽库将在下文中详细表述）。突变体肽库是指某一抗原蛋白的一系列突变体的集合，通过其与抗体的结合反应的强弱，判定与该抗体结合的抗原表位的位置，其中 的各突变体与天然抗原一般仅有 1 个氨基酸的差异。构建突变体库的方法有：变体文库（ et 1996）、 法构建的突变库（ et 1992）。对于已经粗略定位的表位来说，可以合成多肽突变体库（组）进行精确地定位。 分析 抗 原 X 射线衍射被认为是真正能够反映抗原、抗体相互识别的一种技术。该技术最初研究抗原抗体相互作用时抗原中氨基酸的参与识别情况以及表位类型（线性或构象型）。 但该技术受获得抗原 物的晶体的限制。法可避免结晶，但其只能研究小分子的多肽抗原。由于对设备有特殊要求，所以该技术中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 8 - 在一般实验室的应用受到限制。 蛋白质 实际应用中，常根据具体情况选择应用。 是抗原经过抗原提呈细胞 （ 加工后 ， 由 淋巴 细胞受体 （ 的短肽。 确定 于研究细胞免疫机理、过程及研制亚单位多肽疫苗和基因疫苗具有重要的意义。目前 研究 法主要有： 合成重叠肽法 即在合成 重叠的肽后，通过 细胞识别的肽段，即 管应用该方法成功鉴定了几个 是这种方法有其局限性 ，不但工作量大，费用高，而且由于合成的重叠肽一般是 10个氨基酸 残基 ， 含有 5个氨基酸重叠，因此重叠区之间的表位就可能被忽略了，所以不能够鉴定出目的蛋白上所有的 即根据 预测表位，再合成肽段，以 前已经有 很多预测方法，这些方法可以概括为 3种类 型 ： a）根据 据用已构建的 et 1990） 。但不是所有预测的抗原表位都能与b) 根据多肽结构预测：如 分析 射图入手找到对应的口袋，锚插入口袋时结合的前提。 c) 根据蛋白酶体裂解特点预测：如 些蛋白酶体裂解产物是作为 此蛋白酶体的裂解特性决定抗原蛋白的特定序列是不是可能作为 et 1990） 。在 有一些根据 目前对于人和哺乳动物 于畜禽 国内这方面研究尚处于初始阶段。国内表位研究偏向于 疫与诊断，尚未见直接从亚分子水平对 陈继明等 ， 1998）。 菌体展示技术 在抗原表位研究中的应用 噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术（ 985年开创的 （ 1985） 。其原理是将外源基因整合到噬菌体的基因组中，外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合表达，并展示在噬菌体表面，从而将多肽的基因型与其表型直接联系起来，再利用生物分子间的亲和力（如酶 原 体 行筛选，将感兴趣的蛋白质或多肽从库中挑选出来。 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 9 - 噬菌体展示技术 在抗原表位研究中 的应用 确定抗原表位 ， 包括表位的序列和构象 ， 是免疫学家感兴趣的一个问题。表位的确定不仅可以了解有关免疫反应的众多信息 ， 为进一步人工控制免疫反应奠定基础 ， 而且对药物 合成、疫苗设计等也具有指导意义。确定表位常用的方法有 ： 还原法、蛋白印迹法、肽扫描、突变分析等 ， 后两种方法还同时解决了蛋白分子一级序列问题（ et 1997） 。但这些方法大多困难而繁琐。 近几年来，噬菌体展示技术成为探测蛋白空间结构、探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻找高亲和力和生物活性的配体分子的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗等研究领域产生 了 深远的影响。 肽库 （ 的应用为确定表位序列以至其 构象提供了另一有力工具。 噬菌 体 展示 肽库是以噬菌体外壳蛋白 P 或 P 基因为载体，插入一段编码外源短肽的基因片段，噬菌体的浸染能力不受到影响，而外源短肽亦可在噬菌体表面 P 或 P 蛋白 1990年 融合，并 展示 在噬菌体表面，首次建立了噬菌体随机肽库。 从噬菌体 展示 随机肽库中筛选抗原表位的基本原理是生物淘选（ 以单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位为例，其基本技术流程如下：将单抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌体 展示肽库，使其充分与单抗反应后，洗去未结合的游离噬菌体 ，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来。将其浸染宿主大肠杆菌扩增后回收，再进行下一轮筛选。通常经过 3、 4轮的筛选，并且每次增加筛选强度，这样就可获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆。通过序列测定和分析，就能推知该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列，从而确定该单抗所针对的抗原表位。 借助于噬菌体 展示 肽库技术 ， 已经成功分析了多种蛋白质抗原的表位 ，如 et 1993； 杜勇等， 2000） 、 杜勇等， 1999； et 2001； 潘卫等， 2001） 、日本 血吸虫 （欧阳理等， 2002） 等 ， 说明完全可以利用随机肽库鉴定抗原的线性和构象表位 ， 大大简化了重组免疫原的克隆、鉴定和表达等过程 ， 为表位鉴定研究增添了新的手段。 丝状噬菌体具有免疫原性，无须佐剂即可产生抗体，这意味着噬菌体展示系统可以作为候选疫苗抗原表位的递呈工具。 利用展示肉毒梭菌 中和表位的噬菌体不加佐剂直接免疫小鼠，血清疫小鼠是对照小鼠的 10倍。表明噬菌体展示的表位具有明显的抗原性 。 噬菌体展示技术的优点 噬菌体展示技术作为一种新兴的研究方法和工具，在研究蛋白质结构上已被广 泛应用。它具有很多显著的优点，如： 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 10 - A. 高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达 1011 利用抗原 能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。 B. 可用于模拟表位的筛选 利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多（ 2001；et 2002； et 2003）。李全喜等（ 1997）利用单抗 9选噬菌体随机肽库，结果获得了两个阳性克隆，其中一个与抗原天然序列同源，而另一个则完全不同（即为模拟表位）。模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如 利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。 C. 易于纯化 重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。目前用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为 链噬菌体。由于 菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的 噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。 尽管如此，在噬菌体展示技术中仍然存在一些不足。首先，目前所建的肽库容量只能达到 109，要想构建大片段的肽库很困难。其次，需要解决肽库的多样性问题。第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。作为一种新技术，类似的具体问题还很多。但这些暂时的缺点并不能掩盖其巨大应用潜力。 究内容和方法 本研究拟对 2蛋 白进行抗原表位的鉴定。主要研究内容有： 2单克隆抗体 2肽库进行抗原表位的筛选 。 备 体，然后 用 噬菌体 展示 肽库筛选抗原表位。 抗原表位的研究方法中，以表达蛋白或合成短肽结合单克隆抗体的方法应用最为广泛。但表达蛋白所需时间长，而且在原核表达时，由于蛋白不能正确的折叠以及糖基化等蛋白质的后期加工，往往表达的蛋白没有活性，真核表达的量一般又不是很高，而且通常需要借助于单抗。所有这些都限制了蛋白表位的研究。近两年来人们开始利用噬 菌体展示技术鉴定抗原表位。噬菌体展示使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体表面，保持相对独立的空间结构和生物活性，并且可用免疫学方法筛选（亲和纯化），因此噬菌体展示是一种筛选靶蛋白和多肽的强有力方法。该技术可用于研究多肽（蛋白质）的性质、相互识别和作用，并据此从巨大展示肽库中选择特定功中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 11 - 能的多肽结构。噬菌体展示技术则是一种高通量的表位作图方法，即便在没有单抗的情况下，用多抗可直接鉴定抗原表位。 对于连续表位，噬菌体展示随机肽库提供了简单价廉的方法；对于不连续表位，可以从中得到模拟表位，即能特异性地结合到抗体的结 合部位 。 在本研究中，我们 以体为 固相筛选分子，分别对 商品化 噬菌体展示 随机 12肽库进行筛选，来鉴定病毒蛋白的抗原表位。 究目的和意义 猪 瘟爆发的一百多年 来 ， 其流行遍及全世界，对养猪业造成了 巨大 的 经济损失。 科学家 在猪瘟病毒分子生物学、 诊断学、疫苗学 方面 进行了大量的研究 ， 但迄今为止，对猪瘟病毒抗原 结构还没有完全清楚。 鉴于此， 本研究对 门 株 白 进行抗原表位的鉴定，以期深入认识其抗原结构 ，为 阐明 其 蛋白抗原结构、探讨表位生物学功能 奠定基础。 同时 在 猪瘟预防与控制工作中 ， 鉴定的 抗原表位 也可以 为科学、有效地设计基因工程疫苗和相应的诊断试剂提供科学依据和生物材料 。 中国农业科学院硕士学位论文 利用噬菌体展示随机肽库鉴定猪瘟病毒 蛋白 细胞抗原表位 - 12 - 第二章 利用噬菌体展示随机肽库鉴定猪瘟病毒 蛋白 个 线性 B 细胞 抗原表位 摘要 以猪瘟病毒 石门 株 膜糖蛋白单克隆抗体 为固相筛选分子，对噬菌体随机 12肽库进行生物淘选。 3 轮淘选后，随机挑取 8 个噬菌体单克隆进行噬菌体 序列测定。测序结果表明有 5 个噬菌体克隆 展示的一致 序列 基酸序列中 772列有较高的同源性。其余 3 个噬菌体克隆展示的序列与 基酸序列未发现一致序列 ，可能为模拟表位 。初步推测 克隆抗体 针对 白 772一个线性 B 细胞 表位。为了验证此表位，人工合成这段表位编码序列 并进行原核表达， 单克隆抗体 此 融合 表位蛋白 性 检测 结果 表明 772 白的一个线性 B 细胞表位 ，此表位的鉴定对猪瘟病毒诊断研究具有一定的参考价值。 关键词 猪瘟病毒 ； 膜糖蛋白 ； 噬菌体 展示 肽库 ； 抗原表位 抗原表位（ 又称抗原决定簇（ ，在蛋白质抗原大分子的结构和功能的研究中具有重要的作用。 目前用于 研究抗原表位的方法有多种，如利用表达的蛋白结合单抗鉴定表位（ et 2001） ，肽探针扫描技术 （ et 2000； 白雪帆等， 2000）， 噬菌体展示技术及 析等。其中噬菌体展示技术研究抗原表位是近年来新兴的研究蛋白质结构的有力工具，已经利用该技术成功地鉴定了多种病原微生物的抗原表位，如 et 1993； 杜勇等， 2000） 、 以及 寄生虫的抗原表位 （ et 2003）等。 猪瘟是由猪瘟病毒（ 起的一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。该病死亡率高达 8090%，世界动物卫生组织将其列为 须申报 动物 传染病，我国也将其列为一类传染病。 于黄病毒科瘟病毒属，含有一大的开放读码框架（ 由其编码一个约 3 898 个氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白被加工形成 12 种成熟的病毒蛋白 （ et 1999） 。 膜糖蛋白是 要保护性抗原，可诱导机体产生 中和抗体，保护机体免受强毒的攻击 （ et 1991； et 1995） 。本研究利用噬菌体 展示 技术，鉴定了猪瘟病毒一个 保守的 线性 B 细胞表位 ，为 研究 猪瘟病毒抗原 结构 以及猪瘟病毒的诊断提供了一定的参考材料。 料与方法 中国农业科学院硕士学位论文 利用噬菌体展示随机肽库鉴定猪瘟病毒 蛋白 细胞抗原表位 - 13 - 库、菌株与单克隆抗体 噬菌体 展示 随机肽库 于 公司，09； 宿主菌为 E. 基因型为 F15 + ( ( (； 树脂和 辣根过氧化物酶 标记羊抗鼠 购于 司。 体由本实验室保存。 限制性内切酶 及 接酶购自 司。 门（ 株 白单克隆抗体 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所硕士生侯强提供（侯强 ， 2006）。 抗的纯化 参照免疫学实验技术，利用 采用 亲和层析 纯化腹水中的单克隆抗体 紫外分光度计测定其浓度。 菌体展示 肽库的生物淘选 参照 菌体展示随机 12 肽库生物淘选操作手册，进行 3 轮淘选。包被用 96 孔微 量反应 板，包被量为 100g/150L /孔。三轮淘选所用吐温 浓度分别用 菌体夹心 纯化后的 克隆抗体 照 10g/100L/孔的包被量加入 96 孔 酶标板， 4包被过夜 后 ；加入封闭液 （ 300L/孔 ） ， 4 封闭 2h， 用 浓度为 洗涤6 次；将纯化的噬菌体稀释成 1012 100L 加入到每孔中，每个样品重复三个孔，室温作用 2h； 然后按上述同样的方法 洗涤 6 次