【毕业学位论文】（Word原稿）用毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白的研究预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 用毕赤酵母表达皮蝇素 A 蛋白的研究 s 摘 要 皮蝇素 A（ ， 皮蝇第一期幼虫在宿主体内移行过程中分泌的一种丝氨酸蛋白酶，具有抗炎、抑制补体反应和延缓免疫反应等功能，很可能成为控制牛皮蝇蛆病的候选疫苗之一。 本文首次建立了用毕赤酵母表达系统表达 技术，对表达条件进行了优化研究，并用纯化 白进行了免疫保护试验。将 因连接到质粒 ，构建重组转移质粒 组质粒通过电激转化入酵 母细胞 组氨酸缺陷培养基和 组酵母细胞在含甲醇的培养基中分泌产生目的蛋白，培养 3 天后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经 测，所表达的蛋白约为 30明该蛋白能与兔抗 清特异性结合。明胶电泳检测显示具有酶活性。对诱导 3 天后逐渐出现的 50白的糖基化显色反应表明该蛋白为超糖基化蛋白，氨基酸含量分析表明该蛋白氨基酸组份与 30组 白一致。单因素改变表达条件试验结果表明，甲醇浓度 溶氧量 70%以上， 诱导 56 小时的情况下表达产量最高，可达1500，显著高于其他表达方法。 用 30白及 3 天后出现的 50白免疫家兔，三周后抗体水平达到峰值，后缓慢下降。 50白免疫效果较 30白好，差异非常显著（ 免疫后，抗体水平上升，三个月后缓慢下降。九月免疫组免疫效果较七月免疫组好，三组抗体水 平差异非常显著（ of on rd of is of of is 免疫 50的蛋白 的兔的抗体高于免疫 30白的兔，将免疫不同蛋白的兔抗体的 P/N 值经数理统计分析，差异非常显著（ 抗体消长，经棋盘式方法确定抗原包被浓度为 5g/清为 1:100 稀释，第二抗体为 1:4000 稀释，终止反应后酶标仪读数，计算 P/N 值。试验结果如下：（如图 13、 14 所示） 值3 七月免疫 A 组牦牛 50白 测结果 3 of 0KD 图可见，七月免疫组在免疫后，抗体水平呈上升趋势， 2 个月后，大多缓慢下降，至次年年初（即免疫 6 个月后）开始回升。 中国农业科学院硕士论文 结果与讨论 31 值2 九月免疫 B 组牦牛 50白 测结果 2 of 0KD 月免疫组在免疫后抗体水平大幅上升，到达次年年初（即免疫后 4 个月）少数保持持平，大多微幅下降。 综合三组的 测结果可推断，目的蛋白对刺激抗体产生具有一定的效果，从绝对值而言，九月免疫组所引起的抗体水平略高于七月免疫组。分别比较 A、 B 两组免疫后第一次采血所测抗体水平，以及 A、 B 两组与相应时间对照组的抗体水平，经数理统计分析， A 组与 B 组，B 组与 C 组， A 组与 C 组的抗体水平均存在着非常显著的差异（ 从 检测结果看，九月免疫超糖基化重组 白能刺激机体产生相当高的抗体水平，比七月免疫情况略佳 ,试验三组间抗体水平均存在非常显著的差异（ 。 8. 用 50白免疫自然感染牦牛取得一定保护效果。免疫组相对对照组，瘤包虫孔明显减少，七月免疫组与九月免疫组感染率分别为 对照组为 ，平均感染强度分别为 照组为 13）。九月免疫组免疫效果较七月免疫组好，但差异并不显著（ P 果表明，目的蛋白对抗体产生具有一定的效果，在免疫后抗体水平上升，到达次年年出后出现缓慢下降。九月免疫组抗体水平略高于七月免疫组，三组抗体水平均存在显著差异（ P 中国农业科学院硕士论文 参考文献 23 参考文献 1. 陈琳，张亚东等 嗜甲醇酵母表达系统研究进展 国外医学分子生物学 2002， 24（ 1）， 1114 2. 顾越星 皮蝇素 A 基因的克隆及在杆状病毒表达系统的表达 硕士学位论文 北京 中国农业 科学院 2003 3. 关贵全，罗建勋等 牛皮蝇蛆病 断方法的建立及应用 中国兽医寄生虫病 2004，12： 132 134 4. 郭媛华，迟光明等 内蒙古自治区牛皮蝇蛆病的流行与防治 中国兽医寄生虫病 2004， 12：171 174 5. 胡云龙，林世康，张双全等 重组蛋白的糖基化及其影响因素 中国生化药物杂志 2000，21（ 3）： 153 156 6. 金冬雁，黎孟枫等译 分子克隆实验指南（第二版），科学出版社， 1998 7. 李洪钊，李亮助，孙强明等 巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略 微生物学报 2003， 43（ 2）：288 292 8. 李黄金，龙綮新，林志雄等 甲醇酵母表达系统高拷贝数整合型表达载体的构建 生物工程学报 1998， 14（ 4）： 377 383 9. 李文业等 伊维菌素等药物防治牛皮蝇的效果 中国兽医科技 2003， 33（ 4）： 72 73 10. 李子健，金宁一等 人免疫缺陷病毒 因在毕赤酵母中表达条件的研究 吉林大学学报 2003， 29（ 2）： 135 137 11. 马米玲，关贵全等 不同剂量的伊维菌素注射剂和浇泼剂对牦牛牛皮蝇的防治效果观察 中国兽医寄生虫病 2004， 12： 135 137 12. 宋丽雅，于群，卜凤荣等 几种主要的 酵母表达系统研究进展 中国输血杂志 2003， 16（ 3）：209211 13. 王爱华 ,王洪志 牦牛牛皮蝇驱避剂的合成及筛选 西南民族大学学报 (自然科学版 ) 2003，10（ 4）： 123 125 14. 熊盛，任向荣，唐永红等 人源抗 链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达 生物工程学报 2003， 19（ 1）： 19 23 15. 徐梅倩，顾越星等 用阴离子交换层析纯化牛皮蝇素 A 蛋白的研究 中国兽医寄生虫病2003， 11（ 1）： 1 3 16. 张平武，李育阳等 新型酵母表达系统的研究 生物信息通讯 1999， 10（ 4）： 306 309 17. ., in in 1999,4:4550 18. 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N., of a of 1986,81:11751177. 中国农业科学院硕士论文 附录 28 技术路线图 增 因 切转移质粒 切 物 纯化酶切产物 纯化酶切产物 转化大肠杆菌 选、鉴定、测序 提 取重组转移质粒 制备感受态酵母细胞 切线形化重组质粒 电击转化重组质粒 筛选含多拷贝重组质粒的酵母细胞 甲醇诱导蛋白表达 中国农业科学院硕士论文 附录 29 甲醇诱导蛋白表达 化目的蛋白 胶电泳 基化试验 筛选最佳表达条件 甲醇浓度 溶氧量 表达时间 免疫试验 家兔 牦牛 诊 中国农业科学院硕士论文 附录 30 达载体图谱 中国农业科学院硕士论文 致谢 52 致 谢 首先感谢我的导师何国声研究员和徐梅倩副研究员对我工作上、生活上无微不至的关怀。我所有的成绩和他们的辛劳密不可分。他们严谨的科学态度和开阔的思维方式将使我受益终身。 其次，本文是欧盟项目 000皮蝇蛆病控制 ”和国家 863 课题“牛皮蝇重组基因疫苗的研制”的部分内容。项目主持人法国农科院前家畜寄生虫病研究所所长 C. 士对控制牛皮蝇研究几十年如一日，执着勤奋取得了与世瞩目的成就，是世界控制牛皮蝇蛆病的首席专家。在我进入研究生学习后，她一直对我循循善诱、谆谆教导。她的成就，她的人格，她无国界的科研精神，使我终身难忘，永远铭记。同时也感谢欧盟和中国的合作伙伴们多年来的信任与支持，为我们创造了良好的科研条件以及国际间沟通的平台。 本文是欧盟课题的一部分，是他人成果的延伸与突破，感谢课题组中各成员多年来的 努力，感谢徐梅倩副研究员、曹杰副研究员、朱顺海兽医师、顾越星老师为研究内容打下了坚实的基础，以及在我试验过程中给予的大力帮助。 本文免疫牦牛的现场试验部分是和甘肃省畜牧兽医站的李万坤博士合作完成的，甘肃省甘南地区试验条件极为艰苦，感谢李万坤老师克服了种种困难，完成了试验，为本文添上了很重要的一笔。 感谢上海交通大学生命科学院的张大兵教授对试验的关心和指导。感谢蔡幼民研究员、沈杰研究员、袁世山研究员和钱旻教授等对论文提出的宝贵意见和建议。感谢在答辩期间给予大力帮助的黄兵研究员和顾惠明老师。感谢在实验过程中 曾给予我帮助的朱传刚博士、姜连连老师、张北民老师、宋斌老师、图书馆的周萍老师。 感谢我的师妹严凤、魏佳和黄燕，师弟高兴春在试验过程中给予的无私帮助。 感谢我家人在我学习生活中的理解和支持，使我的论文能够顺利完成。 最后，对三年来所有关心和帮助过我的老师和同学致以最诚挚的谢意。 本试验为欧盟项目 000制牛皮蝇蛆病”和国家 863 项目 2001皮蝇重组基因疫苗的研制”的部分内容，本论文在农业部动物寄生虫学重点开放实验室完成。 中国农业科学院硕士论文 作者简介 53 作 者 简 介 孙怡 ， 女 于 1980 年 9 月出生，上海市人 简 历 1998 年 9 月 7 月 上海交通大学 动物医学 学士 2002