【毕业学位论文】（Word原稿）木霉菌产生厚垣孢子相关基因的筛选与克隆微生物学硕士论文

密级： 论文 编 号： 中国农业 科 学院 硕士 学位论文 木霉菌 产 生厚垣孢子相关基因的筛 选 与克隆 of of I 摘 要 木霉菌是一种具有重要经济价值的丝状真菌 ，是一类分 布广泛的土壤习居菌，被认为是最有希望的生防因子。据统计， 在全世界 25 个国家和美国 43 个州的生物防治课题中，大约 34是有关木霉的研究，可见木霉菌在生物防治上具有 独特优势和研究价值。它的特点是对于生长环境具有广泛的适应性，可利用各种简单或复杂的碳源和氮源，木霉可产生多样的拮抗作用，产生抗生物质和溶菌酶类。目前利用木霉作为植物病害的生防真菌已有很多的报道， 但将木霉作为生物农药直接用于生产 ， 菌剂的保质期还存在一定的问题。生物制剂要求有一定的保质期，而影响菌剂保质期的主要因素是菌体类型。木霉制剂有两种类型，一种利用分生孢子另一种利用厚垣孢子。分生孢子产量大， 但存活期短，而 厚垣孢子 存活时间 长 ，保质期长，因此厚垣孢子制剂有其独特的优势。 目前对于厚垣孢子的研究多在于孢子的培养条件，对于厚垣孢子形成 的分子机制还知之甚少。为了研究这一问题，我们利用 纹技术 析了绿色木霉在特异产厚垣孢子的培养基中产生厚垣孢子和不产生厚垣孢子时基因表达的差异。采用了 96 对引物组合，分离到 48 个有差异的 段。通过 一步筛选出了五个阳性克隆。 果显示，其中五个片段（ 、 、 、 ） 都呈阳性反应， 和 在不产生厚垣孢子的时候表达量很少，但在产生厚垣孢子时表达量明显增加。 、 和 在不产生厚垣孢子时没有表达，而在产生厚垣孢子的时候有明显表达， 证明这五个片段与产生厚垣孢子有关。为进一步弄清这五条片段的结构，我们对它们进行了克隆和测序分析， 与哈氏木霉 60S 核糖体（ 因具有较高的同源性，与玉蜀黍赤霉 染色体 2 假定蛋白基因具有较高同源性， 的预 测产物与碱性 有较高同源性， 和 与已知基因同源性很低，可能代表新基因。 关键词 : 木霉菌 ， 异显示 ， 克隆 is an in of is in to of in of be as a of So or a a on on of is of In to it we to of in by 、 、 、 ) to of In to of we we is 0S to of is to to be 录 摘 要 . I . 文缩略表 . V 第一章 绪 论 . 1 霉菌研究进展 . 1 木霉菌在生防中的作用 . 1 木霉菌分子生物学研究进展 . 2 研究厚垣孢子萌发相关基因的方法 . 5 异显示技术 （ . 5 抑制性消减杂 交（ . 6 表性差异分析 . 7 基因表达系列分析技术 （ of . 7 转座子标签技术 . 8 增片段长度多态性技术（ . 8 术简介 . 8 术 的基本原理和方法 . 9 术的特点 . 9 术 的应用及发 展前景 . 10 生物 信息学的应用 . 11 生物信息学数据库 . 12 生物信息学在基因研究中的 应用 . 13 研究目的和意义 . 14 第二章 利用 术分析产生厚垣孢子相关基因 . 16 实验材料 . 16 实验方法 . 16 总 提取和 制备 . 17 析 . 18 聚丙烯酸胺凝胶中差异片段的回收 . 20 二 次 增 . 20 物 的纯 化 . 21 反向 交 . 21 交 . 22 特异片段的 连接、转化 . 24 阳性克隆的鉴定 菌液 测 . 25 序列测定 . 25 第三章 结果与分析 . 26 木霉菌丝的培养 . 26 木霉菌 丝总 提 取 . 26 双 链 合成 . 27 切 片段的预扩增 . 27 选择性扩增 . 27 差异条带回收 . 29 二 次 增 . 29 反 向 交 . 29 差异片段的克隆 . 30 组质粒 的 定 . 30 异片段的序列分析与比较 . 31 交 . 32 第四章 讨 论 . 33 木霉菌菌丝 总 提取方法 . 33 木霉菌 术中预扩增及选择性扩增条件的筛选 . 33 二次扩增结果 . 33 交 . 34 木霉菌厚垣孢子生成相关特 异 段序列分析 . 34 展望 . 35 第五章 全文结论 . 36 参考文献 . 37 致 谢 . 43 作者简历 . 44 附录：主要试剂配方 . 45 V 英文缩略表 英文全称 中文名称 脂糖 苄青霉素 菌培养用胰蛋白胨 菌培养用酵母提取物 冲液 互补 受态细胞 脱氧核苷三磷酸 二硫苏糖醇 焦炭酸二乙 酯 EB(溴化乙锭 表达序列标签 醛 油 异丙基硫代 养基 接酶 熔点琼脂糖 -(3-（ 磺酸 聚丙烯 酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 W=6000) 聚乙醇，分子量为 6000 粒 针 十二烷基硫酸钠 体 菌培养基 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 霉菌研究进展 木霉菌属半知菌亚门、 丝孢纲、丝孢目，常见于土壤中，是具有重要经济价值的一类真菌。早在 30 年代，人们就已经认 识到木霉菌对植物病原菌的拮抗作用。多年来，对于木霉菌的拮抗作用 做 了深入研究，并取得了令人鼓舞的成果。在发展持续农业 呼声 越来越高的今天，它作为一类资源丰富的拮抗微生物，在植物病害的生物防治中具有越来越重要的作用。 目前生产上常用的木霉菌剂多为孢子制剂，将木霉发酵制成的孢子制剂进行种子包衣或土壤处理，可以有效地防治苗期病害。以色列的 司开发的以哈茨木霉 株为发酵液的生防制剂（ 为 25可湿性粉剂，可以用于防治灰霉病、苗枯病、霜霉病和白粉病等叶部病害及果实在储存期的腐烂。由于木霉的孢子制剂多为活菌制剂，因此其田间应用常常受温度、湿度、雨水及化学农药等多种因素的干扰，田间实验性状表现极不稳定，这也是所有生防拮抗菌应用上的主要问题。随着现代生物技术的不断发展，生物化学和分子生物学水平上对木霉菌的生物防治机制进行研究和利用，必将有利于这一有益真菌的更好利用。 霉菌在生防中的作用 木霉菌对植物病原真菌的拮抗作用包含多种机制，一般认为有竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗 性、及协同拮抗作用。 1）竞争作用 木霉菌的竞争作用主要表现为对生存空间和营养的竞争。木霉菌的生命力强、生长快，能迅速占领空间，吸收营养。竞争是生物防治的重要方面。当两个或更多的微生物对同一资源有更多的要求时就会发生竞争作用。在生防因子之间的竞争中，如果拮抗物的生长导致了病菌种群或侵染源数量的减少，那么竞争将产生对病害的控制。另一方面，引入的生物因子和土著微生物区系的竞争将引入微生物的长期定殖困难。 作为土壤腐生菌，木霉菌在生物学上既可以定殖营养基质又可以在营养缺乏时产生厚垣孢子等休眠结构。木霉菌在营养存在 条件下开始生长，能快速定殖于基质或者利用抗生素或直接的重寄生作用与其他微生物竞争。木霉的快速生长、较高的产孢和利用营养基质的能力， 使其成为高效生防因子。木霉菌与病菌之间的竞争包括对坏死组织的竞争，对根际、叶际分泌物的竞争和对伤口的竞争。 2）寄生作用 木霉菌的寄生作用表现为重寄生现象，是木霉菌对病原菌的主要拮抗机制之一。它是通过木霉菌对病原菌的识别、接触、缠绕、穿透和寄生一系列连续的复杂过程。在木霉菌与病原菌互作的过程中，寄主菌丝分泌一些物质使木霉菌趋向寄主真菌生长，而一旦寄主被木霉菌寄生物所识别，就会建立 寄生关系，木霉菌丝沿寄主菌丝平行生长或螺旋状缠绕生长，并产生附着孢状分枝吸附于寄主菌丝上，通过分泌胞外酶溶解寄主细胞壁，穿透寄主菌丝，使病原菌菌丝的细胞质变稀薄、溶解或菌丝断裂，从而使病菌菌丝停止生长，吸收营养。有研究证明寄生现象的发生与寄中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 主真菌表面的特定外源凝结素的识别有关。胞外裂解酶类，如几丁质酶，在不同情况下的差异表达可以影响木霉菌对特定寄主所具有的拮抗能力，因此决定它的寄主范围。 3）抗生作用 木霉菌在代谢过程中产生拮抗性化学物质来毒害病原菌，这些物质包括抗生素和相关酶类，如：木霉菌素（ 绿胶霉素（ 绿木霉菌素（ 抗菌肽（ (徐同， 1996)。木霉菌产生挥发性乙醛对病原真菌具有抗性，哈茨木霉对立枯丝核菌防治机制之一是产生挥发性抗生素，主要成分为六戊烷基吡喃和戊烯基吡喃，具有椰子香味；从哈茨木霉和长枝木霉菌中分离纯化的抗菌肽分别为 些次生代谢产物为农用抗生素开发和利用提供了条件，但有些代谢产物性质不稳定，在一定条件下会转化为不具抗菌活性的化合物，如胶霉素在 某些酶作用下可转化为二甲基胶霉素而丧失活性。 4）诱导抗性 木霉菌的诱导抗性表现为能够诱导寄主植物的各部分组织对病原菌产生抗性。木霉菌的诱导抗性机制与寄生作用、抗生作用无直接关系。即使寄生作用和抗生作用两种机制缺陷的菌株仍可对寄主植株产生诱导作用。 已有研究表明，把哈茨木霉接种到黄瓜的根部，可诱导产生一系列的抗病相关蛋白，包括许多水解酶，其结果类似于用化学诱变剂（ 2， 6理使植物产生抗性。木霉对棉花立枯丝核菌的生防活性与其诱导棉花植株合成棉酚的含量有关。 1989 年发现，绿色木霉在以 聚糖或者天然植物细胞壁制备物为原始碳源的培养基中能够产生木聚糖酶；植物在木聚糖酶作用下，具有明显的防御反应， K+、 H+、 子通道打开，合成乙烯以及积累 5）协同拮抗作用 木霉菌的拮抗作用可能有二种或者三种生防机制同时或者按顺序起作用。 在 1988 年曾提出胶霉素和细胞降解酶协同作用模型，认为细胞壁降解酶的作用在于使毒素快速传递并且作用于原生质膜的特异位点，起到增效作用。 在 1993 年从哈茨木霉和终极腐霉（ 相互作用的培 养液中提取出胶霉素，发现如果每升培养液中增加 75丁质酶，可以减少 50%的胶霉素用量而起到同样的效果； 2000 年研究表明，木霉菌对病原菌的作用包括产生抗生素和重寄生作用。 目前对木霉菌生防机理的研究还远不够深入和细致，还有很多方面有待进一步研究证实。对木霉菌作用机制的进一步研究，将为基于木霉菌的生物农药制剂的商品化生产提供理论上的依据和直接的指导作用。这些制剂的应用极大地减少化学农药的使用量，在无公害粮食生产和改善生态环境方面发挥巨大作用。 霉菌分子生物学研究进展 八十年代以来， 木霉分子生物学研究取得重大进展。这不仅对木霉分类学、生态学、生理生化及遗传学是很大的促进，而且对木霉在工农业生产中的应用更有着直接的影响。 1）木霉基因克隆 木霉基因克隆采用的方法主要有以下几种。早期采用差异杂交法，分别用纤维素诱导条件下中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 和非诱导 条件下所提取的 备 针，与木霉基因文库进行杂交，选择那些与前者产生强烈杂交而与后者不杂交的菌落，从中筛选到纤维素酶基因。其他克隆基因的方法有：遗传互补法，利用具有相应营养缺陷型遗传背景的酵母菌作宿主筛选所需的酶基因；利用抗体的免疫筛选法；异源杂交 法，利用其他真核生物相关的基因片段为探针对木霉 库进行原位杂交筛选；反求遗传学法，由纯化的酶蛋白得出部分氨基酸序列，由此设计并合成寡聚核苷酸混合物作为探针从 库中筛选所需的酶基因。对于调控基因的分离，传统的方法在对设想的调节蛋白没有任何了解的情况下受限制很大。 1997 年 人发展了以酵母为基础的双载体克隆系统，以克隆木霉的纤维素调节基因，用此方法成功筛选到两个活性蛋白基因，此方法的原理不仅适用于分离真菌水解酶调节基因，也可应用于任何真核生物其他调节基因的分离。 在 木霉基因克隆中，对纤维素酶基因的研究比较充分。目前对于纤维素酶基因克隆的研究主要集中在真菌产生的酸性纤维素方面。由于木霉菌能产生大量的胞外纤维素酶，酶系较完全， 并且对结晶纤维素有较好的酶解活性，近十几年来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研究，并且都在 得 到了表达，并测定了这些基因的核苷酸序列。其中瑞氏木霉是研究最多 的木霉，已有八个纤维素酶基因得到克隆并测序，包括编码纤维二糖水解酶的 编码内切葡聚糖酶的 以及编码 酶的 它的类似物 目前已从丝状真菌中分离到 230 多个基因，已克隆的主要基因包括在表 1 中。 表 1 木霉菌属中已被克隆的相关基因 称 拉丁文 克隆基因 参考文献 哈茨木霉 T. et 002 哈茨木霉 T. et 996 哈茨木霉 T. 997 哈茨木霉 T et 000 哈茨木霉 T. et 000 康宁木霉 T. 令香等， 2001 里氏木霉 T. et 绿色木霉 T. et ）转化系统 目前木霉菌的转化系统中，多数是使用细菌质粒构 建的载体进行整合转化，自主型复制质粒应用范围较小。在聚乙二醇（ 氯化钙作用下，把目的基因或 过再生和选择获得转化子。 选用一个稳定的选择标记对建立木霉转化系统是非常必要的，木霉转化的选择标记包括营养缺陷型标记和显性标记两类。前者常用的如 或 后者常用的有 养缺陷型标记包括一些碳源、氮源和硫源的代谢基因，它们能与相应 的 营养缺陷型丝状真菌受体菌遗传互补，从而为转化子提供一种正选择方法。显性标记中 木霉菌不能合成此酶，因此将木霉菌涂布在以乙酰胺为唯一碳源或氨源的培养基上即可方便的筛选携带 用来自原核生物中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 的抗性标记必须在原核基因前连接一个真菌启动子序列。 营养缺陷型标记有可能引导载体治理整合染色体的同源部位，易于筛选，但作为受体的营养缺陷型的筛选比较困难，而抗性标记则避免了前者的缺点，但带来的环境生物安全问题值得探讨。 转化 多拷贝的重复形式在木霉基因组中存在，尽管木霉菌转化中有同源重组，但转化 合并不需要序列同源性，这是木霉菌转化不同于其他微生物转化的特点。同源重组和非同源重组，两者间的比例随受体菌株和转化载体而异。 源重组产生两种类型转化子，一种是在染色体基因组上带有目的基因连锁的重组，这是载体 同源重组常产生多位点、多拷贝的转化子，即在转化子 木霉菌遗传转化系统的建立为人们从基因水平研究木霉菌的遗传背景和进一步的菌株改造提供了条件，通过转化把外源基因导入木霉菌细胞，利用基因互补、基因破坏和 基因替换等原理克隆或表达目的基因、分析基因的表达调控机理乃至改造工业生产菌株。此方面的例子很多， 等 (1998) 克隆了 码驱动蛋白的基因 通过转化介导的同源重组造成 因的缺失，研究了驱动蛋白在细胞中的作用。 1990) 报道，通过基因定位置换整合使编码瑞氏木霉 果 再产生 I，另外还有一些关于瑞氏木酶的一个或几个纤维素酶基因经基因定位置换整合而失活的报导。 高压电泳冲 （ 在某些不适用 情况下木霉转化的替代方法。 克隆基因在转化子中的表达水平与多种因素如载体所用启动子及其它序列，克隆基因本身，目的基因整合位置，整入的拷贝数及受体菌株有关。 3）外源基因的表达 木霉具有良好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，同时还具有真核的分泌机制以及可能具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如高甘露糖型和 菌的以上优良性状极大地促进了对木霉的遗传改造，而构建木霉外源基因强表达系统是进行木霉分子生物学研究和进行遗传改 造的重要前提条件。哈茨木霉中表达的基因包括木质素过氧化酶基因 丁质酶基因，抗除草剂基因等。 1996）分离出哈茨木霉 用 主本身不产生几丁质酶，在转化子中，该酶表达比哈茨木霉提高了 20倍。根据这一结果，有可能将木霉菌不同胞壁降解酶基因在某种木霉菌株中均有高效表达，从而能够构建超级生防木霉菌。 4）重组蛋白的分泌 自然发生的菌株产生我们所需蛋白的水平很低，以至于不能在商业上加以利用。因此，为了得到所需的目的蛋白， 需要对出发菌株进行遗传改造。瑞氏木霉所产生的一种主要的纤维素酶 纤维二糖水解酶 I() ， 由单拷贝基因编码，其产量可达瑞氏木霉胞外分泌性蛋白总量的 50%。由此可见， 此在对瑞氏木霉的遗传改造中，常利用 利用 在木霉中已发展出多种分子系统， 采用不同的策略用于同源和异源蛋白的生产。为了提高产量，使用强表达和有效分泌的纤维素酶 被证 明是一种有效的方法。虽然在基因组的其它区段也可获得外源基因的有效表达，但 动子很强， 而且 点对于表中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 达似乎也是有益的。将外源蛋白融合到 连接区，能够恢复对高水平表达起重要作用的区段，如：翻译起始位点、信号肽序列及其作用位点。通过基因工程和发酵培养生产同源和异源蛋白，需要进一步地改进。对于不同的培养条件，包括含葡萄糖的培养基，应该发展出不同的生产策略。 5）结语 近年来木霉菌分子生物学的研究取得重大进展，有越来越多的基因得到克隆和表达。真核表达系统是近年来新兴的用于外源基因表 达的体系，它可以克服在原核表达系统中无法进行特定翻译后修饰的缺陷，已成为生产具有生物活性的真核生物蛋白的重要途径。虽然真核基因可以方便地克隆到原核系统中，但由于真核生物与原核生物之间存在差异，因此在原核生物中只能是 体外 研究。真核细胞具有很多原核细胞所没有的功能，如线粒体合成 成组蛋白和核小体的功能，可以进行减数分裂，能够分化等等。因此要想透彻地了解真核基因的功能就必须将其置于真核细胞的 体内 环境下。 分子生物学技术在木霉菌中的应用，使木霉菌的应用更加广泛，表明通过向分子水平的发展，将会加 快木霉菌广泛应用于工农业生产的进程。 研究厚垣孢子萌发相关基因的方法 生物的生长发育，组织和细胞的分化调亡及变异都与基因的差异表达有关，基因在时间和空间上的有序贯穿和调控了个体的整个生命过程。由此，分离和克隆差异表达基因不仅有利于阐明生命的奥秘，而且还为生物的改良和基因诊断奠定基础。过去 20 年，人们已经分离到了相当数量的与发育相关的基因。这主要借助于蛋白质产物的分离纯化，然后根据其氨基酸结构推算其相应的核甘酸序列，并据此合成寡核甘酸探针，最终从 库或基因组文库中筛选出目的基因。而未知其编码 产物的发育基因的分离克隆则是非常困难的工作，以前广泛应用的主要方法有 做图克隆法（ 差别筛选法（ 扣除杂交法（ 这些方法虽然都取得了一定的成功，但由于各自的缺陷性，而限制了他们更加广泛的应用。近年来，分离差异表达基因的技术不断发展与完善，出现了 增片段长度多态性技术（ 抑制性消减杂交（ 基因表达序列分析法（ 代表性序列差别分析技术（ 阵列等技术，目前这些方法已得到广泛应用，并已成功分离了许多差异表达的基因。 异显示技术（ 异显示技术（ 种将 转录技术与 术两者结合起来的 纹图谱技术。这种方法的基本原理是根据大多数真核细胞 3， 端具有多聚核甘酸尾 构，因此可