原核表达及蛋白质的纯化.doc

原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g（低盐LB为5g），溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基：按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时（一般为不烫手即可），在无菌状态加入抗生素（3g/200ml）并铺平板，冷却凝固后放入4备用4.IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20，这时配好的IPTG浓度为0.8m/mL。5.氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）： 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20贮存。常以25ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。6.卡那霉素（carbenicillin）（50mg/ml）： 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20贮存。常以25ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。7.考马斯亮兰染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中 ，量取250mL的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。加入650mL的去离子水，均匀搅拌。用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。8.考马斯亮兰脱色液：量取下列溶液，醋酸（冰乙酸）45mL；甲醇50mL；dH2O 10mL,充分混合后使用。9.10%过滤酸铵 ：把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 保存数周。10. 5Tris-GlycineBuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）配制方法 ：称取下列试剂，置于1L烧杯中。 Tris 15.1g；Glycine94g ；SDS 5.0g；加入约800mL的去离子水，搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。二 实验原理大肠杆菌是重要的原核表达体系,在重组基因转化入大肠杆菌菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE以检测表达蛋白质。实验室常采用异丙基硫代-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达，不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。三 操作程序及结果判定（一）构建重组表达载体1、载体酶切：将原核表达载体（例如：pET-28a）用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收所需要的载体大片段。2、PCR产物双酶切后经DNA纯化与回收试剂盒（或者切胶回收）回收后，同样在用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收所需要的片段。注：一般需要先连T载体克隆增值，然后再连原核表达载体。（二）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5，根据重组载体的标志（抗Amp或kan）作筛选，挑取单斑，用小提试剂盒抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架（有无因为碱基的缺失所造成的移码），如果均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞（如BL21）。（三）诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至5ml低盐LB液体培养基中含Amp或kan中37过夜培养。注：A.同时做空载体（如pET28a）的诱导作为对照;本实验室常用的Amp或Kan，若为A100（100mg/ml）的话5mL LB加5微升，若为K50（50mg/ml）的话5mL LB也加入5微升。B.接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。2、按1100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100ml高盐LB液体培养基的250ml培养瓶中（最好是500ml，以免转速太高碰到瓶口造成污染），37震荡培养至OD600 0.4-1.0（最好0.6，一般大约需2-3h，不同菌体时间不同）。3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.8mM（IPTG:液体培养基=1：1000，即100ml培养基加入100微升）作为实验组，两组继续在37中震荡培养3h.4h.5h.6h。4、分别取菌体1ml，离心12000rpm1min或8000rpm6min收获沉淀（即菌体），用40微升灭菌水重悬沉淀，加入本实验室常用的5sds-londing buffer 10微升混匀，沸水煮5min。注：煮样品的时候要时刻关注样品的情况，以免EP管压力太高导致样品喷出来。5、剩余的样品（若用100ml的LB的话，这时剩余大约95ml左右），然后离心12000rpm1min，用10ml灭菌水重悬菌体，用低温超高压细胞破碎仪或超声破碎破碎重悬的菌体，然后412000rpm10min ，上清倒入另一管中，沉淀用同样含量的灭菌水（按照上面的量加的话，也为10mL）重悬，然后分别取40微升，加入本实验室常用的5sds-londing buffer 10微升混匀，沸水煮5min，做SDS-PAGE等分析。注：A.与超声波相比，低温超高压连续流细胞破碎仪的优点有：保持细胞活性（4-6的环境），省时，样品损失少，可以处理大量样品。不同菌体的破碎最适压力是不同的，例如：一般大肠杆菌的破碎压力为1000mpa，超过这个压力的话也许会对蛋白的活性有影响，如果用低温超高压连续流细胞破碎仪破碎完之后离心时没有沉淀，说明破碎之后的核酸太多，太粘了，可以用超声在冰水的环境下连续破碎15S即可。但是当破碎的样品量小于5ml时，用超声比较合适，因为低温超高压连续流细胞破碎仪会有部分损失，也许破碎之后样品就没了，超声破碎时一定要置于冰水混合物（比冰更利于散热）中，而且一般破1min停3min（菌体不同，时间不同，自己摸索），超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经2-3 次冻溶后更容易破碎。在破碎暂停的过程中晃动盛样品的容器以利于散热，破碎直至菌体变清亮即可，有时如果蛋白以包涵体的形式表达的话，是很难变清亮的，这个就需要大家摸索条件了。B.如果对蛋白的活性要求较高的话，而且确定蛋白是以可溶性的形式表达的话，可以考虑默克Novagen的Buster蛋白抽提试剂用于温和破坏大肠杆菌细胞壁以释放活性蛋白或者qiagen公司的蛋白抽提试剂，具体查阅以上公司的资料。C在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及诱导空白载体（例如pET-28a）和不诱导重组载体2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果,。Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；诱导空白载体负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而不诱导重组载体负对照则有助于判断诱导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰。D.SDS-PAGE的点样顺序：如果按照上面的操作做的话，点样顺序分别为marker，诱导空白载体，不诱导重组载体，3，4，5，6四个时间点（一般是这样的，不同的重组表达质粒有时不同，需要大家查阅相关文献），上清，包涵体一共9个样，本实验室的梳子有些问题，最后一个孔有时会漏，大家点样时注意一下，尽量把那个孔点成2sds-londing上样缓冲液。如果蛋白较大的话可以跑的时间长一点，跑出来的效果较好，如果较小的话，例如10Kda左右，应该用大浓度的胶（如15%或者更大浓度），最好用预染的marker能看清条带的位置,这个是相对于小蛋白来说的，大蛋白没必要。E如果用新配置的考马斯亮兰染液的话染1小时即可，反复用过的染液最好染过夜,四 注意事项1、 选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达（His或GST等标签）；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2、 融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，应对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。3、 选择表达载体的原则蛋白质是否需要保留活性：有活性的以可溶性蛋白表达（胞质蛋白），无活性的以不溶性形式的蛋白（包涵体蛋白），可以通过加标签促进其以融合蛋白的形式表达。4、 选择表达宿主首先要看靶基因中有没有细菌不常用的密码子如果有，需要考虑换表达菌株。每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。以Novagen为例，如果使用BL21(DE3)表达不成功的话可以换Rosetta系列菌株，Rosetta 2系列就是一个好的选择这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。 5、 关于表达不出来的原因有很多A.那就是先查查表达外源片段中含有什么内切酶位点，不要设计重了，否则酶切时发现怎么老是有预期外的小片段出现。B.如果载体上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，如果中间含有载体序列，务必确定中间这段序列不会造成你外源序列的移码。按情况需要，可以加1到2个碱基在引物中使读码框正确。有始有终，同样正常的终止密码子才能保证蛋白的产出。大部分载体也有终止密码子，如果你对载体的不放心，也可以在引物中设计上终止密码子，这样万无一失。C.看看是否有移码的情况出现，看看稀有密码子情况，因为有时你的目的蛋白表达丰度过低，SDS-PAGE检测不到可以用亲和层析等办法富集你的目的蛋白，然后再跑胶。D. 由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。6.提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是优化IPTG浓度与温度，IPTG浓度0.2-0.5mM （可以做个梯度从0.1,0.2,0.4,0.8,1,1.5,2）IPTG足够了，不会降低表达量，反而会增加蛋白的可溶性。IPTG浓度过高，易使蛋白表达速度增大，来不及正确折叠而产生不溶性蛋白（包涵体）。温度：一般37诱导3-4小时，30诱导6小时是蛋白表达的最大产量期。22、18、16等低温诱导时间在12h-48h。低温诱导可使蛋白缓慢合成，利于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白。为了得到更多的可溶性蛋白，可以考虑将温度再降（但表达总量会有所降低），可以考虑25，诱导8-10个小时；20诱导14-18个小时；甚至1524-36小时诱导。7.重组质粒和菌株的保存建议在实验室里保存重组菌株的时候，为了挑菌和传代方便，我们常用LB平板保存在4冰箱中，需要提质粒和表达接种的时候，就直接从平板上挑菌，但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利，容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议：A. 长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油70保种。但是要注意高浓度甘油( 10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8。（15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行） B.重组质粒不宜长期保存于表达菌株（带DE3的大肠杆菌）中，请尽量使用带有recA endA突变的克隆菌株（比如C600，DH5a）进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。8.蛋白表达出来了，但是跑SDS-PAGE时大小不符？进行SDS-PAGE的时候蛋白的净电荷会影响迁移率。带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。如果蛋白的等电点在5到9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。我们前面提到过，在很特殊的情况下稀有密码子的问题也会造成表达产物的截短，应加以考虑。可能会相差10kDa左右9.本实验室的优化步骤：如果在37表达且是上清的话，只需优化一下IPTG的浓度以及诱导时间。如果是包涵体的话，但是需要在上清中表达提高活性的话，可以换载体，例如：PGEX-KG能更好的以可溶形式表达蛋白;还可以通过低温诱导，例如：18诱导过夜，而且IPTG浓度要降低（因为对菌体细胞有毒性影响，诱导时间长影响蛋白表达量），可以在5mlLB中加入1.5微升IPTG，以此相对应的浓度计算，确定它是否可以以可溶性的形式表达，然后再优化IPTG浓度以及诱导时间,一般是8h，12h，16h，20h，24h，IPTG浓度可以从0.05mM,0.1mM,0.25mM,0.5mM,1mM,2mM,做梯度，以此摸索条件提高表达量。原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之二蛋白质的提取与纯化一 实验材料（一）.Buffer A配方： 1LTris-base 50mM 0.05121.4=6.07gEDTA 0.5mM 0.0005372.24=0.1861gNaCl 50mM 0.0558.44=2.922g甘油 5% 50MLDTT 5mM (本实验室的操作方法是不直接加到Buffer A中，而是单独配，用另外加)。Buffer A一般置于4保存（二）.DTT(0.5M/L) 0.5154.25=77.125g/L,可长期放置与-20中（三）.的（十二烷基肌氨酸钠）：20g/100mL，最好现用现配（四）.氧化型谷胱甘肽：0.03g/mL，最好现用现配（五）.还原型谷胱甘肽：0.03g/mL，最好现用现配（六）.10TE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA配制量：1 L 配制方法： 1. 量取下列溶液，置于1 L烧杯中。1M TrisHCl Buffer（PH7.4，7.6，8.0） 100ml 500mM EDTA(PH8.0) 20ml 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌。 4. 室温保存。1)1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度：1 M Tris-HCl配制量：1 L 配制方法： 1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。PH值 浓HCl 7.4 约70ml 7.6 约60ml 8.0 约42ml 4. 将溶液定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2）0.5 M EDTA(pH8.0)组份浓度：0.5 M EDTA配制量：1 L 配制方法：称取186.1 g Na2EDTA2H2O，置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌。 3. 用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH)。 注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1 L。 5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。 6. 室温保存。 3)1.5 M Tris-HCl (pH8.8)组份浓度：1.5 M Tris-HCl配制量：1 L 配制方法： 1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。 4. 将溶液定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1，溶液的pH值大约降低0.03个单位。（七）1PBS Buffer组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配制量：1 L 配制方法： 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.42g KH2PO4 0.27g 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1 L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。 二实验原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固 定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通 过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析 柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。三操作程序及结果判定（一）本实验室所用的不溶性包涵体的提取方法：1诱导200mL菌体，4 12000rpm离心1min集菌，然后用PBS洗涤菌体2-3次，用Buffer A（一般用1/10体积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 12000rpm离心20min，弃上清 用洗涤沉淀次 往沉淀中加ml Buffer A以及19.7ul的DTT(如果是按照上述方法配置的话)及ml的（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置分钟至小时（本实验室一般4放过夜） 12000rpm离心20 min，取上清 加ul至终浓度为，加mM（0.03g/mL）的氧化型谷胱甘肽ul至终浓度为mM,加100mM（0.03g/mL）的还原型谷胱甘肽ul至终浓度为mM,静置分钟至小时（亦可复性过夜） 以1（pH8.0)透析72小时，取出分装后8保存备用 注：A.第一天透析时换液次数多一些，大概换5次左右，后面两天的次数可减少，早中晚各一次。用完之后的透析袋浸泡在20%的无水乙醇中，用时要检查她是否有液体的渗出，沸水煮5min即可，冷却后加样，加样时要带手套，防止手上油脂堵塞透析袋的孔，影响效果。B.在透析时蛋白浓度太高的话，在透析的过程中会有蛋白的析出，建议在加到透析袋之前做等量体积的稀释，在透析之后可以用蔗糖处理，即把透析袋平铺于一干净的容器中，在上下两面均用蔗糖铺盖，一般在2-3小时左右即可浓缩到一半体积，这个需要本人自行处理决定，但也不能透析时间太长，以免浓度太高，蛋白沾到透析袋上浪费。C.分装时如果蛋白较多的话，可以先用500微升EP管，每管装200微升左右，装10-20管左右，其他的用1.5ml的EPN管每管儿装1ml，避免浪费，而且蛋白反复冻融对其自身的活性影响很大。（二）本实验室纯化GST标签蛋白的方法1. Glutathione Sepharose 4B胶的预处理：A.取1.33mLGlutathione Sepharose 4B胶原液，1800rpm,5min离心去上清B. 加入10 mL 1PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B胶悬浮于溶液中，1800 rpm，5min离心弃上清C.加入1mL1PBS重悬，即可得50%的Glutathione Sepharose 4B胶2.洗脱液：0.154g还原性谷胱甘肽溶解于50mL 50mmol/LTris-Hcl中，现配用 50mmol/L Tris-Hcl：0.606g Tris-base溶解于足量的蒸馏水中，调节pH值至8.0后，再加蒸馏水定容至100mL3.诱导200mL菌体，4 12000rpm 1min集菌，然后PBS洗涤诱导后菌体2-3次，1PBS（一般用1/10体积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm，20min离心取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的Glutathione Sepharose 4B胶（一般20ml上清对应1ml胶），室温摇床轻轻晃动令其吸附蛋白1 h；4. 2000 rpm，5min离心弃上清；5. 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B胶悬浮于溶液中，2000rpm，5min离心弃上清；6. 重复步骤5两次；7. 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min；8. 2000 rpm，5 min离心，收集上清；9. 重复步骤7-8至少两次；10. SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，紫外分光光度计检测蛋白浓度；11. 将蛋白分装置于-80保存。（三）本实验室纯化HIS标签蛋白的方法下面是KTApurifier全自动层析仪操作规程，与本实验室的KTApurifier仪器型号稍有差别，但基本上大同小异，可做参考。仪器放于F109 ELISA工作站的房间中。AKATA全自动层析仪蛋白纯化步骤首先是所有溶液都得过滤，超声波破碎(主要是去除溶液中的气泡)；开机(仪器自检)，点开Unicorn ，选 default ,ok (即出现流程图界面)；首先将A.B探头都放入20%乙醇中；Mannul，点任意选项，出现操作对话框；Pump-flow=1.0 ，execute，(注意：必须先设定流速，使其形成通路；即有流速时再作其他操作)。柱压基本稳定时，洗泵：pump-pump wash purifier-A ON，B ON execute；这项仪器自动完成；完成后自动恢复为上一步的状态；一般要平稳几个柱体积，即用乙醇洗20-30ml体积，直至平衡； 待平衡时换液（换液时要用蒸馏水洗A .B探头）：pause，A-A液B-B液，continue，然后达到平衡态；再洗泵：pump-pump wash purifier-A ONB ON execute；此时A泵走A液，B泵走B液；待稳定下来（平衡时）准备上样：将A探头放入样品中，并将流速降下来，flow=0.5，execute； 样品上完后，洗脱。准备接收纯化出的蛋白，改流速flow=1.0 ，gradient，10%B，Execute，然后依次30%B,50%B,100%B（可以根据洗脱情况自行调节）;首先出现的是杂蛋白的峰，可以接收。一般第二个峰是目的蛋白。等峰值开始降下来的时候还可以接，降到线平衡时不再接收，走平时要洗脱15-20ml左右（线走平）才可以调节洗脱缓冲液B的浓度；最后走B液（100%浓度），冲洗整个体系；之后，pause，冲洗A.B探头，将A,B液换为20%乙醇，continue，洗系统，洗泵，步骤同上；洗好后（线平衡），-end，摘下镍柱；关闭所有窗口，关机。8. 实验室常用的蛋白纯化试剂配方：A.母液：29.22g NacL与2.422g Tris-base加入到蒸馏水中，定容至1LB.Binding buffer：常用5mM(如果纯化之后的蛋白杂带较多，可以做一个5-40mM的梯度实验，降低非特异性吸附),在母液中加入0.1702g咪唑，调pH到7.9并定容至500mLCElution buffer：常用500mM，在母液中加入17.02g咪唑，调pH到7.9并定容至500mL注：一般情况下，Binding buffer的用量较大，可适当调节两者的体积比例。四注意事项1.跑胶之后的一些注意事项：a) 胶跑完之后的玻璃板一定要洗干净，而且不要沾到一块，凝固之后很难分离下来，分开放置。b) 放30%聚丙烯酰胺的那成冰箱最好不要放其他东西。c) 配完胶的地方清理赶紧。2. 下面我列举一些从实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考：A. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸等等；B. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；C. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价Ni被还原；D. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；E. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解（也可以不加，一般是不会发生降解的）；F. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）G. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；H. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；I. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）以及SKL等J.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之三浓度测定一实验材料紫外分光光度计2 实验原理应用液体的表面张力特性，样品体积只需要0.5-2ul，在侦测台上，经上下臂的接触拉出固定的光径达到快速、微量、高浓度、免石英管、免毛细管等耗材侦测吸收值的优点。3 操作程序及结果判定在主画面点选Protein A280，计算机与仪器自动完成联机。先用灭菌水清洗侦测台5-6次，最后一次点OK确定，依照Pro所溶于之液体准备该溶液（务必确认Pro是溶于水.buffer A或Elution buffer）取出2ul点在侦测台上，放下上臂后再按Blank。将样品混匀，取出2ul点在侦测台上，放下上臂后再按Measure。四注意事项1、侦测后立即使用卫生纸擦拭台面。2、同一滴液体只能做一次侦测，欲重复定量同一样品，请擦掉前一滴，重新取出一滴进行侦测。3、基本上核酸样品可使用1-2ul 做测量，随各液体体积特性之