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在监测全球DNA甲基化在细胞原位检测接近结扎接近原位测定结扎监测全球DNA甲基化细胞摘要背景DNA甲基化在哺乳动物基因表达的表观遗传控制中起核心作用，是X染色体失活，基因组印迹和反转录转座子及重复序列沉默所所必需的。因此，一些已经开发的技术用来衡量DNA甲基化程度。结果我们这里通过邻位连接原位技术的适应来展示蛋白-蛋白相互作用检测的发展，通过量化Dnmt1/PCNA在细胞间的相互作用来评估细胞中的DNA甲基化状态，从而反映了DNA甲基化的程度。我们在座的接近结扎适应通过蛋白-蛋白相互作用检测原位技术的发展以来Dnmt1/PCNA在细胞间的相互作用的量化评估在细胞中的DNA甲基化状态，反映了DNA甲基化的程度。结论这种方法对细胞的直接可行说明，它可以广泛应用于一系列基础研究和药物开发。更关键的是，这种方法特别适用于用微量生物材料实现调查研究，以干细胞或初代培养的肿瘤细胞为例。关键词：全球DNA甲基化的方法，Dnmt1/PCNA，邻位连接原位技术背景DNA甲基化在哺乳动物基因表达的表观遗传控制中起核心作用，是X染色体失活，基因组印迹和反转录转座子及重复序列沉默所所必需的。1 ，2。DNA的5 -甲基胞嘧啶的缺失，即DNA的低甲基化过程，是早期瘤形成的标志之一3 。此外，一些论文报告DNA低甲基化是一种导致染色体不稳定和癌基因表达的致癌事件4，5。著作中也提到DNA低甲基化程度与肿瘤进展和肿瘤病人的生存预测有关6 。所有这些问题的事实，DNA甲基化异常是潜在可逆的事实，鼓励DNA甲基化药物抑制剂的发展和其在抗肿瘤治疗中的应用。因此，细胞中DNA甲基化程度的量化作为一个关键点出现在包括DNA甲基化调节器在内的治疗反应的诊断，预后和评价中。一些已经开发的技术来衡量DNA甲基化的程度7 。第一组围绕在能够量化的5 -甲基胞嘧啶的方法上，采用反相高效液相色谱法（RP - HPLC法），二维薄层色谱法（2D - TLC），高性能液体色谱重点围绕质谱（HPLC - MS法），高效毛细管电泳（HPCE）和液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）8，9。第二组通过已开发出来的CpG位点的放射性同位素标记来量化5 -甲基胞嘧啶，例如ELISA法，焦磷酸测序，使用甲基化敏感的酶的COBRA方法10，11。著作中也提到第三个方法，通过测量催化DNA甲基化酶的活性来得到DNA甲基化程度 12。然而，所有这些方法需要多个步骤的工序以及数量足够和有效的细胞，最初，这点并不实际，特别对于某些原代培养的肿瘤细胞。因此，尽管事实上这里展示的方法是DNA甲基化量化的间接方法，但它提供了用微量生物材料，例如干细胞或初代培养的肿瘤细胞估测DNA甲基化水平的可能性。结果我们这里通过邻位连接原位技术的适应来展示蛋白-蛋白相互作用检测的发展，通过量化Dnmt1/PCNA在细胞间的相互作用来评估细胞中的DNA甲基化状态，从而反映了DNA甲基化的程度。在DNMT1和PCNA相互作用在DNA甲基化遗传起着关键作用的论证基础上，我们决定，通过邻位连接原位技术的实验（P-LISA）来监测和量化细胞中Dnmt1/PCNA相互作用的情况14， 15。如图（1A）所示，这个实验的原理是基于DNMT1和PCNA蛋白被两个寡核苷酸抗体染色，这是未来与寡核苷酸结合的抗体透露。在杂交液和连接酶存在下，与PLA的两个寡核苷酸形成一个圈，即DNMT1和PCNA蛋白质接近的情况下，聚合酶和核苷酸参与形成用红色荧光显示的滚动循环的放大。图片使用显微镜学原理，利用ApoTome组件（Axiovert 200 M Zeiss, Le Pecq, France）进行拍摄。为了考虑可能存在的色差，我们已经用专门的与P - LISA信号类似的校准球进行了校准（图（Figure1B）。1B）。信号逊色于轴向分辨率，以便减少衍射，接下来我们决定decovolve使用Huygens Essential软件（图图像（Figure1C）。1C）。下一步，惠更斯的decovovling使用“尼普科夫磁盘”的方法 。decovolving使我们能够解决一个直径低的信号，并增加了三维重建的质量。三维重建通过Amira.4.1.1方案实现。通过使用ApoTome技术，我们可以形象地观察内源性蛋白DNMT1和增殖细胞核抗原相互作用的结果（图1D） 。此外，使用这种方法还验证了Dnmt1/PCNA相互作用发生在细胞核的观点，并允许量化每个原子核中相互作用的数量 。为了验证使用Dnmt1/PCNA P LISA去评估细胞中DNA甲基化程度的可能性，我们比较了Dnmt1/PCNA相互作用的数量是否与非肿瘤性和肿瘤性乳腺癌细胞株中的5 -甲基胞嘧啶数量的量化值（ELISA法）有关。在非肿瘤性和肿瘤性乳腺癌细胞株中进行的P - LISA和酶联免疫吸附实验说明，肿瘤细胞（MDA - MD - 231和Cal - 51）比非肿瘤细胞（MCF10A）（数字（2AFigures2A和and2B）。2B）含有更少的Dnmt1/PCNA相互作用和5 -甲基胞嘧啶（5-甲基胞嘧啶）。在其他方面，这些结果表明，DNA在肿瘤细胞中的甲基化程度比非肿瘤细胞中低，因为肿瘤细胞含有更少的Dnmt1/PCNA相互作用。通过绘制5-甲基胞嘧啶数量与每个细胞核中Dnmt1/PCNA相互作用数量作对比，说明每个细胞核中Dnmt1/PCNA相互作用的数量与5 -甲基胞嘧啶的水平有关 （Figure2C 2C）。为了检验Dnmt1/PCNA相互作用可以用来估计总体DNA甲基化水平的想法，我们分析了DNA低甲基化策略在Dnmt1/PCNA相互作用上的效果。因此，我们首先监测了在Dnmt1表达逐渐缺乏的细胞中5-甲基胞嘧啶的数量和Dnmt1/PCNA相互作用情况 。为此，我们使用U251细胞和与siRNA相对的DNMT1。如图所示由图Figure3A，3A，ELISA法监测DNMT1表达表明，当用siRNA处理的细胞的数量增加时，DNMT1表达下降 。ELISA法评估的5-甲基胞嘧啶和P - LISA测量的Dnmt1/PCNA相互作用表明，siRNA介导的DNMT1表达的下降与5-甲基胞嘧啶的减少和Dnmt1/PCNA相互作用的降低有关（图相关（Figure3A 3A）。 ）。此外，一个Pearsons相关性检验也表明Dnmt1/PCNA相互作用的数量和5-甲基胞嘧啶之间存在重要联系（R = 0.983，P = 0.0004）（图之间显着相关性（Figure3B）。3B） 。其次，我们分析U251细胞中的5 -氮杂- 2 -脱氧胞苷在Dnmt1/PCNA相互作用的数量和DNA甲基化状态上的治疗效果。在没有5aza治疗毒性作用的情况下，我们观察到，同时存在着Dnmt1/PCNA相互作用的数量和DNA甲基化状态和DNMT1的表达水平的急剧下降（图4）。通过过去这两个实验，我们注意到，在DNMT1表达下降的情况下， 5-甲基胞嘧啶的减少与Dnmt1/PCNA相互作用的数量减少有关。在Dnmt1/PCNA相互作用和/或DNA甲基化程度降低条件的分析后，我们现在考虑增加Dnmt1/PCNA相互作用和/或DNA甲基化程度的条件 。生理学上，DNA甲基化程度增加发生于细胞周期的G1和S期之间，因为DNA复制后，新合成的DNA链是甲基化的依据母链甲基化的模式，从而促进DNA甲基化遗传进程。因此，我们接下来分析当细胞在细胞周期的G0/G1期和S期时，DNA甲基化程度和Dnmt1/PCNA相互作用数量的变化。为此，U251细胞在首次同步血清剥夺后，利用血清剥夺和胸苷治疗被阻滞在G0/G1期和S期（Figure5A）。P - Lisa和5-甲基胞嘧啶 ELISA法用来实现平行监控Dnmt1/PCNA相互作用的数量和DNA甲基化程度 。由图所示， S期Dnmt1/PCNA相互作用数量的显着增加与5-甲基胞嘧啶数（P = 0.0013和P = 0.0188）显着增加有关。当细胞执行从头甲基化时，DNA甲基化水平还可以增加。在这种情况下，我们使用了U87 - PORF DNMT3A细胞，因为我们已经使用了这些细胞促进caspase - 8基因的甲基化16。在这种情况下，我们观察到全体DNA甲基化水平和Dnmt1/PCNA相互作用数量维持不变，在细胞转染后2天（P = 0.7262，P = 0.4918）（尽管事实上，caspase8基因的甲基化水平在这一点上已经增加（P 0.0001），而我们观察到的DNA甲基化的全体水平和Dnmt1/PCNA相互作用的数量在细胞转染后4天增加（P = 0.0292，P = 0.0142）（图（Figure5D）。5D）。有趣的是，这些数据表明，在DNMT3A诱导的5-甲基胞嘧啶数量的增加反映了Dnmt1/PCNA相互作用数量的增加。然而，Dnmt1/PCNA相互作用的监测并不能代表caspase - 8基因的甲基化程度。因此，这些数据表明，Dnmt1/PCNA相互作用监测不建议用来分析特定基因的甲基化水平 。第讨论就方法而言，所有数据说明，Dnmt1/PCNA邻位连接原位实验应该能够反映细胞中的DNA甲基化程度。事实上，它是下面的一个DNA 低甲基化战略（DNMT1表达的抑制作用或治疗（5aza）或通过比较非肿瘤细胞与肿瘤细胞，Dnmt1/PCNA相互作用的数量与甲基化程度相似，此外，这种方法不仅适用于固定的细胞，还适用于少量生物材料的研究（干细胞，活组织切片检查样本.）与大多数旨在分析的DNA甲基化程度（引言部分提到）的技术不同，这种方法的另一个好处是，事实上它并没有要求转化含有质粒的细胞或提取DNA或核样本，以进行5-甲基胞嘧啶 - ELISA法的检验，例如，衡量mMTase。此外，我们的数据表明，没有必要将DNMT1和/或增殖细胞核抗原的表达水平考虑在内，因为在大量脑胶质瘤中没有看到DNMT1的表达水平和5-甲基胞嘧啶数量有关系，而且因为 Dnmt1/PCNA相互作用可以通过某些蛋白质的表达得到抑制（如DNMT1磷酸化，模仿UP肽行为的肽/蛋白质的存在，17，18 。由于这些观点的支持，因此，我们设想了一系列Dnmt1/PCNA P -LISA在基础研究和DNA低甲基化或不抑制复合物方面的应用，包括如Dnmt1/PCNA相互作用，其中包括一个在DNA甲基化遗传有主要作用的Dnmt1/PCNA/UHRF1。在生物学结果方面，我们的数据表明，在乳腺癌细胞株（MDA - MD - 231和Cal - 51）比非肿瘤的乳腺细胞（MCF10A ）有更少的Dnmt1/PCNA相互作用更少的5-甲基胞嘧啶数量。因此，乳腺癌作为在胶质瘤后出现的第二个肿瘤，我们注意到，Dnmt1/PCNA相互作用减少与以DNA低甲基化为特征的肿瘤细胞是相关的17，18 。除此以外，乳腺癌细胞的DNA甲基化与乳腺细胞DNA的比较，在著作中有详细记录19 -21 。Dnmt1/PCNA相互作用的程度与DNA甲基化程度密切相关解释了DNMT1和PCNA，作为两个重要的因子，与UHRF1一起构成主要的多蛋白复合物，促进了哺乳动物细胞中的DNA甲基化遗传15，22。此外，我们的数据表明，Dnmt1/PCNA相互作用增加，如S期的DNA甲基化水平相比Dnmt1/PCNA相互作用数量和G0/G1期的特征DNA甲基化水平，。因此， Dnmt1/PCNA P LISA的使用证实了后生的事实，在S期主要发生了包括Dnmt1/PCNA相互作用在内的复合物催化DNA甲基化遗传15，22 。此外，P - LISA的使用监控在DNMT1蛋白（主要酶催化DNA甲基化遗传）和细胞周期中的合作伙伴之间存在的相互作用 。此外，这些调查是在我们的实验室正在进行的课题，并考虑到争论在表示动力和细胞周期中DNMT1催化的DNA甲基化遗传的动能。我们的数据还表明，监测的Dnmt1/PCNA相互作用并不代表在DNMT3A过度表达下caspase - 8基因甲基化程度的提高，但在中期（4天）的Dnmt1/PCNA相互作用数量反映了DNMT3A诱导下5-甲基胞嘧啶的增加。因此，我们的数据表明，监测的Dnmt1/PCNA相互作用，不是分析特定基因甲基化程度的方法，而是监测DNA甲基化程度的方法。此外，DNMT3A诱导的高甲基化细胞中Dnmt1/PCNA相互作用的增加与DNMT1或PCNA过度表达无关（数据未显示 ）。因此，这些数据表明，经过一步“母细胞”Dnmt3催化的从头合成的甲基化，“子细胞”能够适应Dnmt1/PCNA相互作用的数量以便维持“母细胞”中Dnmt3的DNA甲基化模式。因此，根据DNA甲基化遗传的需要，而不是根据DNMT1和PCNA的相对数量，有一个细胞的适应过程。这一点影响了Dnmt1/PCNA P - LISA在细胞全体DNA甲基化监测方法中的使用，因为这表明，对于DNMT1和PCNA的蛋白水平没有必要将P LISA的计数标准化。结论通过邻位连接原位实验检测Dnmt1/PCNA相互作用，从而估计细胞中的DNA甲基化程度是一个有吸引力的的方法，因为1）它适用于少量细胞，2） ，它限制了协议的步骤（没有DNA提取，没有转染,.), 3），与非肿瘤细胞相比，它反映了癌细胞被低甲基化的事实，4）低甲基化代理商/策略的DNA相呼应的效果。第方法邻位连接原位实验细胞在盖玻片上培养了24小时 。然后用pH7.4与PBS的4多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟。用含0.5Triton 100 4的PBS在室温下透化20分钟。根据制造商的说明（Olink生命科学）实现拦截，染色，杂交，结扎，扩增和检测步骤。在这些步骤中，所有的孵化在湿度箱中进行。在黑暗的房间中进行扩增和检测步骤 。荧光是由使用ApoTome模块（X63 numerial光圈1.4）的AXIOVERT 200 M显微镜系统（蔡司），乐Pecq，法国。安装使用延长黄金抗淬灭剂，用DAPI（Invitrogen公司，法国）的筹备工作 。图片收购实现了在结构照明显微镜23。因此，横向分辨率（RL），根据Rayleigt标准：RL =0.61/NA（：波长，NA：客观的数值孔径）和轴向分辨率，在ApoTome，是指由全宽度的一半最大（FWHMz）在这个公式中，是发射波长，n是介质