从专利角度分析微生物源抗菌肽研发现状及研发思路周捷

从专利角度分析微生物源抗菌肽研发现状及研发思路周捷 书书:2019-06-10作者简介:周捷(1974-)，女(汉族)，河北石家庄人，高级工程师，TeE-mail270848048qq;*通讯作者:胡卫国(1970-)，男(汉族)，河北石家庄人，正高级工程师，TeE-mail ncpc163。 :10062858 (2019)08075005DOI:1014066/jki21-1349/r201908017从专利角度分析微生物源抗菌肽研发现状及研发思路周捷1，宁静2，于伟2，王淑华1，胡卫国1*(1.华北制药股份有限公司，河北石家庄050015，2.大为计算机软件开发有限公司，河北保定071000)摘要:目的了解微生物源抗菌肽类药物研发领域现状，为该领域内企业的研发方向提供思路建议。 方法基于专利视角，对全球数据库进行专利申请趋势分析，专利竞争格局分析，专利技术主题分析。 结果总体来讲国外对于抗菌肽的研究集中于抗菌肽制品及应用，国内则较为重视抗菌肽的制备技术。 国外技术的发展趋于成熟，处于稳定期，创新主体对中国市场十分重视。 结论建议企业在此领域研发具有独特性质的复合抗菌肽，开发高纯度抗菌肽并实现规模生产，同时注重抗菌肽的检测方法的开发，并在研发过程中合理利用现有技术。 关键词:微生物源抗菌肽;专利技术分析;研发:F416文献标志码:A抗菌肽(antimicrobial peptide)又称为抗微生物肽1、肽抗生素或宿主防御肽，广泛存在于生物体内的一种小分子多肽，是生物天然免疫系统中的一个重要组成部分，具有免疫调节、抗菌、提高机体免疫等作用。 目前国内外对抗生素耐药性问题的关注达到空前高度，抗生素替代品研发已经成为全球优先课题，而抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，被公认为是最具潜力的替代抗生素的产品2，因此抗菌肽的研究开发已成为世界上研究抗生素新产品的前沿性课题，是新型抗生素研究的新资源和重要途径。 本文通过分析近年来国内外微生物源抗菌肽技术的专利分布，给出抗菌肽研发时可采用的研究方向建议。 1专利分布的分析方法和说明1.1数据微生物源抗菌肽全球专利数据inno-joy数据库的直接检索结果，同时以各局官网为辅助数据库;采用分类号和关键词制定各技术主题检索式，采用申请人和发明人对各技术主题检索式进行查全率查准率的验证，专利覆盖全面率达90%以上，准确率达95%。 1.2专利技术主题分类本文将微生物源抗菌肽技术主题分为7类: (1)抗菌肽; (2)抗菌肽制品及应用方向; (3)抗菌肽表达系统种类; (4)抗菌肽种类; (5)抗菌肽结构; (6)抗菌肽纯度测定方法; (7)抗菌肽体内外活性测试方法。 对微生物源抗菌肽技术相关专利展开深入分析。 2专利技术分析2.1专利申请趋势分析32.1.1微生物源抗菌肽国外专利申请趋势分析图1显示的是国外抗菌肽专利申请量的变化趋势，截止到2018年4月28日，国外微生物源抗菌肽的相关专利共计401件。 相关专利的申请起源于1954年，是由“SCHAEFE”酿造公司申请的名称为“与酵母发酵处理有关的改进”的专利，在1954年至2000年，微生物源抗菌肽的相关专利申请量较少，目标国主要为欧洲、德国、日本和美国，是微生物源抗菌肽研究的萌芽期，在这个阶段的主要创新主体是爱克索玛技术有限公司、百时美施贵宝公司、默克公司、赫彻斯特股份公司、英属哥伦比亚大学以及拜耳药业等。 自2000年以后，微生物源抗菌肽的相关专利申请数量出现了大幅增长趋势，尤其在美国和欧洲提出的专利第36卷第8期2019年8月沈阳药科大学学报Journal ofShenyang PharmaceuticalUniversityVol.36No.8Aug2019p.750量涨幅巨大，之后全球对于抗菌肽的研究聚焦于抗菌肽在各种药物或材料方面的下游应用，因而在xx年至xx年，本领域专利申请数量大幅减少，xx年专利申请量大幅回暖，xx年之后尚未有新的本领域相关专利申请，可能原因为近期申请的专利尚未公开。 总体来讲微生物源抗菌肽国外技术的发展趋于成熟，处于稳定期，新增发明点减少，或是技术发展遇到障碍。 Fig1Foreign patentapplication trendsand marketstructure ofantibacterial peptide图1国外抗菌肽申请趋势及市场格局2.1.2微生物源抗菌肽中国专利申请趋势分析由图2分析可得，截止到2018年4月28日，国内微生物源抗菌肽的相关专利共计570件。 微生物源抗菌肽相关专利的在华申请起源于1987年，是由伊莱利利公司申请的名称为“糖肽抗生素的制备方法”的专利，自1987年至xx年，相关专利申请量较少，是微生物源抗菌肽研究的萌芽期。 自xx年起，在国家农业科技创新工程、“863”计划、国家科技支撑计划及自然科学基金持续交叉支持下，中国研究团队对抗革兰氏阳性菌抗菌肽、抗革兰氏阴性菌抗菌肽、Lfcin及其衍生肽的分子结构、基因表达、杀菌特性及杀菌机理等展开了系列研究，同时相继建立菌丝霉素、NZ 2114、MP 1102、MP1106的高效生产体系，实现该系列产品的高效分泌表达，所以自xx年至xx年间在华专利申请量大幅提高，虽然xx年申请量略有下降趋势，但在xx年与xx年申请量达到两个峰值。 图2表明中国对于微生物源抗菌肽技术领域十分关注，并且现已进入快速发展阶段，预计在政策推动下，未来几年内还会呈现增长态势。 2.2微生物源抗菌肽专利竞争格局分析在中国申请的微生物源抗菌肽的相关专利数量最多，共计570件，占全球专利申请总量的Fig2Patent application trends in China ofantimicro-bial peptidesfrom microorganisms图2微生物源抗菌肽中国申请趋势65.21%，其次是在欧洲和美国申请的专利，在欧洲申请专利总量共计127件，占全球专利申请总量的14.53%，在美国申请的专利数量仅次于欧洲，共计122件，占全球专利申请总量的13.95%，在日本申请的专利数量最少，共计55件。 创新主体对中国市场十分重视，微生物源抗菌肽在中国具有广阔的发展前景。 由图3分析可得，在华专利的96%由中国本土申请人申请，4%由国外申请人申请。 国外来华157第8期周捷等:从专利角度分析微生物源抗菌肽研发现状及研发思路申请专利的国家中美国申请量最多，共计7件，主要申请人为卡比斯特制药公司。 除美国以外，来华申请专利最多的国家是丹麦，主要申请人是诺维信公司。 另外，加拿大、瑞士、古巴、西班牙、英国、韩国、列支敦士登、马来西亚、斯洛文尼亚和南非都在中国市场进行了专利布局。 可见中国市场的竞争局面主要体现在国内企业间的竞争，大量的技术掌握在国内申请人手里，目前中国在微生物源抗菌肽领域的研究取得了较大的成效并且有能力占据一定的市场。 Fig3Competition structureof appliedpatents inChina图3在华专利竞争格局图2.3微生物源抗菌肽技术主题专利分析4本节将从国外与中国的抗菌肽、抗菌肽制品及应用方向、抗菌肽表达系统种类、抗菌肽种类、抗菌肽结构、抗菌肽纯度测定方法及抗菌肽体内外活性测试方法等方面对由微生物源抗菌肽技术相关专利展开深入分析。 2.3.1抗菌肽分析国外对于微生物源抗菌肽的研究主要聚焦于微生物自身分泌的抗菌肽，但总体申请量较少，其研究目前还属于缓慢发展的阶段，而外源抗菌肽基因在微生物内表达技术仍处于萌芽期。 中国在此领域总体研究较多，微生物自身分泌的抗菌肽以及为昆虫和哺乳动物的抗菌肽的研究已经进入到了快速发展阶段，为水生生物的抗菌肽则处于缓慢发展阶段，而为人工合成、两栖动物、植物、鸟类和爬行动物的抗菌肽仍处于技术萌芽期。 2.3.2抗菌肽制品及应用方向分析抗菌肽制品的应用方向主要有人用药、兽用药与饲料添加剂，但专利中明确提及其应用方向的并不多，对其应用方向的描述通常是以“替代现有抗生素”的形式出现的。 由图4可以看出，国外较为关注抗菌肽用作药物的研究，尤其是人用药的研究，而对兽用饲料添加剂的关注度较低;国内关注度差异不大，略倾向于兽用饲料添加剂。 在人药应用方面，微生物源抗菌肽主要用于治疗各种细菌感染性疾病、癌Fig4Schematic diagramof antimicrobial peptideproducts andapplication direction图4抗菌肽制品及应用方向分布图症、艾滋病、肺结核以及消化道疾病，在兽药应用方面，主要用于治疗各种细菌感染性疾病、消化道疾病以及奶牛乳房炎等，在饲料添加剂方面，则主要用于增产、提高动物自身免疫力和治疗消化道疾病等。 2.3.3抗菌肽表达系统种类分析微生物源抗菌肽技术中表达系统是获得高质量抗菌肽至关重要的一环，常采用的表达系统有真核生物和原核生物两大类，其中研究较多的有大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和藻类等。 国外微生物源抗菌肽的表达系统主要有大肠杆菌、酵母菌、放线菌、芽孢杆菌、链球菌、乳球菌和丝状真菌，其中大肠杆菌申请量最多，为41项，专利占比19%，酵母菌申请量为37项，专利占比17%，放线菌与芽孢杆菌申请量相当，分别为32项和31项，专利占比分别为15%和14%。 国外在本领域基本处于起步阶段，其中大肠杆菌、酵母菌、放线菌和芽孢杆菌的研究均处于缓慢发展阶段;链球菌、乳球菌和丝状真菌的研究还处于萌芽阶段。 中国微生物源抗菌肽的表达系统主要有大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、放线菌、乳球菌、乳杆菌和藻类，其中大肠杆菌申请量最多，为196项，专利占比32%，酵母菌申请量为178项，专利占比29%，芽孢杆菌申请量为105项，专利占比17%。 中国在本领域已经有了一定体系，其中大肠杆菌、酵母菌和芽孢杆菌的研究已进入快速发展阶段;放线菌与乳球菌的研究处于缓慢发展阶段;乳杆菌与藻类表达系统的研究处于探索萌芽阶段。 2.3.4抗菌肽种类分析目前国内外研究最多的抗菌肽为细菌素和防御素，其中细菌素申请量为122项，专利占比29%，防御素申请量为96项，专利占比23%。 其257沈阳药科大学学报第36卷次为复合抗菌肽、天蚕素、糖肽抗生素和cathelici-din类抗菌肽。 其中细菌素和糖肽抗生素均是由微生物自身分泌得到的抗菌肽种类，属于微生物自分泌范畴，而其他类别的抗菌肽均为外源基因导入微生物表达得到的，属于微生物表达外源基因范畴，复合抗菌肽值得关注。 2.3.5抗菌肽结构分析抗菌肽结构会很大程度上影响抗菌肽的活性，因此一直是国内外关注的重点。 根据表1可知，国外微生物源抗菌肽相关专利中提到所分泌抗菌肽一级结构明确的有112项，专利占比71.8%，二级结构明确的有26项，专利占比16.7%，提到高级结构的有2项，专利占比1.3%。 中国微生物源抗菌肽相关专利中提到所分泌抗菌肽一级结构明确的有380项，专利占比68.8%，占比率略低于国外，二级结构明确的有88项，专利占比15.9%，也略低于国外，提到高级结构的有7项，专利占比1.3%，与国外基本持平。 Table1Distribution ofantimicrobialpeptidestructure表1抗菌肽结构分布表Primarystructure(Proportion)Secondarystructure(Proportion)Advancedstructure(Proportion)China380(688%)88(159%)7(13%)Global112(718%)26(167%)2(13%)2.3.6抗菌肽纯度测定方法分析微生物源的抗菌肽的纯度测定方法主要有电泳(SDS)法、高效液相色谱(HPLC)法、凝胶扫描法、质谱法和Bandscale软件定量测量。 其中国内外均使用较多的为高效液相色谱法，而作为检测抗菌肽纯度的第二热门方法，国外倾向于选择质谱法，国内则更关注于电泳法。 微生物源的抗菌肽纯度较高的可以达到99%及以上。 2.3.7抗菌肽体内外活性评价分析抗菌肽作为新型的潜在抗菌药物，在耐药问题日益严峻的今天引起了广泛关注。 在对抗菌肽研究不断深入的同时，抗菌肽体内外活性评价的研究也逐渐成为关注重点。 目前大多数研究主要集中于体外试验。 由于体内研究能够为抗菌肽应用于临床奠定重要基础，故而对体外研究成熟的抗菌肽必须进一步进行体内试验。 目前抗菌肽体内研究主要集中于体内抗菌活性和体内毒性的试验。 国内外常用的活性评价方法有96孔板法，纸片琼脂扩散法、琼脂糖孔穴扩散法、抑菌圈法、平皿二倍稀释法、牛津杯法、微量二倍稀释法、MTT法和平板生长抑制法等。 2.4数据不完整说明本文对于xx年以后的专利申请数据采集不完整，统计的专利申请量比实际的专利申请量要少，这是由于部分数据在检索截止日之前尚未在相关数据库中公开。 例如，PCT专利申请可能自申请日起30个月甚至更长时间之后才进入国家阶段，从而导致与之相对应的国家公布时间更晚;发明专利申请通常自申请日(有优先权的，自优先权日)起18个月(要求提前公布的申请除外)才能被公布;以及实用新型专利申请在授权后才能获得公布。 3结论与建议3.1分析结论从宏观来看，国外对于抗菌肽的研究已趋于成熟，而中国抗菌肽技术起步较晚，目前仍处于快速发展的阶段，专利年均申请量200件左右。 从产业链来看，国外对于抗菌肽的研究集中于抗菌肽制品及应用，中国则更重视抗菌肽的制备。 从技术层面来看，由微生物分泌抗菌肽的主要为微生物自分泌和表达外源基因，其中全球对于由微生物分泌抗菌肽的研究主要聚焦于微生物自身分泌的抗菌肽，但发展较为缓慢，而外源抗菌肽基因在微生物内表达技术仍处于萌芽期;全球对于由微生物分泌抗菌肽的表达系统的研究基本处于起步阶段，其中大肠杆菌、酵母菌、放线菌和芽孢杆菌的研究相对较多;在抗菌肽种类方面，国内外研究的由微生物表达的抗菌肽种类主要是细菌素、防御素、天蚕素等常见的抗菌肽及通过基因工程手段组合后的复合抗菌肽。 3.2研发建议3.2.1研发具有独特性质的复合抗菌肽复合抗菌肽一是指人类通过基因工程手段将几种或多种天然抗菌肽序列融合、修改、表达后得到的抗菌肽;二是指将多种抗菌肽共同表达、协同作用，故而复合抗菌肽的性能较之天然抗菌肽会大幅提升。 复合抗菌肽的研究起源于先灵公司申请的名为“作为抗真菌剂的抗生素W-10复合物，抗生素20561和抗生素20562”的专利，虽然复合抗菌肽的研究进程较短，但其申请量占比较大，是目前国内外除细菌素和防御素外第三关注的抗菌肽类型，未来几年发展潜能巨大，因此开发具有独357第8期周捷等:从专利角度分析微生物源抗菌肽研发现状及研发思路特性质复合抗菌肽具有极其重要意义。 3.2.2开发高纯度抗菌肽并实现规模生产目前国内外主要采用的抗菌肽活性提升技术手段为基因改造、基因重组、培养条件改变和提纯路线改变，而主要想要达到的功效为发酵产量提高、规模生产、获得高产菌株、抗菌肽活性提升和制品纯度高，具体的技术热点为通过改造抗菌肽基因的手段达到抗菌肽活性大幅提升的功效，通过改变发酵工艺流程、改变提纯路线、基因重组和改变培养条件等方式实现抗菌肽的规模生产，通过基因改造、敲除、重组和启动子改进获得高产菌株，通过改变培养基组成的手段实现发酵产量提高和通过提纯路线改变手段实现制品纯度变高等，通过对现有抗菌肽序列的改进以提高抗菌肽活性，其他技术点的相关专利数量还相对较少，有待开发。 3.2.3开发抗菌肽的检测方法5国内申请的制备方法专利相对较多，但涉及检测方法的专利较少，可以通过检测制备过程中出现的杂质或分解产生的物质等连同制备方法一并提出专利申请，弥补方法专利难以维权取证的缺陷。 国内外均使用较多的抗菌肽活性检测方法为高效液相色谱法，而作为检测抗菌肽纯度的第二热门方法，国外倾向于选择质谱法，国内则更关注于电泳法。 3.2.4研发过程中合理利用现有技术20世纪90年代后半期被称为新药开发的黄金时期，当时的专利即将失效，任何单位或个人可以无偿的使用，这些专利就是一笔巨大的财富，企业和科研人员要合理利用。 另外，专利数据库中有些撤回、视为撤回或被驳回生效的专利申请，这些申请后续不再具有授权的可能，就成为了公知技术，研发人员可以无偿使用这些专利文献，从中找到对于自己的研究有用的资料，避免重复研究，从而节约研发时间。 使用失效专利需要注意以下事项:a.在使用或改进目标失效专利的时候一定要仔细，尤其在改进失效专利时一定要确保他人或专利权人没有针对失效专利改进的新专利。 b.对目标专利进行监控，随时关注其法律状态，一旦法律状态处于终止或者保护期限即将到期，可以提前进行战略布局，及时的使用该项技术，抢占市场先机。 参考文献:1李凤娟抗菌肽饲料添加剂的应用及其研究进展J添加剂世界，xx (2):28302曹隽喆，顾宏基于计算方法的抗菌肽预测J计算机学报，xx (12):277827903杨铁军，葛树，冯小兵，等专利分析实务手册M北京:知识产权出版社，xx (1):1381884马天旗专利分析方法、图表解读与情报挖掘M北京:知识产权出版社，xx:255王晶晶，王慧研，张玲玲，等从专利角度分析药物技术创新现状及研发思路-以低分子量肝素为例J中国药科大学学报，xx，46 (4):504508Technical analysisof microbial antimicrobial peptidepatentsandD suggestionsZHOUJie1，NING Jing2，YU Wei2，WANG Shuhua1，HU Weiguo1*(1.North ChinaPharmaceutical Co.Ltd，Shijiazhuang050015，China;2.Dawei putersoftwaredevelopment Co.Ltd.，Baoding071000，China)Abstract:Objective Toknow thecurrent situationof researchand developmentof microbial-derivedantimicrobial peptidesand toprovide suggestionsfor theenterprises inthis fieldMethods Basedon thepatentperspective