【毕业学位论文】（Word原稿）核桃化感作用物对黄芩的影响-栽培生理生态学

分类号 密级 位论文 核桃化感作用物对黄芩的影响 （中文题名） of 英文题名） （作者姓名） 指 导 教 师 翟明普 教授 申请学位级别 硕 士 学科专业名称 森 林 培 育 研 究 方 向 栽培生理生态 论文提交日期 2007 年 5 月 论文答辩日期 2007 年 6 月 学位授予日期 2007 年 6 月 答辩委员会主席： 评阅 人 ： 北京林业大学 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得北京林业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 日期： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京林业大学有关保留、使用学位论文的 规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。 (保密的论文在解密后应遵守此规定 ) 签名： 导师签名： 日期： 摘要 I 摘要 核桃 （ .）是具有较强化感作用的植物之一， 选择适合的伴生物种是核桃复合经营成功的关键。 黄芩（ 是国家三级野生药材物种之一，野生资源遭到严重 破坏，人工栽培体系尚未完善，资源紧缺。目前，在生产实践中我们发现，核桃、黄芩复合种植模式 是核桃与多种药材复合种植模式中较成功的模式。为了进一步了解核桃对黄芩的化感作用，探讨其复合种植的可行性，本文主要通过盆栽试验，并 采用动态顶空套袋采集法、热脱附、 S 技术及各种植物生理测定方法研究了核桃化感物质通过气体挥发、叶片淋溶、根系分泌途径对黄芩所产生的影响，并取得了以下结论： （ 1） 核桃植株不同季节所挥发的气体成分不同。第一，不同季节挥发化合物种类多少不同，按照其数量多少的排列顺序为： 11 月 5 月 8 月；第二 ，不同季节萜类化合物的含量不同，按其相对含量多少排列顺序为： 8 月 5 月 11 月。 8 月份高生长旺盛季节气体挥发物中萜类相对含量较高，即该时期核桃通过萜类物质可能对其周围物种产生的影响较 5 月、 11 月份要强。本研究测得其挥发的萜类物质以单萜为主，与前人所测核桃挥发油成分不同。 （ 2） 核桃挥发物中的主要萜类化合物 柠檬烯对黄芩种子萌发的影响呈现出低浓度下促进，高浓度下抑制的趋势。在低浓度下，对种子绝对发芽率和发芽势的影响表现为促进作用，而在高浓度下则相反，表现抑制作用。各种作用浓度下，黄芩种子平均发芽时间均长于对照 ，且随着浓度的增强，延长的幅度越大，当浓度上升到一定程度时又有所提前。 （ 3）核桃叶片、根系水浸提液对黄芩幼苗的影响，在低浓度情况下均表现出随浓度的加大促进作用增强，但是到达一定浓度后，其促进作用随着浓度的增加而减弱，此后，浓度继续增加，反而会产生抑制作用。核桃叶、根水浸提液下黄芩幼苗苗高、根长、生物量、净光合速率、蒸腾速率、叶绿素含量、荧光特性、养分含量均呈现出低浓度下促进，高浓度下抑制的趋势，但根浸提液产生抑制作用的初始浓度低于叶浸提液。根和叶浸提液对气孔阻力及保护酶活性的影响，在低浓度下产生抑制作用， 而在高浓度下产生促进作用。 （ 4）不同浓度核桃醌溶液对黄芩种子萌发的抑制作用不同。各作用浓度下对黄芩种子绝对发芽率和发芽势均表现出抑制作用，且随着浓度的升高抑制作用不断增核桃化感作用物对黄芩的影响 。对平均发芽时间的影响则表现为低浓度下与对照相比有所提前，高浓度下则有不同程度的延长，即在高浓度下随着浓度的升高平均发芽时间延长的幅度越大。 （ 5）不同浓度核桃醌溶液对黄芩幼苗生长的影响和幼苗栽植密度有关：各密度下幼苗生长随浓度变化的响应趋势不同，其中低密度时表现为抑制作用，且随着浓度的升高抑制作用不断增强，而在高密度时则表现为低浓度下促 进，高浓度下抑制的趋势；相同浓度不同密度下，表现为随着密度的增加抑制作用逐渐减弱，消失，并逐渐转化为促进作用。当密度为 15 株 /盆，核桃醌浓度为 20g2g幼苗各生长指标均高于对照，即在此条件下有利于黄芩幼苗的生长。 关键词： 核桃 ； 黄芩 ； 化感 作用 ； 气体挥发物 ； 浸提液 ； 核桃醌 of . ) is a of an is is of It in of In of to be In we a of we (1) of to of to on of to ay In on of It by (2) in It it of of (3) of a it if on of it in it (4) of of on 桃化感作用物对黄芩的影响 IV at on up At it of it at (5) by to It of of It of of if of it 5 of 0g2g 录 目 录 摘要 . I . 录 . 前言 . 1 2 国内外研究进展 . 3 物化感作用概况 . 3 感物质及其产生部位和释放方式 . 4 感作用研究方法的研究进展 . 4 感物质 的提取 . 4 感物质的分离与鉴定 . 7 感作用的效应研究 . 8 感作用测定的影响因素 . 10 用机理研究进展 . 11 响化感作用的因素 . 13 3 试验设计 . 15 验地概况 . 15 验材料及仪器 . 15 桃 . 15 芩 . 15 器设备 . 15 验设计 . 15 桃挥发性气体对黄芩种 子的影响 . 15 桃植株挥发性气体化学成分分析 . 15 桃主要挥发化合物对黄芩种子萌发的影响 . 16 桃植株水浸提液对黄芩幼苗生长的影响 . 16 桃醌对黄芩种子萌发及幼苗生长的影响 . 17 理液准备 . 17 子发芽试验 . 17 幼苗生长的影响 . 17 术路线 . 18 验方法 . 19 体化学成分分析 . 19 合作用 . 19 光合速率测定 . 19 绿素含量测定 . 19 绿素荧光参数测定 . 19 护酶活性测定 . 20 酶液提取 . 20 氧化物酶活性的测定 . 20 氧化氢酶活性的测定 . 20 氧化物歧化酶活性的测定 . 20 核桃化感作用物对黄芩的影响 植物体营养元素测定 . 20 样制备 . 20 N、 P、 K 元素测定 . 20 据整理及分析 . 20 4 结果与分析 . 22 桃植株挥发性气体对黄芩的影响 . 22 桃植株挥发性气体化学成分及其年变化分析 . 22 檬烯对黄芩种子萌发的影响 . 32 桃植株水浸提液对黄芩幼苗生长及生理机制的影响 . 34 桃水浸提液对黄芩幼苗生长的影响 . 34 黄芩幼苗高生长的影响 . 34 黄芩幼苗根长的影响 . 35 黄芩幼苗生物量的影响 . 36 结 . 36 黄芩幼苗光合特性的影响 . 37 光合作用的影响 . 37 叶绿素含量的影响 . 38 叶绿素荧光参数的影响 . 39 结 . 41 黄芩幼苗保护酶活性的影响 . 41 性的影响 . 41 黄芩幼苗 性的影响 . 42 黄芩幼苗 性的影响 . 43 结 . 43 黄芩幼苗植物营养元素的影响 . 43 桃水浸提液对黄芩幼苗全量的影响 . 43 桃水浸提液对黄芩幼苗全量的影响 . 44 桃水浸提液对黄芩幼苗全量的影响 . 46 结 . 46 桃醌对黄芩的影响 . 46 黄芩种子萌发的影响 . 47 黄芩幼苗生长的影响 . 47 5 结论与讨论 . 54 桃植株挥发性气体对黄芩的影响 . 54 5. 2 核桃叶片水浸提液对黄芩的影响 . 54 桃根系水浸提液对黄芩的影响 . 55 桃醌对黄芩的影响 . 57 论 . 57 参考文献 . 59 个人简介 . 65 导师简介 . 66 获得成果目录清单 . 67 致谢 . 68 前言 1 1 前言 核桃（ .）是胡桃科（ 桃属（ .）植物。我国有 4 种 1 变种，引入栽培 2 种，其中有些种为重要的油料、干果、用材和绿化树种（火树华， 1994）。在我国栽培历史悠久，分布很广，资源十分丰富，其枝、叶、外果皮、根皮、坚果内隔及果仁可入药，对泌尿系统结石、慢性气管炎、皮炎、湿疹及痢疾等疾病疗效很高（郗荣庭， 1996）。 核桃是最 早发现的化感植物之一 （张凤云， 2005） 。早在 2000 年前，人们就已发现，黑胡桃树下其他高等植物如苹果、松、杂草等不能生长，而其它树下杂草丛生，此现象无法用竞争来解释 （赵凤云， 2000） 。 1925 年 黑胡桃树干开始直到27 米远种植番茄和苜蓿，发现 16 米以内的植株全部死亡，以外的则生长良好，且死亡线与黑胡桃根的分布线一致 （张凤云， 2005） 。 1937 年提出了黑胡桃的叶、果实及根皮释放分泌的 5 1937） 。1955 年 离并鉴定此化学物 质为胡桃醌 （张凤云， 2005） 。 1985 年 人研究后发现在胡桃的叶、果实及其它组织内含有无毒氢化胡桃醌，能阻止大部分植物的生长，直至其死亡 （邢勇， 2002） 。 为胡桃醌一般只有种植 15以后，土壤中的胡桃醌数量才积累到足够的浓度发生化感作用（ 1995）。胥耀平经过研究提核桃叶提取物的 化感活性成分主要是酚类及黄酮类化合物 （胥耀平，2003） 。刘亚敏等人利用水汽蒸馏法从核桃叶挥发物中鉴定出了 20 种化学成分，主要包括萜类、芳香烃和酯类化合物 （刘亚敏， 2004） 。 一直以来，许多研究工作者都得到一个规律，随着化感物质浓度的提高其抑制作用增强，随着浓度的降低，其抑制作用降低或者产生促进作用，但是在 2005 年张凤云等人发现核桃挥发油对绿豆种子的化感作用不同于其他供试作物，在一定范围内呈现随着挥发油浓度的增大促进作用增强的趋势。挥发油浓度为 ，其相对萌发率为对照的 134%，对于挥发油的化感作用来说，这是一个新的发现，值得进一步深入探讨 （张凤云， 2005） 。 植物的化感作用有明显的选择性、专一性，如黑樱桃产生的胡桃醌，抑制苹果树生长，但对梨、桃、李树无影响 （冯慰 冬， 2003） 。且同一化感物质对同一植物，浓度高低不同时，则会产生抑制或促进两种截然不同的作用，而且相互作用的两种植物都可能产生并释放出化感物质，但最终结果取决于彼此释放的化感物质的相对浓度（孙文浩， 1988） 。因此核桃虽为化感树种，但并不是不能发展的树种，只要选择于其相适应、相生的树种，在生产实践中就能更好地发挥核桃树种的优势。 黄芩（ 常用中药之一，是国家三级保护野生药材物种。其药用历史悠久，历代本草具有记载。具清热燥湿、解火解毒、止血安胎等功效。用于治疗发热烦渴、肺热咳嗽、泻痢热淋、胎动不安、痈肿疮毒等症。黄芩的核桃化感作用物对黄芩的影响 2 临床疗效确切。黄芩属（ 物全世界共有 300 多种，据中国植物志记载，我国黄芩属植物有 102 种， 50 种变种。新华本草纲要中收载其药用种类26 种。同属的黄芩南北方均有分布，也有栽培（陈柏君， 1999）。药用黄芩以前完全依赖野生资源，用量很大，近年来，临床上对黄芩药材的需求量大增，有限的野生资源遭受了掠夺性采挖，主要产区由于缺乏有力的保障措施，造成黄芩野生资源保护不利，常年连续过渡采挖，使黄芩野生资源遭受到了 严重的破坏。如在河北承德兴隆县北水泉乡，在 20 世纪 80 年代，储量达到 5 万 于当时外贸统收，价格高，采挖严重，导致黄芩资源几近枯竭，现状储量不到 5000目前为止野生资源没有恢复（杨全， 2006）。目前，人工栽培黄芩面积迅速扩大，但是由于栽培技术体系不完善等原因导致栽培黄芩产量、质量差异较大（杨全， 2006）。 林药复合种植是林木与药材树种混交的一种种植模式，它具有一下的优点：充分利用林用空地或裸地栽植药用植物，不占用平原耕地，减少土地争用矛盾（国家每年要安排几十万亩的土地种植中药材）；促进植 被恢复，提高森林生态效益，防止水土流失；实现森林资源的立体开发，促进林区经济的发展，增加林区人民经济收入；开拓中草药资源，保障人民身体健康，缓解药材供求矛盾；林下种植药材，利用自然环境，以无公害的栽培方式，减少农药和化肥的施用，从而可以最大限度地保证药材的有效成分，提高成药医疗保健作用；利用林地栽植药材受市场影响较小，特别是一些生长周期长的药材，可以根据市场需求及价格安排采收（马增旺， 2001）。 可见，如果化感植物核桃与野生资源受到严重破坏的黄芩能够相生生长，则不仅核桃能取得大丰收，也能解决黄芩药 材紧缺的问题，更能充分发挥林药复合种植的各种优势。核桃黄芩复合种植模式是核桃与多种药材复合种植模式中较成功的模式，但到目前为止，尚未见关于核桃与黄芩复合种植的研究和报道。因此，作为“十五”国家科技攻关子课题河北石质山河北平山高效复合经营技术与示范（任务书编号：2004一部分，本研究在过去大田试验基础上进一步研究核桃化感作用对黄芩的影响，探讨核桃、黄芩复合种植的可行性，为生产实践中充分发挥林药复合经营的生态效益和经济效益提供理论参考。 国内外研究进展 3 2 国内外研究进展 物化感作用概况 随着现代科学的发展，出现了许多新的边缘科学，化学生态学就是现代生态向纵深发展的产物，是化学向生态学渗透的结果。化学生态学作为一门系统完整的学科是七十年代在欧美形成的。植物间的化感作用是目前化学生态学研究的活跃领域之一。 植物化感作用（ 称植物生化他感作用或他感作用，它的概念是由德国科学家 1937 年首先提出 （宋君， 1990；罗诚彬， 2003） ，是指植物在其生长发育过程中，通过排出体外的代谢产物改变其周围的微生态环境，从而导致同一生境中植物之间相互排斥或 促进的一种自然现象 （朱汉勇， 2002） 。植物间化感作用大致可分为异种植物间他感作用和同种植物间的相互作用。前者可能对促进群落形成起作用，后者可能成为栽培植物连作障碍的重要原因之一，或两种情况相结合而引起群落的迁移有关 （丁晓文， 1997） 。目前，植物化感作用的研究已具有世界规模，欧洲、亚洲和美洲许多国家都有学者从事这方面的工作。比较起来美国有较多的科学家致力于这个领域的工作，研究范围 广泛 ，包括森林、栽培、水生生态系统等。日本、原苏联、中国、英国、印度等国也都有突出的工作。日本的学者特别注意对微生物进行研究，中 国和原苏联学者更多注意于栽培生态系统。至 1991 年为止，全世界已对100 多种植物的化感作用进行了研究 （马永清， 1991） 。 化感作用还是形成植物群落、决定植物群落中植物种类组成、引起植物群落演替的重要内在因素，是外来植物成功入侵的重要机制（ 2003）。 外来入侵种往往也伴随着强烈的化感作用。在原产地，由于长期的协同进化，植物之间通过化学信息形成了相互作用、相互制约的适应机制，因此化感作用的意义在于促进植物群落的形成和演替。然而，植物一旦离开原产地而成为入侵种，其化感作用便使受体群落的土著 物种难以适应，从而成为排挤和绞杀土著物种的有力武器（史刚荣， 2006）。 北美入侵性杂草 研究中发现其根系分泌物可以影响入侵，在原产地未造成大影响的 C 入北美后却泛滥成灾，排挤了许多土著物种，且结果表明在原产地其伴生树种根系的分泌物可以抑制 C生长，而到了新的栖息地，临近植物反倒被 C 系所分泌的物质所抑制 （ 2000） 。 化感作用广泛地存在于自然界中，并已成为当今国内外的研究 热点，在农林生产中的轮作、间作、套作等的合理安排以及植物病虫害的防治方面起着重要的作用，对促进农林可持续发展有着十分重要的意义和广阔的应用前景。随着科学技术的发展，经过几十年的探索，再加上化学分析和鉴定技术的不断提高、现代微量分析化学和生物技术的发展和完善。化感物质的分离、鉴定以及其机理研究成为近十五年来植物化感作用研究的的研究热点，并且已从不同品种间化感作用潜力的评价转向同一品种在核桃化感作用物对黄芩的影响 4 不同的环境条件下化感作用潜力的变化研究，且近几年来对于在不同营养元素胁迫下对植物化感作用效应影响这方面的研究也较多。 感物质及其产生部位和释放方式 植物间化感作用都是以物质为媒介的，这些物质媒介被称为他感化合物也称为化感物质。现研究结果表明，植物释放的化感物质主要是乙酸途径、莽草酸途径或两途径结合产生的一些次生代谢产物，这类物质结构比较简单，分子量多在 100 300 间（王倩， 2005）。常见的化感物质大致分为：水溶性有机酸、直链醇、脂肪族醛和酮，简单不饱和内酯，长链脂肪酸和多炔，醌类，苯甲酸及其衍生物，肉桂酸及其衍生物，香豆素类，黄酮类，单宁，萜类，生物碱和氰醇等。其中最常见的是低分子量有机酸、酚 类和萜类化合物 （黄京华， 2001） 。化感物质在自然界中并不是以孤立的方式单独起作用，植物化感作用潜力是植物释放的所有化感物质综合作用的结果 （ 1998） 。 为，几乎所有植物的化感作用潜力都是由两种或两种以上的化合物互作引起的 （ 1995） 。 的研究结果表明，植物在自然状态下产生的酚酸类化合物的浓度水平尚不能起到抑草的效果，化感抑草是由包括酚酸类物质在内所有化感物质间的互作效应而引起的 （ 2002） 。2005 年何华勤等人研 究了 5 种常见的化感物质替代物水杨酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、香草酸和阿魏酸间对稗草根长的互作效应，研究结果表明水杨酸和对羟基苯甲酸、水杨酸和肉桂酸间增效或拮抗的互作效应与各因子在化合物中浓度水平密切相关 （何华勤， 2005） 。 化感物质几乎存在于植物的所有器官中，如根、茎、叶、花、果实和种子。同种植物不同器官的水提物往往表现出不同的活性。例如，蟛蜞菊叶和茎水提物的化感作用最强；胜红蓟茎对根长的抑制作用最强 （曾任森， 1994） 。同种植物不同生育期水溶物对受体植物的影响也不尽相同，例如，胜红蓟各器官水溶液对黄瓜的抑 制作用是生殖生长期比营养生长期强，但是整株水溶物的抑制作用却是营养生长期比生殖生长期强 （胡飞， 1997） 。 化感物质的释放方式主要有 4 种：挥发、根分泌、淋溶及残留物分解。不同植物化感物质的释放方式不尽相同，有的以其中一种为主，而有的则同时兼有二、三、四种方式。如水稻通过根系分泌、植株淋洗、残体分解等途径，释放化感物质。植物间的生化他感作用是非常复杂的，并不能仅仅简单地划分为相克和相生。沙漠上的一些植物在干旱缺水时便会产生自毒现象，从而利用有限的水分，保持该物种能避耐干旱而生存、繁衍（丁晓文， 1997）。这是 相克和相生的有机结合，是植物对环境的生态适应。 感作用研究方法的研究进展 感物质的提取 国内外研究进展 5 化感物质的收集是化感作用研究中一个非常重要的环节，确定化感作用大小、化感物质的分离、鉴定以及化感作用机理研究都必须先进行收集，它不仅影响到化感物质是否能够得到有效的分离和准确的判断，还影响到对化感作用效应的评估。化感物质是通过淋溶、挥发、残体分解和根系分泌四个途径向外界环境释放的。不同释放途径的化感物质的提取方法也不相同。由于自然环境比较复杂，植物释放的化感物质都是一些不易溶于水的有机化合物，而 且浓度较低，又易受到土壤中微生物和其他媒介物质的影响（江贵波， 2006）。在这样的情况下，要在不破坏其组分和性质的前提下有效地收集化感物质并不容易。目前根系分泌物的收集方法主要有浸提法、常温吸附法、根渗出液连续收集法等。 （ 1）浸提法淋溶物质的收集 浸提法是化感物质提取的最常用的方法，化感物质的提取源是待测的植物材料或土壤，浸提剂分为有机和无机两类化合物，主要为 氯仿、甲醇、丙酮、乙醚、乙醇等。因淋溶物大多数是极性较大的物质，若所用的溶剂极性较低，则很难代表通过淋溶所产生的 化感作用。过去的实验证实了最能表现自然状态化感作用的为常温下的水提取。但是这种方法的缺点是土壤浸提不能排除微生物对化感物质的影响，而植物体浸提则会破坏植物组织，通过浸提后植物可能会分泌出一些正常环境下不会分泌的物质。 王德艺等人利用此法研究出中林 的化感作用是存在的，它在低浓度时（ 05mg/花生生长的影响不明显，高浓度（ 1050mg/则有极显著的促进作用 （王德艺， 2000） 。 2005 年 测不同品种黑麦草叶片浸提液中化感物质2,4 (2H) 含量，结果表明成熟期最晚的品种其 量最多 （ 2005） 。方芳等人利用入侵杂草一年蓬地上部分的水浸体液对几种经济作物种子进行萌发培养实验，检测出一年蓬的化感作用是存在的（方芳， 2005） 。 （ 2）培养吸附法根系分泌物的收集 植物根系分泌含有大量的生物活性物质，在特定的土壤环境下不仅能影响同种或异种植物的种子萌发、植株生长等，而且在微生物的分布、营养元素的活化以及增强植物对金属毒性的抗性等方面具有重要的作用 （史刚荣， 2004） 。根际是个复杂 的微环境，由于微生物的分解，土壤颗粒的吸附，植物的吸收，以及土壤溶液的稀释，因此要收集活体植株的根系所分泌的化感物质十分困难。目前在国内外较广泛采用“根系分泌物连续收集系统”来收集根分泌物。采用专门设计的水培或砂培系统，用脂收集未受干扰的根分泌物，再用甲醇洗脱树脂中吸附的物质，进行生物测定和分离鉴定洗脱液。曾任森等用此法研究蟛蜞菊根分泌物，发现其对受体植物幼苗有明显抑制作用，其中对根生长的抑制作用强于对幼苗生长的抑制作用 （曾任森，1994） 。 研究黄瓜根系分泌物毒性的过程中，通过 脂收集根系分泌物，核桃化感作用物对黄芩的影响 6 用色 11 种酚酸类物质，其中有 10 种具有生物毒性 （ 981） 。这种方法的优点是不破坏植物体，而且能够尽可能的降低微生物对实验结果的影响。不足之处是收集到的溶液浓度比较低，而且需要把握好植物培养的时间，否则浓度不够无法进行测定。 根际区化感物质的分离、鉴定与生物活性的研究。直接从田间取根基土壤和土壤溶液，分离、鉴定其中的化感物质并进行生物测定，以便研究农田土壤中化感物质及其来源、作用机制，用于指导作物生产。刘秀芬等在减压条件下，用带有多孔陶头的塑料管原位收集土壤溶 液，在根际区土壤和土壤溶液中鉴定出了 50 多种化合物，并研究了其中三种化感物质苯甲酸、阿魏酸和以前未见报道的对 者对玉米和小麦生长发育的抑制作用明显强于前两者 （刘秀芬， 1996） 。阮维斌等人采用土壤溶液提取器直接获得土壤溶液，并对土壤溶液中和大豆残茬腐解产物中的 5种酚酸进行了检测 （阮维斌， 2001） （ 3）水蒸气蒸馏法挥发性物质的收集 水蒸气蒸馏法是提取植物挥发性物质的主要方法之一。 1997年曾任森利用水蒸气蒸馏法获得桉叶的 3个组分：桉油（挥发性脂溶物质）、冷却水（挥发性水溶物质）和渣汁（水 溶性非挥发性物质），幼苗生长测定试验结果表明桉叶水溶性非挥发性物质的化感作用最强，当挥发油浓度达到 时，可完全抑制马占相思的幼苗生长（曾任森， 1997） 。孔垂华等人在研