【毕业学位论文】（Word原稿）产漆酶细菌菌株的分离筛选及漆酶基因片段的克隆生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文 编号： 中国农业科学院 学位论文 产漆酶 细菌 菌株 的分离筛选 及 漆酶 基因片段的 克隆 I 摘 要 漆酶是一种 含多个铜原子的 多酚氧化酶 ,能 催化氧化多种芳香族化合物，在木质素矿化降解、腐殖质形成等过程中发挥重要作用。 其应用主要集中在以下几方面 :参与 有机合成 ,生物检测 ,有毒化合物的消除 ,工业废水处理 ,纸浆的生物漂白 等 。 本试验从北京昌平某 羊场 采 集 的堆肥样品中 分离 筛选 出 一株生长快 速 ，菌落规则，传代稳定，具有漆酶活性的细菌菌株，并对 该菌株的 生理生化 性质 进行 了初步研究 ，此外 ,通过构建基因组文库，对该菌株中的漆酶编码基因进行了克隆。具体实验结果如下： 1. 漆酶活性测定表明：该菌株 产胞外漆酶 ，漆酶活性最高可达 。 2. 定 和 16S 列分析 结果 表明：该菌 为 假单胞菌） 属 菌株 ,革兰氏阴性 菌。 3. 该菌株的 最适生长温度为 27；最适生长 为 生长 围为 株可 耐 受 2%的 盐 离子 浓度，对 青霉素 有抗性 。 4. 以 构建 了该 菌株的基因组文库，文库 库容 达到104， 插入片段长度约为 2 7以漆酶的产生为筛选标志 ， 对构建的基因组文库进行筛选， 得到了 具有漆酶活性的重组菌 ， 经测序 得到 2458核苷酸序列。 阅读框架分析 表明： 该 插入 片段中含有一个 5 端完整、长 1193码 397 在 游 约 区域为启动子区；前 13 个氨基酸组成信号肽 ,信号肽切 点位于 游 的 第 14 个 氨基酸 。该序列已在 注册 号 5 漆酶活性测定表明： 重组菌株的漆酶活力为 。 现有文献 中 尚未发现 有 关 假单胞菌 具有漆酶活性 的报道，本 研究 首次 分离到 具有 漆酶活性的假单胞菌， 并 克隆到 具有活性漆酶编码能力的漆酶基因片段， 具有原创性 。 关键词 ： 漆酶，筛选，假单胞菌，基因组文库， 重组菌株 of a of is a of an in of of in is in so In a of In by a as 1. -1 2. 6S -1 , its a 3. -1 7 , pH pH .0 It %, it 4. In we of as as We 704. A 458an 193bp at 97 3RF 3 at 50 100. to 5. of , is no is an 目 录 第一章 绪 论 . 1 酶的分布 . 1 等植物 . 1 菌 . 1 菌 . 1 他来源 . 2 酶的理化性质 . 2 . 2 酶的化学组成 . 2 酶作用的底物 . 3 酶活性的测 定方法 . 4 酶的催化反应机理 . 5 . 漆酶的氨基酸序列分析 . 6 酶基因结构分析和组织分析 . 6 酶基因家族 . 7 酶基因的克隆 . 7 . 8 . 8 . 9 . 10 物肥料 . 10 物检测 . 10 药卫生 . 11 纸工业中的应用 . 11 成方面的应用 . 11 品工业中的 应用 . 12 织加工中的应用 . 12 酶的研究现状与展望 . 12 课题的研究 目的、意义 . 13 究目的 . 13 究意义 . 13 第二章 细菌漆酶菌株的筛选及鉴定 . 14 料和方法 . 14 验材料 . 14 验仪器 . 14 剂与培养基 . 14 株的筛选 . 14 株的鉴定 . 15 株漆酶活性的测定 . 18 果与分析 . 19 菌种筛选 . 19 漆酶活性的测定 . 19 菌株鉴定 . 19 论 . 24 第三章 细菌漆酶菌株生理生化性质 测定 . 25 料和方法 . 25 株 . 25 验仪器 . 25 剂与培养基 . 25 验方法 . 25 酶液的制备 . 25 选所得菌株 的生理生化性质测定 . 26 果与分析 . 27 物学特性 . 27 株的生长性质及耐盐性、抗性 . 28 . 31 论 . 31 第 四章 株 基因组文库的构建及筛选 . 32 料与方法 . 33 料 . 33 验方法 . 33 果与分析 . 37 . 37 . 37 V . 38 的片段与载体的连接、转化 . 38 测受体菌 . 39 组质粒的酶切验证 . 39 组质粒产漆酶活性的测定 . 40 组 质粒中插入片段的序列测定及分析 . 40 酶基因片段的克隆 . 45 论 . 46 第五章 结 论 . 48 参考文献 . 49 致 谢 . 54 作 者 简 历 . 55 中国农业科学院博士学位论文 英文缩略表 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 卞青霉素 ,2偶氮 (36 血清白蛋白 脱氧核苷三磷酸 化乙锭 二胺四乙酸 丙基硫代 碱基对 道尔顿 密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 酸盐缓冲液 聚合酶 链式反应 乙二醇 糖核酸酶 十二烷基硫酸钠 ,N,N,N四甲基乙二胺 三羟甲基氨基 甲烷 43中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 漆酶 (一种含铜的多酚氧化酶 ,在结构和功能上与属铜蓝氧化酶 (族中一小族的植物抗坏血酸氧化酶 、 哺乳动物血浆铜蓝蛋白存在着许多相似之处 。漆酶最早是 由日本学者吉田在 漆树的分泌物中发现的，随后人们发现一 些高等真菌也能分泌这种酶。漆酶广泛存在于担子菌、子囊菌和半知菌中，但其中最主要的生 产者是担子菌中的白腐菌，近年来有报道某些昆虫、植物、细菌也能产生或分泌漆酶 （ 宋小双 等， 2005） 。 自 1883年首次被发现以来，漆酶一直是 化学、 生物学和环境科学等领域十分活跃的研究热点。 近年来，随着研究的深入，漆酶对与木质素前体物质分子结构相似的许多环境污染物的降解倍受人们关注，尤其 是 在纸浆的生物漂白、新型传感器的研制和生物检测、生物燃料电 池的阴极反应、食品饮料中酚类物质的去除 等方面已取得突破性进展，具有深远的科学影响 和巨大的社会经济价值 （张银波等， 2005） 。但选育新的漆酶产生菌、 优化 产酶条件 、 提高漆酶产量 等一系列问题 仍是 今后一段时期内研究的热点。 酶的分布 漆酶广泛存在于自然界的多种植物和菌类分泌物中，按其来源主要分为漆树漆酶 (真菌漆酶 (大类 （ 丁原涛 ， 2004） 。 等植物 在漆树科植物中， 布 在中国、日本， 要在越南、柬埔寨， 布在美国。东南亚的芒果 (加洲胡椒树(巴勒斯坦黄连木 (萜木李 (都含有漆酶（季立才， 1996） 。 菌 在真菌中，漆酶大多 分布于 担子菌 (多孔菌 (子囊菌(脉孢菌 (柄孢壳菌 (曲霉菌 ( （季立才，1996） 。 核生物 近年来人们研究发现 漆酶 有 可能广泛存在于原核生物中。 ,et ,1999； , . B., 2000)发现联合固氮菌产脂固氮螺菌(有产生漆酶的能力。目前 ,在 薰衣草链霉菌 ） 、 色链霉菌） 、 蓿中华根瘤菌） 、 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪 论 2 和 嗜碱芽孢杆菌 ） 等细菌中均发现具有漆酶活力 （黄俊， 2006） 。 他来源 在 马铃薯、香蕉、桃子、咖啡豆、苜蓿花等植物中也发现含有漆酶，甚至 在 一些动物 的 肾脏（如猪肾）、血清和黄蜂的毒液中也发现了漆酶。 漆酶在不同的物种 中 发挥不同的功能 ,例如 ：在昆虫中，它们参与甲壳的硬化；在植物中，参与细胞壁形成，还与木质素化和去木质素有关；在芽孢杆菌中，则是和抗紫外线的孢子组装有关；在一些植物致病性真菌利用这类酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用，因此，漆酶也可看成是许多真菌疾病的毒力因子 (S.,2006) 。 酶的理化性质 酶的结构特 征 漆酶是最简单的多酚氧化酶，一般含有 4个铜离子，根据光谱和磁性特征可将其分为 3类：型 型 1个，是单电子受体，呈顺磁性，可用顺磁共振 (定；型 2个，是双电子受体，呈反磁性， 测不出来。型 蓝色， 614型 蓝色，没有特征吸收光谱；型 是偶合的离子对，在 330于漆酶含糖量较高，难于得到 x 射线分析用的漆酶单晶体，它的三维空间结构还不清楚。 但根据光谱、 磁性和实验事实推测，铜离子的配位结构为：型 别被与 2 个 S， 2 个 的 成变形的四面体；型 四方配位，分别与两个 (或三个 )和 2个 (或 1个 )化型的漆酶含氧配体可能是 型 的 2个 别与 3 个 配位，又同时与 的 O 配位形成氧桥。铜离子是漆酶的研究中的难点和热点之一，已证实它们处于漆酶的活性部位，在漆酶的催化氧化过程中起决定性作用 （宋安东， 2004） 。 酶的化学组成 表 1 酶 的 分 子 量 、 含 糖 量 及 含 铜 量 u of 漆酶来源 分子量 / 含糖量 /% 含铜量 / 树 ) 140 45 4 6 杂色云芝 ) 10 14 4 10 4 390 24 16 70 25 4 80 23 4 雷伯氏菌 ） 55 - 4 糙脉孢霉 ) 11 3 4 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪 论 3 漆酶的分子量、含糖量和含铜数见表 1 除 了 柄孢漆酶是四聚体外 ,其他漆酶一般是由约400 500个氨基酸单一多肽组成的，其中 包 含 以下 19 种氨基酸 ： 季立才 ， 1996） 。 酶作用的底物 漆酶是单电子氧化酶 ,其底物具有较大的广谱性，从目前已报道的文献 初步统计 ， 它 能 催化 的不同类型的底物已达 200余 个 。其作用 底物 按 结构 大体 可归纳为以下 6类 （季立才等， 1996） 。 类及其衍生物 它们约占漆酶底物总数一半 ,主要是邻、对苯二酚等多元酚及其衍生物 。漆酶不能催化 氧化 苯酚 ,却能催化氧化 后者的取代基多在酚羟基的邻、对位 ,随着取代基的种类、数目、 所 在芳环的位置不同 ,反应活性也有 不同 。例如 ,真菌漆酶催化下列酚的氧化活性次序为 :对甲酚 邻甲酚 间甲酚 苯酚； 2,62,6邻甲氧基苯酚 邻甲基苯酚。 胺及其衍生物 结构与酚类相似 ,主要为多氨基苯及其衍生物。例如邻、对苯二胺 ,1， 5苯胺、 酸及其衍生物 在芳香酸底物中 ,芳环羧基的邻、对位有羟基、氨基或烷氧基 ； 在非芳香羧酸中 ,碳链上含有酚或芳胺类基团。例如 ,对氨基水杨酸 ,原儿茶酸及其甲、丁、戊、辛和十二烷基酯 ,对香豆酸、咖啡酸等 。 体激素和生物色素 在有机溶剂和磷 酸盐缓冲液中 ,真菌漆酶可以催化氧化雌甾二醇、 激素三醇、己烯雌酚等。漆树漆酶催化氧化胆红素、茜素红、苏木色精、醌茜素、茜素蓝 属有机化合物 这类底物主要是二茂铁类化合物。 在二乙二醇丁醚 (酸盐缓冲液体系中 ,漆树漆酶中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪 论 4 催化氧化 =。 他非酚类底物 除了早期发现的亚铁氰化钾、抗坏血酸外 ,近年来还发现一些非酚类底物。 如 1,2,4,512-(3,4乙二醇 ,苯环上连有羟基、烷氧基、氨基的吲哚衍生物等。 酶活性的测定方法 分光光度计法 底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。它有如下优点： (1)溶于水，在室温下放置 6 个月仍较稳定。 (2)其反应只有一步，即从 它的阳离子自由基。阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几天之内是稳定的。 (3)在漆酶的作用下， 色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其 为底物测定的灵敏度较高。 (4)到目前为止，还未有报道称 致癌作用、诱变作用或是剧 烈的毒性 (张鹏 ,2007)。 别对 5 入 20 的抗坏血酸盐的测定溶液，于不同波长进行了光谱扫描，发现纯 浅蓝绿色，且在 415 有吸收峰；而加了抗坏血酸盐的溶液为无色，在 415无吸收峰。 最大吸收峰在 340阳离子自由基的最大吸收峰在 415由此推断，在 溶液中含有极少的 离 子自由基，它们在更强的还原剂作用下被还原为 底物进行漆酶的定量分析，通常在420测定 3 吸光度的变化。用这种底物进行定量分析有一个缺点，即 离子自由基溶液的吸光度受溶液中未反应的 度的影响。这就产生了一个问题： 420的摩尔吸光系数是在纯 离子自由基的条件下求得的，而在实际测定反应中， 过量的，这就导致人们低估了酶活。 这种影响不能忽视，因为反应终止时，溶液中至少还要有1 的 管用 底物存在 上述问题，但是它仍是漆酶酶活测定的最佳底物之一。一般以 底物，采用 冲体系、乙酸 乙酸钠缓冲体系或柠檬酸盐 磷酸盐缓冲体系。如果菌种产生过氧化氢，为了准确测定，需加入一定量的过氧化氢酶，用以破坏过氧化氢。因为在代谢过程中，菌体自身产生过氧化氢可激发木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶对 氧化 （朱思明， 2005） 。 香醛连氮 分光光度计法 丁香醛连氮 ( 是漆酶酶活测定较为常见的底物之一。以丁香醛连氮为底物是将 其氧化为相应的醌。采用 冲体系 (，在 525测定吸光度的增加。 以丁香醛连氮为底物时 ,酶活力虽然较高 ,但当底物和酶液用量较大时反应不太稳定 ,需要用中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪 论 5 冰浴来终止反应 ,此时酶活力明显低于不用冰浴时 ,若采取减少底物和酶液用量的方法 ,可以较大程度地克服反应不易终止的缺陷 ,酶活也较高；而且由于丁香醛连氮的摩尔消光系数很大 ,灵敏度很高 ,且抗干扰性好 ,因而是一种很好的酶活力测定方法 (吴涓 ,2001)。 创木酚 分光光度计法 以愈创木酚为底物，以琥珀 酸钠做缓冲液， 465测定吸光度的增加 （ 周金燕 ， 1994） 。此法反应时间长 ,酶活力很低 ,但反应非常稳定 ,这与该反应的米氏常数较大有关 故近年来国内外较少采用 。 此外， 还有其它一些用于漆酶酶活测定的底物，无论用哪一种底物进行测定，都有其自身的优势和不足。 微量热法 有人 采用 微量热系统，在温度为 298. 15K， 条件下，测定了漆酶催化氧化底物 3， 4， 5苯三酚、邻甲氧基酚的活性，用磷酸二氢钠 和磷酸氢二钠配制成 缓冲液。该法操作简单，所用样品量少，不需要光学透明的样品，对酶的悬浮液也能直接测定，对反应体系没有任何限制或干扰 (望天志 ,1998)。 冲激光光声法 阎宏涛 等 人 2003年 首次采用脉冲激光光声法测定了漆酶酶活。试 验了入射激光能量、激光照射时间和温度变化等因素对漆酶活性的影响， 建立了测定漆酶的光声分析方法，检测限为 3 g，是一种高灵敏度的生物样品分析方法。 酶的催化反应机理 图 1 酶 的 催 化 反 应 机 理 he o f 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪 论 6 根据对漆酶光谱学、动力学和晶体衍射的研究 ,漆酶催化底物的方式可能如 图 1示 :底物结合于酶活性中心的 I 型铜原子位点 ,通过 径将其传递给三核位点 ,该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子 ,使之还原为水。整个反应过程需要连续的单电子氧化作用来满足漆酶的充分还原 ,还原态的酶分子再通过四电子转移传递给分子氧 ,因此漆酶又被称为分子电池。在此过程中 ,氧 化 还原很可能分两步进行 ,两个电子转移产生过氧化氢中间体 ,该中间体在另两单电子作用下被还原为水 （钞亚鹏， 2001） 。 酶的分子生物学研究进展 酶的氨基酸序列分析 漆酶蛋白质部分一般是含有一段大约 500个氨基酸 残基的多肽序列 ,且都有 同来源 漆 酶的氨基酸序列相似性并不高 ,这一点可以从其 型研究表明 , 而二者的氨基酸初级结构的 相似程度并 不高，五 种漆酶和两种抗坏血酸氧化酶之间仅表现了 7%同源性。曲霉属和粗糙脉孢霉竟然和担子菌漆酶的氨基酸序列没有同源性 ,倒是黄瓜过氧化物酶与之有 50%同源性。由于更多的真菌漆酶序列已被测定 ,从中人们很容易得出白腐担子菌的序列间有较高的同源性的结论 ,但这只能暗示这些真菌关系更密切 ,而不能说明这一结构对催化功能有显著的影响。但是 ,很重要的一点是这些漆酶在和铜原子连接的半胱氨酸和 10 个组氨酸之中或周围都有严格的保守氨基酸残基 ,任何情况下这些氨基酸都分布在含有两对组氨酸残基的 或是分布于 残基之间 (赵敏， 2005)。 酶基因结构分析和组织分析 真菌漆酶的基因外显子序列长度一般介 于 15002000应的氨基酸残基为 50000体序列的同源性并不高。 酶基因克隆全长为 1828包含 )尾 ,基因开放性读码块长度为 1554码 列含量为 58%,简并密码子位点 比例较高 66%(C(46%)A(6%)。 酶有着密码子偏向性如 87% C/,13% 0% ,20% )和 0% 0% 它包含 6个潜在的 酶基因上游序列 240括启动子元件 位于转录起始点上游 68其它的真菌漆酶也包含启动子元件 而 ,尽管这些序列保守 ,但它们的位置是不同的 (1998)。 真菌 漆酶基因中含有相当多的内含子 ,例如 个内含子 , 10 个 ,4个 ,9个 ,其中一些高度保守。而且不同来源的漆酶基因内含子的位置也大多是保守的 ， 这两方面可以作为分析 真菌漆 酶的同源性中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪 论 7 和菌株间亲缘关系的依据之一 ( S,1996)。 同植物及真菌漆酶比较 ,细菌漆酶同样含有 4 个铜结合位点 ,但基因序列与真菌的同源性不高（黄俊， 2005）。 酶基因家族 许多真菌能产生由多基因编码的几种漆酶基因的同系物家族 ,如 4 种漆酶同系物 , 5 种 , 3 种 , 2 种 , 4种 ,种 ,种 ,少有 4种。一般来说这些基因在不同的环境条件或真菌生长不同阶段的生活周期中表达。研究 种同系物发现它们的产生发生在基因转录的不同水平 ,因为组成性表达基因 ,而、 则在不同的诱导条件下表达。对 的研究发现 , 组成性表达基因 , 在铜诱导条件下表达 ,而 的转录表达则只发生在植物体中或在有植物寄主存在条件下 (,2002)。同一物种漆酶同系物基因在氨基酸水平上的同源性并不是很高 ,例如 5%),而 其它的 酶同系物的同源性则较低 ,仅为 52% 57%。 之间的同源性