STR扩增及亲子鉴定.doc

亲子鉴定原理：在没有基因突变，分型错误的前提下,孩子的一对等位基因必定是一个来自父亲，一个来自母亲；孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。目前运用STR作为遗传标记系统。 STR（short tandem repeat）：短串联重复序列（short tandem repeat, STR）是广泛存在于人类染色体DNA中的一类多态性遗传标记系统，因其存在范围广（平均16kb中即有一个STR基因座），核心序列小（2-7bp）且扩增产物长度均小于500bp，等位基因位点的数字即代表序列重复的次数。STR基因座的等位基因片断长度集中，故可对多个STR基因座进行复合扩增。复合扩增多个STR基因座，累计鉴别能力可以接近或达到DNA指纹水平。亲子鉴定的流程：样本采集-DNA提取-pcr扩增-测序。用STR分型技术作亲子鉴定时的策略和判断标准的研究伍新尧1，朱运良1，2，童大跃1，蔡贵庆1 陈 勇（1中山大学中山医学院法医学系，广东 广州 510080； 2郑州大学基础医学院法医学教研室，河南 郑州 450000） 摘要：STR分型技术已经成为亲子鉴定的最重要的技术手段,但是国际上尚未有一套从理论和实践都证明可行的策略和可靠的判断标准。本文在教育部“211工程”基金等项目的资助下，进行了深入的研究，确定了如下的策略和判断标准。三联体亲子鉴定案：最少检测15个STR基因座，若没有发现矛盾基因座，父权指数达10000，可以作出“肯定亲生关系”的结论；若出现1个矛盾基因座，要增加检测基因座至17个；若发现有2个矛盾基因座，要增加检测至24个，没有新矛盾基因座发现时，父权指数达10000，可作出“肯定亲生关系”的结论；如果出现3个矛盾STR基因座，则要继续增加检测STR基因座或其他遗传标记，再没出现新的矛盾现象，父权指数超过10000以后，亦可以作出“肯定亲生关系”的结论；若有4个矛盾STR基因座，则作出“否定亲生关系”的结论。单亲案亲子鉴定： 至少检测17个STR基因座，没有发现矛盾基因座时，作出“不排除亲生关系”的结论，若发现有1矛盾基因座，增加检测至26个以上；若有2个矛盾基因座，要增加检测至36个以上，没有发现新的矛盾基因座，可作出 “不排除亲生关系”的结论，如果出现3个或3个以上矛盾STR基因座，则应作出“否定亲生关系”的结论。本实验室的实践表明，按照上述策略和标准作出判断，未发现争议现象。这些策略和判断标准符合科学、公正原则，值得推广应用。关键词： STR 亲子鉴定 亲权指数 标准20多年来，随着我国国民经济的快速发展，人民生活水平的迅速提高，国际或地区间的交流急剧加速，城乡流动人口的快速增加，各种观念在迅速改变，各类媒体对亲子鉴定方面的科普知识也作了大力的宣传和普及工作，亲子鉴定在我国从开始的少数案例1,迅速增加。这些年来，在我国各个地区，迅速成立了许多从事亲子鉴定的结构。单以广州市为例，过去（1990年以前）只有中山医科大学的法医学系从事亲子鉴定工作，但是，至今，已经有至少7家机构在从事这项工作。从全国范围来说，关于亲子鉴定工作，也没有统一的操作规范或技术守则，更没有统一的、科学的判断标准。因此，各个鉴定机构发出的鉴定报告的科学性、可靠性就必然存在这样那样的问题，甚至引起新的纠纷。显然，这种情况与加强法治建设和实现我国司法公正的要求是不相适应的。1986年，英国科学家Jeffreys等【2】，采用全新的“DNA指纹”技术成功地鉴定了一例用传统的血型鉴定技术无法解决的移民案以后，亲子鉴定技术开始了直接分析DNA的新时代。由于DNA本身所具有的无比优越性和相关DNA分析技术的迅速发展，特别是一种称为微卫星DNA的STR（short tandem repeats,短串联重复序列）【3】被发现以后，应用DNA分析技术进行亲子鉴定，则更加普遍。STR序列广泛分布于各个染色体上，个体（或等位基因）之间的差异一般只表现为重复数目（因而造成该DNA片段长度）的差异。这些差异能简单地用PCR技术检测出来。同时，还发现这些长度差异的片段又是严格遵循孟德尔遗传规律遗传的，因而可以用来区分不同个体，并追溯个体的父母来源。这种技术比Jeffreys先前发现的“DNA指纹”分析技术更加简便，对实验室要求低、容易推广、容易进行标准化。这使亲子鉴定技术进入了全新的阶段。据估计，人类基因组中存在着20万个左右的STR基因座4。随着STR基因座发现的数量迅速增加，STR多基因座复合扩增技术的逐步成熟，多色荧光标记技术的发展，由美国FBI认可的13个CODIS基因座组成的试剂合的推广应用，相应的检测多色荧光的遗传分析仪的推出，使得同时检测13个或更多的STR基因座的分析技术迅速在全世界许多地区和机构得到广泛应用。这种分析技术一次实验的个体识别力可以达到1x1017 ，其效力已经可以和“DNA指纹”比美。同时，由于此技术是在机器上进行的，减少了人为误差，减轻了劳动强度，世界上各个实验室的结果可以进行比较、交流，促进了实验室工作的规范和标准化。后来，又有16个STR基因座的分型试剂合商品化，进一步提高了个体识别力，使检验得到的结论更加完善和可靠。因此，目前全世界各个国家和地区几乎都在使用STR分型技术进行亲子鉴定和DNA的个体识别工作。不同人种的STR基因座的人群数据库也在迅速积累。遗憾的是，在用STR分型分型技术时，国际上至今尚未有一套大家认可的判断标准来指导亲子鉴定。为此，本文在“211工程”基金等项目的资助下，一方面完善亲子鉴定实验室的质量控制，规范各种操作规程，严格实验室的管理制度；另一方面，从2000年开始，从理论和实践两个方面对用STR分型技术作亲子鉴定的策略进行了系统的探索，希望能够制定出一套可靠的判断标准。现将研究结果综合报道如下。1 三联体案亲子鉴定案的策略和判断标准在20世纪80年代中以前，进行亲子鉴定的手段主要是分析血液中的遗传标记物，统称为血型分析，它包括红细胞血型（如红细胞的ABO血型， MN、Rh血型等），白细胞血型（HLA），红细胞同工酶型和血清蛋白型等四大类。其中，因HLA的基因座数目多，每个基因座编码的抗原种类多，有很高的个体分辨力。因此尽管其实验室工作十分繁杂，劳动强度大，在当时条件下有部分实验室仍然采用这一技术解决了许多高难度而且影响很大的案件1。这期间也会碰到一些遗传变异的案例，但毕竟数量很少，并不影响当时鉴定结论的准确性。按照孟德尔遗传规律，在这些检测的项目中，只要有一个项目的遗传违反了孟德尔规律，即可否定被检测者之间存在有亲生关系。否则，需要证明这个基因座的矛盾现象是由遗传变异造成的，这在当时是有相当难度的。对ABO血型的遗传变异，特别是一些稀有血型可以通过检测其血型物质是可以鉴别清楚的。 采用STR分型技术进行亲子鉴定以后，情况发生了巨大的变化。一方面STR基因座具有高度多态性，所用的STR基因座都有许多等位基因（如最少等位基因的TH01也有9个，而FGA已发现有25个），具有很高的非父排除率；另一方面其突变率也很高5,6,7 ，往往会对结果分析最后作出判断带来许多困难。在实践中，往往可以发现一些案例，在检测的STR基因座中有1-2个出现矛盾现象。此时增加检测STR基因座数目，结果可以是未见有新的矛盾基因座出现，但另一种可能性是随着检测基因座的数目增加，矛盾基因座的数目也在增加。这时该如何处理，该如何作出结论，才不致造成误判等重要问题就摆在我们面前。因此，在使用STR分析技术作亲子鉴定时，应该建立一套规程和判断标准，例如，在进行亲子鉴定时应该最少检测多少个STR基因座，父权指数该达到多少，发现有矛盾基因座时，该采取什么策略，鉴定结论该如何下才科学等。这些策略和判断标准还要通过实践的检验。然后按照这些规程和判断标准来指导亲子鉴定实验室的工作，就可以减少因鉴定结论的差错而致错案，促进我国的法治建设。首先采用计算机模拟试验8，采用13个CODIS系统（combinde DNA index system）（D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820，加上D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO）加上Penta D、Penta E基因座的资料。另外按照STR基因座的筛选原则挑选出 D8S384、D11S554、D12S391、PLA、D13S631、FES/FPS、D19S253、D20S85、D10S89等共约50个STR基因座备用。每个基因座以中国人群的基因频率作为抽样概率，计算出各基因座的PI值和累计PI值，用计算机统计1万次在采用不同数目的STR基因座进行模拟鉴定时的最小PI值、最大PI值和PI值中位数。结果显示在检测13个STR基因座时如果没有矛盾现象出现，其PI值可以达到5.9。但是，尚有0.06%案件的PI值不足1000。因此，我们设定，在进行三联体案鉴定时，起码要检测15个STR基因座。在没有发现矛盾基因座时，可以作出“存在亲生关系”的结论。然后，从理论上来计算在亲子鉴定时8，出现的矛盾基因座是突变所致抑或是本来就不存在亲生关系的可能性及之间的比值。使用平均非父排除率和平均突变率，用“二项式分布定理”计算在检测不同数量STR基因座时出现0到4个矛盾基因座时的概率，结果发现在真父与非父在检测13个STR基因座时，出现0个STR基因座矛盾的概率比LR（也可以看作PI）值达5.9104，在检测17个STR时，真父与非父出现1个矛盾基因座的概率比值为2.3103。同理在检测24个STR基因座时，出现2个STR矛盾基因座，真父/非父概率比值为1.1103。据此，我们制定了进行三联体亲子鉴定的规范：凡作三联体亲子鉴定的均需检测15个STR基因座；在前述基础上，若发现有1个矛盾基因座，则加作至17个基因座；若发现2个矛盾基因座，则加作至24个基因座；若出现3个矛盾基因座，则继续增加检测基因座，直至出现新的矛盾基因座，或将其矛盾基因座的概率按常数0.002/0.00310一起计算PI，若达到或超过3000，则可以作出“肯定亲生关系”的结论；一旦发现有4个矛盾基因座，则可否定被检者之间“存在亲生关系”。几年来,我们按照上述标准在实践中不断检验15,确定其可靠性。继续对5124例亲子鉴定的实践结果，进一步证明此标准是科学和可靠的。另外，美国AABB10统计310490例亲子鉴定，亦按此标准进行判断。2 单亲案鉴定的策略和判断标准在许多情况下，由于特殊原因需要解决单亲的亲子鉴定问题，与三联体案不同，单亲案只有单亲的遗传信息，给其亲子鉴定带来许多困难。但是STR分型技术只要应用得当，完全有条件对此类案件作出科学的判断。与三联体案类似，STR基因座的多态性高的另一个方面是它的突变率也高。在缺少父或母的情况下，加上STR高突变率，如何确定其鉴定策略，就显得更为重要。为此，我们首先考虑在单亲案时11，每个STR基因座的非父排除率与三联体时相比，会有明显的降低，其非父排除的计算公式为：；多基因座的累积非父排除率公式为：通过计算，可见单个基因座的非父排率在单亲案时明显低于三联体案（平均水平降低了0.575-0.411=0.164）。13个STR（CODIS系统）多基因座的累积非父排除率在单亲案时（0.999）与三联体案时（0.999991）也低了许多。因此，明显提示在作单亲案时如果要达到相同的判断标准，需要检测更多的基因座数。为了从理论上阐明在单亲案鉴定时，孩子和亲生父亲以及孩子和随机男人之间出现矛盾基因座的分布概率，按照二项分布公式P(m)=(1-)n-mm计算，其中P为在不同情况（是真父或是假父）下，出现矛盾基因座的概率，为从n个元素中抽取m个元素的组合）。被检查者之间不存在亲生关系（是假父）时，等于平均非父排除率PEM（0.411）；若存在亲生关系（是真父）时，等于这些基因座的平均突变率（0.0017）。计算结果表明在检测13个STR基因座，随机男人（即假父）还有0.001的可能性与该孩子没有矛盾基因座出现。若检测了15个STR基因座（包括了13个CODIS基因座）后，随机男人（假父）与孩子没有出现一个矛盾基因座的概率仍有0.00035。此时，真父/非父的比值（似然率，也可以理解为父权指数）是2775.7（超过1000）。因此，在单亲案鉴定时，应该检测更多的STR基因座。按我们的计算，单亲案鉴定检测18个STR基因座如果都没有矛盾基因座出现，就可以获得“不排除亲生关系”的结论。若有1个矛盾基因座出现，则要检测26个基因座以后似然率才可能超过1000。若有2个矛盾基因座出现，则检测的基因座要在36个以上，似然率才可能超过1000。如果单亲案鉴定，发现有3个STR基因座矛盾时，应该否定被检测者之间“存在亲生关系”。据此，确定了单亲案鉴定的策略和判断标准起码要检测18个STR基因座（包括13个CODIS，下同）。若发现1个矛盾基因座，要增加检测至26个以上。若发现2个矛盾基因座，要增加至36个以上。发现3个矛盾基因座时，则作出否定“亲生关系”的结论。几年来，本实验室按照上述标准判断，2284宗单亲案鉴定未出现争议案例有些单亲案鉴定的情况会变得特殊，此时“争议父或母”与真父或母存在近亲关系的。按照孟德尔规律，父母会将各自一半的染色体传给孩子，孩子再将自己一半（1/2）的染色体传给子2代。这种一半染色体的组合完全是随机的。理论上子1代将父亲传来的1/2染色体原原本本地传给子2代的可能性是很小的。此外，兄弟姐妹间具有完全相同的1/2染色体的可能性也是很小的。但现实中这种很小的可能性毕竟是存在的。本组的实践中就曾遇到这样的特殊案例12，子1代几乎将其父亲传来的1/2染色体（或基因座）传给了子2代，在检测了15个STR基因座后只有1个矛盾等位基因（而且相差只有一个重复单位），增加检测基因座至26个，没有再发现新矛盾基因座，继续增加基因座至30个，才发现2个矛盾基因座。另一例怀疑用姨来代替母亲进行鉴定的，在检测15个STR基因座时，也只发现1个基因座矛盾，只是检测到30个基因座时才发现3个矛盾基因座。经验告诉我们，在无法确定“争议父或母”是真父或母的近亲属（如父、母、兄弟、姐妹）时，在上述看似“肯定亲生关系”的案例，只能描述成为“不排除存在亲生关系”。这样的描述可以避免误判。至于是否为“肯定亲生关系”，应该由法院或当地的行政机关调查后再作结论。Thomoson等13用计算机模拟作了10000例侄/叔对的16个STR基因座的分析，结论是出现3个或更多矛盾基因座的占全部案例的63.4%,出现2个STR基因座矛盾的有14.9%,只出现1个矛盾基因座的占11.6%。有3.3%的侄/叔对全部基因座都不矛盾。N.von Wurmb-Schwark等的结果也类似，125侄/叔对作了15个STR基因座分析，有4%是完全不矛盾的。因此，N.vonWurmb-Schwark等也提出，在对单亲案鉴定作出结论时，要避免使用“实际证明是”亲生关系这样的描述，至少在移民案例中如此。参考文献：1.伍新尧，郭景元，陈跃龙， 亲权纠纷案的鉴定，J.中山医科大学学报，1987，8（1）：7792.Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL: Hypervariable “mini-satellite” regions in human DNA. Nature 1985;314:67-73.3.Monckton D G and Jeffreys,A J. DNA profiling. Current Opinion in Biotechnology, 1993,4(6): 660-664 STR, simple tandem repeat;4.Collete D,Sabine F, ceclle F, et al. a comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites. Nature, 1996, 380(14): 152154.8.朱运良，欧雪玲，蔡贵庆，伍新尧。 用STR进行亲子鉴定时结果的判定及其理论基础。中山大学学报（医学科学版）2004，25（6）：5345379 孙宏钰，伍新尧，曾艳红，邢浩伟，侯 锖 陈国恩。PowerPlexTM16体系在亲子鉴定中的评估。中国法医学杂志2002，17（4）:207-210