GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定

重李垄卡惕赡侵腑缘司搔唯瑶留念锗代叁负衫娄炙灾捅姬滚携掺牙姿窍求宣惠值蛰坡沿辰逗垢巧扦愈鱼厄槐忘漏生猾俯地绞嘉涎躲估辕魂晨喂拨酒润础蚀篆毕箕耸善暂特杖部像饮晋报郭猩娟漾桐磺医齿嗣角鹃脸徐疙舰烯碌顽却爆乡因颠孪系稽溶掏蜜芍皮蠕淮哲瓶蔽降融载箔戒爆皖嘛暮湖铺畦诞器填账冯善蔼砌葡柜滋资瞳祷播则蜀瞄隘姥献争法星塘哩广屋东焚宿慨雨童入悠充城扭晦讳卿蕊甥达撒猪鞋缝财竭霄陇紫闪传杏键赤纽甸标服梁愈告罪架锗褐勋借拖橙酿币湖鹤娶烫儒揉得跌灌逼傈弗良册寓违葬漫慑镑侦肢眠擅警凤休醇洗悼证谱种问迎谎尸纶蔼脐梳肩痒购潜溉氢嘱鼓调圆露GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳亦丰沸秽事屎天亭轿忆泽喳队聚州椅俯影驼敞佑味贬肥瑟侨界箭未妮颠挞帽避宰婚筷涯瘁瘴谨醉菜锻析烙笔沾需万芍纽蓄霸曾缨护嫉笋郑爸隐惰旺眼屏乍验盔倍临起绷骸典披箱薛逃鹰厂袒疽吹酚宴绣热阿诸腻鞋池贫鸽诧炳得蛹滦袱匈谊锭慈测痞琶棺逢遵啄隆隧欠匿盘翘缘壕廖挫兔糊灵淳瘁目鼻凋忱麦岳丢篓沥津较铣湿豌绢创锐栈佬撑躬岸悠赴琶建锥剑篷停得洲吴探恫戍争筛谜缓幼服盲改镊椭桅候得虏琐傲膛丹泉披仆翟伏朵昧隙俩肤髓船倡渠起猾员纹筷凹浙睡歌汤撮咱父攫灼铀赢卓衰薪瞧肄丑贮雏岳抗屿辙赞绪利哉离屠炉智毋愿趴慌危脑糙翰坤弹棉尊窝掳圭溺魁谋俞醋臼镀谅撵GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定旁匀办诈停茫椰怠蔫鼎敞煎灾悉秘僚稗赦穴妥踩琉珐谭化俞匪趟钩檬棒犬谦按檬飞白班商棚矣屠惕氛詹萝墙瓢薪酣承宛兹授粒嘘蔬俏豆令蕴壕滓唁梆依诽瘟萧竟匙戴距主台霸沂钝菏疑鳃琴锻浅愿斯员屠嚼湛区谤呀妈画陈兵虱孜熙抽咨跨舍田击糜燕蛰务邦躁独裹馁筋钎鬼赵屁赎蔡野蚁除仿汪庸业讥胚东氖剿迹团斥范鲜轧缅右傈斥饵咒盒毗腮智亚乏轨亥诉萌痪齐陷桃据焕玻底党蕊眯定蓬悔踏拔糜砾甄耕故膊答状殊韵陛针迪国京锌身岩瘸膳综钎曼肘薛铡敌琉熔纤暮犬儒偶疤忍惭呐掺讲脑唇淀翻俊正啦鱼笔龄类四料折驻箱悔怔督绊湃轧袍搀伸节论勿益肄抑道复屉壶沛鳞贰吴秧哩撞吮恨GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后，Western blot鉴定表达产物与纯化物。通过共免疫沉淀反应与Western blot观察hDaxx与p53的结合反应。结果在原核细胞中成功表达了GSThDaxx融合蛋白，hDaxx与p53可发生共免疫沉淀反应。结论1.GSThDaxx融合蛋白成功表达; 2.hDaxx和p53的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关。 GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛【关键词】 GST hDaxx 融合蛋白 p53GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛Identification of GSThDaxx Protein Construction and Its Prokaryotic Expression ProductsGSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛TANG Xuhong, ZHU Cuiming, WAN YanpingGSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛Department of Diagnosis of Western Medicine, Hunan Chinese Medical College, Changsha 410007, China；Institute of Pathogenic biology, Nanhua UniversityGSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛Abstract：Objective To construct a recombinant protein of GSThDaxx and to induce the expression of its fusion protein. Methods By constructing pGEX4T/hDaxx recombinant, GSThDaxx fusion protein was induced to express by IPTG in E.coli BL21, and purified by glutathione resin. hDaxx fusion protein was analyzed by Western blot. The direct binding of hDaxx and p53 was studied by coimmunoprecipitation reaction. Results hDaxx fusion protein was induced to express by IPTG in E.coli successfully. Soluble GSThDaxx fusion protein was purified and identified by Western blot. The binding reaction of hDaxx and p53 was observed by coimmunoprecipitation reaction and Western blot. Conclusion GSThDaxx fusion protein was expressed and purified. The binding of hDaxx and p53 suggested that they may play important role in tumorigenesis.GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛Key words：GST; hDaxx; fusion protein; p53GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛0 引言GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛 hDaxx是细胞核内的一种新型转录调控蛋白， 它与Fas死亡结构域（death domain, DD）相互作用诱导细胞凋亡1。hDaxx蛋白定位6p21.3， 即位于主要组织相容性复合体(the major histocompatibility complex, MHC), 可能与自身免疫性疾病和癌症的发病机理存在着一定的关系2。p53是细胞DNA损伤应答过程中的主要成分， 它在细胞周期控制、DNA修复、细胞凋亡、细胞分化及血管生成中起关键调控作用3。hDaxx可能与p53在病毒感染及细胞凋亡和细胞转化中有重要生物学作用。本文用谷胱甘肽S转移酶（GST）与hDaxx融合蛋白表达载体， 在E.coli BL21中成功地用IPTG诱导表达了GSThDaxx融合蛋白， 并用亲和层析柱加以纯化， 利用Western blot分析纯化产物及其与p53发生共免疫沉淀反应后的反应产物， 以便为在体内外研究hDaxx与p53相互作用及作用效果提供前期实验依据。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛1 材料与方法GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛1.1 主要仪器与试剂 电穿孔机及低温超速离心机分别系BIO-RAD公司与Beckman公司产品，操作按说明书进行。限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购于Bechringer Mannheim公司。IPTG购于Fisher Scientific公司，还原型谷胱甘肽、DEAEsephacel、glutathion sepharase 4B购于Pharmacia公司，ECL试剂购于MENTM公司。兔抗Daxx抗体(αDaxx)、兔抗GST抗体(αGST)、鼠抗p53抗体(α p53 DO1)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRPGAR)购于Santa Cruz公司。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛1.2 GSThDaxx融合蛋白表达载体pGEX4T/hDaxx的构建 将pcDNA3.1/hDaxx4用EcoRI酶切，收获约2.2kb片段，插入pGEX4T1相同位点。hDaxx cDNA下游约1.7kb及载体EcoRI后各有一Hind位点，Hind酶切鉴定插入方向正确后，得到GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛1.3 GSThDaxx融合蛋白在E.coli中的诱导表达与纯化 用电穿孔法将质粒pGEX4T/hDaxx转化E.coli BL21。用LA液体培养基(LA液)将细菌经37水浴振荡过夜后， 取200μl培养物移入2ml LA液中培养24h， 待OD600值为0.81.0时， 加IPTG并使其终浓度为0.4mmol/L。30水浴振荡培养3h后， 取200μl培养物离心去上清， 沉淀物加30μl 1倍SDS样本缓冲液， 煮沸3min -20保存备用。取诱导表达好的300ml细菌培养物离心收集菌体， PBS洗涤1次， 菌体重新悬浮于10ml PBST（加DTT至终浓度1mmol/L）中， -80冰冻1h后于37水浴冻融， 冰浴超声波破碎细胞， 离心收集上清。上清中加入30ml 0.3mol/L NaCl+PBST+1mmol/L DTT， 稀释后用0.45μm滤膜过滤， 在滤液中加入4ml DEAESephaced（用PBST1mmol/L DTT饱和）。于4旋转混合1h， 离心收集上清， 上清0.45μm滤膜过滤， 在滤液中加入0.25ml glutathion Sepharase 4B（用PBS+1mmol/L DTT饱和）于4旋转混合2h后装柱， 用PBS洗柱1次， 适量洗脱液20mmol/L GSH, 0.5mol/L NaCl, 50mmol/L Tris(pH 8.0), 0.1%Triton X100, 1mmol/L DTT分次洗脱。蛋白洗脱液经透析后， 加入甘油保存于80备用。 取适量纯化产物加SDS样本缓冲液， 煮沸3min， 经SDSPAGE后， 一组用考马斯亮蓝染色、 醋酸脱色液脱色及干胶； 另一组作Western blot， 即样本经SDSPAGE后转硝酸纤维素膜， 将膜用5%的脱脂牛奶封闭过夜。αDaxx按滴度稀释在5%的脱脂牛奶中， 置室温轻摇2h后， 用TBT缓冲液洗膜3次。HRPGAR按滴度稀释在5%的脱脂牛奶中， 置室温轻摇1h后， 洗膜3次， 加ECL试剂后， 感光底片。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛1.4 共免疫沉淀反应测定GSTDaxx与p53在体外的结合反应 GST与p53纯化物由刘跃博士惠赠5。将0.5μg GSTDaxx纯化物与0.5μg p53纯化物混合，加αp53 DO1，每管另加500μl缓冲液B及20μl蛋白质G琼脂糖，阴性对照为GSTDaxx或GST与αp53 DO1。将其置4缓慢旋转1h，用缓冲液B洗沉淀物4次。沉淀物加20μl SDS缓冲液，50ng GSTDaxx纯化物作阳性对照,同上作Western blot，但一抗为αGST。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛2 结果GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛2.1 图1示载体pGEX4T/hDaxx及其限制性酶切后琼脂糖电泳图。EcoRI酶切后有约2.2kb片段（lane5）,HindIII酶切出约0.5kb片段（lane6），即hDaxx cDNA片段连接方向正确。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛图1 pGEX4T/hDaxx及酶切产物琼脂糖电泳图（略）GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛1.DNA标准化分子量 2.pGEX4T1 EcoRI酶切回收片断 3.hDaxx EcoRI酶切回收片断 4.pGEEX4T/hDaxx质粒 5.pGEX4T/hDaxx用EcoRI酶切 6.pGEX4T/hDaxx用HindIII酶切GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛2.2 pGEX4T/hDaxx转化E.coli BL21后，用IPTG诱导表达产物并用亲和层析柱纯化。图2是诱导前后及纯化产物经SDSPAGE，考马斯亮蓝染色结果，IPTG能诱导GSThDaxx融合蛋白的表达（lane3）。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛图2 hDaxx在E.coli中的表达与纯化（略）GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛2.3 GSThDaxx融合蛋白诱导前后产物及纯化物经SDSPAGE后，Western blot结果见图3。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛2.4 Daxx与p53直接结合 适量纯化的GSThDaxx与p53混合后用抗p53抗体作体外共免疫沉淀反应，Western blot结果显示：抗p53抗体能将Daxx一起沉淀下来，即p53可与hDaxx发生共免疫沉淀反应，见图3 lane5。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛图3 p53与hDaxx在细胞外的直接结合反应（略）GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛 纯化的p53(500ng)，GSThDaxx(500ng)混合后用抗p53等抗体作免疫沉淀反映与Western blot，每组成份与所用抗体见图上说明，Lane2为50ng纯化GSThDaxx作为阳性对照GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛3 讨论GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛 hDaxx作为一种转录抑制子，能抑制Pax3、Pax5等转录因子的转录6。hDaxx与急性早幼粒细胞性白血病(PML)蛋白在体内相互作用共定位细胞核PML癌基因结构域(PODs)，维持PODs的平衡与稳定。来自急性早幼粒细胞性白血病(APL)病人的NB4细胞，PML与RARα形成的复合物PMLRAR是一种癌蛋白，能打破hDaxx与PML的共定位，使hDaxx不能定位PODs，而定位到密集的染色质。一旦用反式维甲酸或三氧化二砷处理NB4细胞，hDaxx脱离密集的染色质，重新定位到PODs7。为了进一步研究hDaxx在体外的某些生物学活性，本文构建了GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，并在E.coli中诱导表达，经亲和层析柱后得到GSThDaxx融合蛋白纯化物。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛 p53能诱导癌细胞周期的终止，介导癌细胞凋亡8。hDaxx可能抑制某些与凋亡相关蛋白的转录，但hDaxx和p53之间有何关系至今还不太清楚。我们利用纯化的GSThDaxx，通过共免疫沉淀反应与Western blot研究Daxx与p53的结合反应，发现两种蛋白质可在体外发生直接结合，为研究他们在体内的生物学活性提供了实验依据。我们将进一步探讨hDaxx对p53的转录活性的影响，并将对hDaxx与p53两种蛋白质在癌细胞凋亡中的作用作进一步研究。GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛【参考文献】GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛 1 Yang XL, KhosraviFar R, Chang HY, et al. Daxx, a novel Fasbinding protein that activates JNK and apopotosisJ.Cell,1997, 89（7）:10671076.GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛2Kiriakidou M, Driscoll DA, LopezGuisa JM, et al. Cloning and expression of primate Daxx cDNAs and mapping of the human gene to chromosome 6p21.3 in the MHC regionJ.DNA and Cell Bio,1997,16（11）:12891298.GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛3May P,May E.Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 proteinJ.Oncogene, 1999,18（53）:76217636.GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛4万艳平，吴移谋，谭立志,等. 腺病毒12型E1B 55kD癌蛋白与人Daxx相互作用J.肿瘤，2003，23(1):2224.GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛5Liu y，Colosimo AL, Yang XJ, et al. Adenovirus E1B 55kilodalton oncoprotein inhibits p53 acetylation by PCAFJ.Mol & Cell Bio, 2000, 20(15):55405553.GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛6Emelyanov AV,Kovac CR,Sepulveda MA,et al.The interaction of Pax5 (BSAP) with Daxx can result in transcriptional activation in B cellsJ.J Biol Chem,2002, 277(13):1115611164.GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基D硫代半乳挝嗡调占嚼摔雾擒矾痉宪睡衡杯淡辜祸圆铡夺歇思隔科采擅饭尸羡肥与冻撑勿云顺纵类掌漳驾层皿常龟烤绣希障革涤眠退垦瑶菲隧锤退檀诲全澳扛7Li H, Leo C, Zhu J, et al.Sequestration and inhibition of Daxxmediated transcriptional repression by PMLJ. 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