孕妇血清标记物在唐氏筛查中的应用和研究进展

孕妇血清标记物在唐氏筛查中的应用和研究进展章 静【摘要】唐氏综合征是人类常见的染色体疾病，由于其发生率高，是导致出生缺陷最常见的原因，且没有办法治愈，因此，如何及早进行产前筛查和诊断以期及早终止妊娠，避免先天愚型患儿的出生就显得极为重要。本文对近年来唐氏筛查的实验室检验项目和筛查方案以及质量控制进行综述。【关键词】唐氏综合征 筛查 检出率 质量控制 唐氏综合征（Downs syndrome,DS）又称为21-三体综合征或先天愚型，是由于21号染色体异常引起的常染色体病，新生儿发病率在 1/ 700-1/8009。而2/ 3由于胎儿在孕早期自发流产，故实际发病率远远高于这个数字。由于该病尚缺乏有效的治疗手段,在妊娠早期或中期进行唐氏筛查，及早发现高危妊娠并进行产前诊断可以大大降低唐氏综合征的发病率。本文列举了在孕早期和孕中期的筛查标记物和联合筛查在临床上的应用，并对影响筛查质控的各种因素进行综述。1 唐氏筛查的效果评价指标唐氏筛查指标或方案的评价，通常采用中位数值的倍数（MOM）、检出率、精密度、假阳性率、假阴性率、阳性预测值和阴性预测值为指标1。任何标记物的值都可以用MOM值表示，它由标记物的测量值除以相同实验室测定的同样孕周正常孕妇的中位数值得来。采用MOM值使不同实验室测量值之间的系统误差得到补偿；检出率（DR）升高的同时，通常伴随着高假阳性率，卫生部2010年发布的胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准1（以下简称标准）中规定，假阳性率控制在5%时比较不同试验的检出率；筛查试验的阳性预测值为筛查阳性病例中的真阳性率，与发病率正相关，发病率越高，阳性预测值也越高。唐筛的阳性预测值应在0.5%之内；精密度以变异系数CV%为代表，批内CV%3%，批间5%。2 唐氏筛查的孕妇血清标记物2.1 妊娠相关血浆蛋白A（PAPP-A）PAPP-A是一种球蛋白，1974年由Lin等首次描述。是来源于胎盘的一种糖蛋白，是早孕期唐氏筛查的血清学敏感指标，是当前早孕期血清学筛查首选指标，健康孕妇体内PAPP-A浓度随着孕期的增加而不断升高直到临产，在异常妊娠早期其中位数较低，在中期妊娠时较正常者无差异，PAPP-A值偏低是唐氏综合征妊娠孕早期（孕10-13周）指标，2005年，美国FASTER(First And Second Trimester Evaluation of Risk for Aneuploidy 早中孕期风险评估 )研究队列报道2，单用PAPP-A进行孕早期唐筛，在假阳性率5%情况下，检出率可达37-51%，MOM值在0.42-0.53之间。2008年，香港李之朋5等人报道，妊娠11-14周，PAPP-A结合母体年龄，在假阳性率5%情况下，检出率可达52%。2.2 游离-人类绒毛膜促性腺激素（F-hCG）绒毛膜促性腺激素（hCG）是胎盘滋养层分泌的一种糖蛋白，由和亚基组成。F -hCG 占总HCG的1%-8%，在早孕期筛查较HCG好，在中孕期两者的筛查效果接近。-hCG对染色体异常较为敏感。钟萍等7-10认为-hCG唐氏筛查时升高50%，对13、18三体综合征也很敏感，FASTER认为，单用F -hCG进行孕早期唐筛，假阳性率5%时，检出率可达22-29%，MOM值在1.89-2.23之间2。国内很多大样本研究也肯定血清-hCG是诊断三体性胎儿的有效指标，也是目前出现的唯一一个在早孕期和中孕期筛选唐氏综合征都有特异性的血清标志物。2.3 甲胎蛋白（AFP）AFP血清标记物用于产前筛查最早开始于1974年，当时发现孕中期母血AFP升高与胎儿神经管缺损（NTD）的发生有关，AFP过低与唐氏综合征（DS）的发生关系密切。 AFP主要在胎儿肝脏和卵黄囊中形成，孕早期即可测出母血中的AFP，孕1420周AFP浓度呈线性增高，20周后渐渐下降，故母血清和胎儿羊水中AFP都在孕中期（孕14-20周）测定。但是华北煤炭医学院左振伟14等人却有不同观点，认为胎儿肝细胞合成的AFP在孕16周左右才可以在母血中测出，F -hCG在孕20周时稳定，故不建议将唐氏筛查的时间提早至孕14周。在怀有唐氏综合征患儿的孕妇在孕中期其血清AFP浓度平均下降了25%。关于胎儿染色体异常引起AFP下降的确切原因尚不清楚，可能是由于这类胎儿发育不成熟，合成和分泌AFP的能力下降所致。FASTER认为孕中期受累妊娠AFP的MOM值中位数AFP为0.74（95%可信区间为0.67-0.82），在假阳性率为5% 时检出率为33 36. 9%。可见，虽然AFP是最早用于DS筛查的血清指标，但其筛查效果并不理想。 2.4 游离雌三醇（uE3）游离雌三醇（uE3）是胎盘来源的一种类固醇激素，在母体血清中，雌三醇即可以以游离形式存在，也可以以共价物形式存在。雌三醇循环半衰期为20-30分钟，因此，E3可以快速地反映由胎盘生成的雌三醇的变化。正常妊娠的时候，E3升高直到临产。但是，孕母血清中雌三醇的浓度容易受到肝肠循环的影响，uE3占总雌三醇的9%，它能更好的反映胎盘功能。受唐氏综合征影响的孕妇血清uE3明显降低30%，uE3变化的机制不清楚，推测可能是由于患儿部分或全部脏器不成熟所致2,3。FASTER认为孕中期受累妊娠的uE3的MOM值中位数AFP为0.61（95%可信区间为0.55-0.67），当假阳性率为5%时，其检出率为41%2。uE3在孕中期变化最大，故必须正确核对孕周。2.5 抑制素-A(Inhibin-A)抑制素-A是卵巢分泌的一种蛋白，可选择性的抑制垂体促卵泡刺激素（FSH）的分泌，也可以监测孕母的卵巢功能。在DS孕中期时，抑制素-A可以升高2倍以上。英国的SURUSS（Serum Urine and Ultrasound Screening Study 血清尿液和超声筛查研究）研究机构认为3，抑制素-A主要用于孕中期筛查。单独检测孕中期母血Inhibin-A水平对DS 筛查的检出率为62%。 它加盟DS筛查后使得检出率提高了10%，而假阳性率不增加。因此，抑制素-A常常用在血清四联筛查（AFPF -hCGuE3，抑制素-A）时， FASTER认为，假阳性率5%时，孕中期四联筛查检出率可达86%。2.6 新的血清标记物2.6.1去整合素金属蛋白酶-12（ADAM-12）ADAM-12是一种新的孕早期标记物，它是一种解离素与非金属蛋白酶，仅在妊娠期母血中检测到。孕母血中ADAM-12自8到10周开始出现，并随着孕周的进展而增加。在母体血清中稳定存在并在DS 时降低，ADAM12在孕早期筛查中有一定的意义。2010年，浙江大学医学院妇产科13研究认为它的MOM值中位数AFP为0.14（95%可信区间为0.01-0.76），单用ADAM-12结合母体年龄筛查DS，在假阳性率2%情况下，检出率可达82%，孕早期ADAM12 和PAPP-A 双联筛查DS的检出率可达91%。2.6.2 妊娠特异性蛋白（SP1）SP1由合体滋养层分泌，大约受精后10天即可出现在母血中，随妊娠的进行而上升。可存在羊水、乳汗和胎血中，在母血中浓度最高。当末次月经不确定时，测定母血妊娠特异性蛋白（SP1）可以确定胎龄和预产期，还可用于双胎的早期诊断。在早孕阶段利用母血SP1可筛查出43%的染色体异常儿，假阳性率5%16。2.6.3 NR-NAP 90年代初有人发现母体血清中的这一指标与胎儿DS相关，但是这一标记物需用免疫组化方法进行检测，操作相对复杂，故推广有一定难度，但其阳性检出率可高达79%，被认为是所有已发现的血清标记中，单项阳性检出率最高的一个标记。近期有人对其原有的检测方法作改进，采用流式细胞仪进行检测，方法较以前简便。 2.6.4 侵入性滋养细胞抗原（ITA）ITA是hCG的一种高度糖苷化形式，是最具意义的hCG类标记物之一，是DS孕中期的筛查标记物。2.6.5 嗜酸性主要碱性蛋白的前体（pro-MBP） pro-MBP与PAPP-A有关，但其浓度超过PAPP-A的4倍，是DS孕早期的筛查标记物。胎盘生长因子和胎盘泌乳素等也有零星报道。这些新的血清标记物都与唐氏综合征有关，但还未有足够的资料证明它们是有效的指标，有待于进一步大样本试验验证。3 其他筛查标志物3.1 年龄 通常孕妇年龄超过35岁被认为是一个筛查指标，但实际上，单独应用孕妇年龄作为筛查方法非常不可靠。 1988年Wald等首次利用母血清AFP、uE3、hCG结合孕龄对唐氏综合征进行筛查311，获得了60%阳性检出率、5%的假阳性率。总之，无论何种筛查计算风险时都要考虑孕妇的年龄。3.2 超声检测胎儿颈项透明层（nuchal translucency,NT）NT是胎儿颈部脊柱软组织和皮肤之间的皮下透明层。NT 是目前孕早期筛查DS最为常见和有效的超声指标。目前公认的正常胎儿在1114 周时B 超下的NT均值为3mm, 范围在2 4mm。 在孕早期10-14周，DS患儿明显增厚，李之朋等人5报道，年龄NT筛查，假阳性率5%条件下，DS的检出率为69.3%。4 联合筛查 由于迄今为止发现的血清标记物在单独使用时，大都存在检出率不高，假阴性、假阳性不低等缺陷，所以近期人们更注重的是多项标记的联合应用来弥补上述缺陷。不少作者将已发现的标记物进行了各种排列组合5，二联，三联，四联甚至七联。虽然从理论上讲只要被选用的标记物彼此不重复，那只要其与筛查的疾病有一定的相关性，则选用的标记物越多，阳性检出率就越高。但从经济上及临床实际应用的角度，并非选用的标记物越多越好，应在使用相对少的标记物的情况下，寻求效益的最大化，故除了研究，实际用于联合筛查的标记一般为24个，分别用在孕早期和孕中期。4.1孕早期（1113 周）筛查方案 4.1.1 早孕期二联筛查方案（PAPP-A +-hCG） 1999年由Cuckle提出，为早孕期DS 筛查首选方案，是最好的早孕期筛查方案，PAPP-A与-hCG组合在孕早期时DS 的阳性检出率最高可达63%3。 4.1.2早孕期三联筛查方案（PAPP-A+ F-hCGNT）:从1999年10月2002年12月，美国FASTER研究组对38167名病人做了唐氏筛查，发现：假阳性率5%时，孕11、12、13周的孕早期三联（PAPP-A+ F-hCGNT）联合筛查DS的检出率分别为：87%、85%和82%。因而早孕期三联筛查方案的检出率最理想。国内常颖6等人对500例妊娠11-13周妇女进行PAPP-A+ F-hCGNT三联孕早期筛查，高风险为6例，3例为DS患儿。因例数有限，检出率不能得出。但就目前的样本量来看，联合检测检出率较高。4.2孕中期(1520周)筛查方案 4.2.1中孕期三联标记组合方案（AFP +-hCG + uE3）是最先被使用的中孕期筛查组合。孕中期筛查在国内非常8，10，14普遍，左振伟13等人在2880例孕中期妇女进行AFPF-hCGuE3三联筛查，检出率提高到60%-70%。这种检测方法简便易行、费用低廉, 曾被认为是最有效的筛查措施。 4.2.2中孕期二联标记组合方案（AFP +-hCG）研究报道, 在孕中期对孕妇行二联筛查, 假阳性率为5%时，检出率为63%9。 二联筛查与三联筛查相比,其检出率低且假阳性率高, 但由于其筛查的实验室费用相对较低, 且筛查指标少产生误差小，因而目前临床应用范围比较广。 4.2.3孕中期四联标记组合方案（AFP +-hCG + uE3+ Inhibin-A）对孕1518 周的妊娠妇女行中孕期四联筛查，假阳性率为5%时, 检出率为81%15。该筛查方案与二联和三联筛查相比, 提高了检出率，但是该方案筛查的指标多、增加了筛查成本且统计分析复杂，在我国基层地区很难大范围推广。 4.3 更多的筛查方案4.3.1 序贯筛查在孕早期为病人提供三联筛查，孕中期提供四联筛查，每次筛查后都向病人提供结果。计算孕中期风险时包括孕早期测定的指标。FASTER研究的结论是检出率为88%3。确点是费用太高，而且分两个阶段进行筛查得出两个结果，让患者容易混淆。4.3.2 综合筛查在孕早期为病人提供三联筛查，孕中期提供四联筛查，只有在所有的筛查都完成后才向病人提供一个结果。将所有的标志物综合进行风险评估， SURUSS研究机构已经公布结果，这种综合筛查方法可以使假阳性率减少至2.6%，而检出率为90%，称为全综合检验15。缺点是使患者失去早期诊断的时机，而且两次检测的时间相隔太长。5 血清学筛查的质量控制5.1 实验室检测的质量控制 按照2010年的标准和卫生部筛查技术标准要求严格执行，建立实验室的标准操作规程15.1.1 信息采集 申请单和知情同意书都要详细填写，包括年龄、种族、体重、末次月经时间、近期B超双顶径、单双胎、病史、辅助生殖与否等信息。5.1.2 标本的接收 空腹采集，避免溶血，尽快分离血清（uE3在全血中不稳定），冷藏送检。5.1.3 定量测定 每次测定都要有标准曲线、室内质控测定。每年要参加室间质控。要设立实验室自己的中位数，试剂的批次改变，中位数也改变，尽可能使用同一批次试剂检测尽可能多的样本。保证精密度批内CV%3%，批间5%。5.2 非实验室因素的质量控制5.2.1 NT的标准化 NT技术要求高、检测通量小且我国医疗资源有限,普及难度大。5.2.2 准确估计孕周 孕周估计不正确，导致风险值计算错误，是最大的影响因素，所以要求近期超声计算孕周。5.2.3 孕妇其他影响因素：（1）体重（2）吸烟（3）胰岛素依赖糖尿病（4）种族（5）辅助生育技术（6）双胎妊娠等都可以影响MoM值。需要在计算中考虑校正。5.3 数据的评估实验室通过分析检查中位数值、风险系数、人群检测数据发布等数据来建立本实验室的分析参数，需要及时发现数据的偏倚，同时，由于孕妇在筛查期间发生的自然流产也能导致偏倚，所以更加大了数据评估的难度。要点是：样本量足够大，检测值和信息准确，才能尽量控制误差20，21。6 目前我国唐氏筛查的现状当前技术水平普遍比较低，筛查覆盖面不够广，国内开展较多的是唐氏综合征的孕中期筛查与诊断以及TORCH感染的诊断，但孕中期筛查在我国人群的覆盖率才10%17，23，多数都采用AFP +-hCG二联方案，检出率低，只有63%，远低于国外的孕早期唐筛的检出率（85%左右）。对于早期的胎儿结构畸形超声诊断，更是缺乏人才。这是制约早期筛查的主要因素。另外，病人的维权意识增加，这更增加了唐氏筛查的难度。综上所述，血清标记物作为一种产前筛查手段，因其无创伤性、操作直接简便、费用低廉、筛查范围广、筛查时间早，在高风险孕妇的筛查和监测方面发挥了越来越重要的作用，展现出广阔的发展前景，随着研究的进一步深入，筛查指标的增多，筛查手段及联合方案的逐渐完善，检出率逐渐升高，血清标记物筛查有望成为今后无侵入性的产前诊断的主要手段。对提高人口素质具有特别重要的意义。 参考文献1 中华人民共和国卫生行业标准 胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准 第1部分：中孕期母血清学产前筛查 2010-06-08发布，2010-12-31实施2 Malone Fergal D, Canick Jacob A, Ball Robert H, First-trimester or second-trimester screening, or both, for DownsyndromeJ .New England J Medicine,2005,353(19):2001-20113 Wald NJ, Cuckle HS, Densem J W,et al. 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