【毕业学位论文】（Word原稿）金龟子绿僵菌遗传转化体系的建立及转化子特性分析农业微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 金龟子绿僵菌遗传转化体系 的 建立 及转化子特性分析 I 摘 要 金龟子绿僵菌 （ 农林害虫生物防治中应用广泛，也是目前微生物农药的研究热点之一。 与传统的化学农药相比， 绿僵菌寄主范围广 ， 致病力强 ， 具有对人、畜 、农作物无毒 ， 无残留、菌剂易生产 ， 持效期长，害虫不产生抗药性等优点 ， 具有广阔的应用前景。但作为一种昆虫病原真菌，绿僵菌同时也存在着杀虫速度慢、效率低、防治效果不稳定等缺点，大大影响了其杀虫效果。 另外 由于自然分离到的菌株往往毒力不强或对环境的适应力较弱，需改良后才能应用于生物防治， 国外对其遗传转化方面已有大量研究，然而国内在这方面尚未进行深入研究从而制约了绿僵菌优良菌株的开发与利用。 本研究以金龟子绿僵菌 目标菌株，研究其原生质体制备、转化体系的建立并对稳定转化子的生物学特性进行了研究， 为我 国 绿僵菌遗传转化的研究提供参考。主要研究结果如下： 采用二级培养法收集菌丝体在 采用 的 液作为渗透压稳定剂， 20生质体30下处理 5h 的酶解条件下可形成 5 6 107108 个 /g 湿菌丝 原生质体，再生率为 15%。 用 导 法对绿僵菌原生质体进行了遗传转化，用 为筛选标记，构建了绿僵菌的遗传转化体系。通过敏感性试验得出 使用浓度为 300g/转化频率达到 1523个 /g 质粒，转化子能够稳定遗传。 导的绿僵菌遗传转化体系的建立，为从基因水平利用分子生物学手段对绿僵菌进行改造，得到稳定高效的杀毒工程菌株奠定了基础。 对得到的稳定的转化子进行了 培养基筛选、 生长速度、产孢量、致病性等 方面进行了 研究 。通过 对转化子生长的培养基进行筛选，筛选出 转化子生长的最适培养基 。 对生长速度进行测定 结果表明 ，对照菌株的平均日增长量为 化子的日增长量为 间，生长速度均比对照慢 ； 在转化子中 株生长速度最快 ，分别为： 落生长速度最慢，日增长 量为 转化子的产孢量 介于 108sp/间 ，与对照 108sp/比， 株的产孢量为 108sp/于对照但不存在显著性差异 。 对转化子进行毒力测定发现： 株转化子的 与其它几株转化子之间均存在显著性差异， 0 值分别为 d 和 d，致死中时长于其它菌株，说明这两株菌株对东亚飞蝗的致病力比其它菌株减弱。 本研究建立的 化体系， 并对得到的转化子的生物学特性进 行了测定， 为进一步深入研究绿僵菌的遗传转化、 工程菌的构建、以及产孢量和 致病性 等 相关基因的克隆鉴定奠定了基础。 关键词： 金龟子绿僵菌 ， 原生质体 ， 性 ， 遗传转化 in of is of at M. a of no to So it be in or so it be of . of of . of as by it h 0 , 0.7 as 56 107108sp g 5%. . 418 as M. 00g /of of 523 g NA 418 00g/. a . on of as 1. 2. of of K, K ( in M1 M3 in M6 3. As 08sp/to M2 4. on of to of is in be of of . 录 第一章 绿僵菌的研究应用与丝状真菌遗传转化的研究进展 . 1 僵菌概况 . 1 僵菌防治害虫的作用机理及防治效果 . 1 僵菌基因工程研究 . 2 状真菌遗传转化 . 3 因标记的概念 . 3 因标记技术在真菌的分子遗传学研究中的应用 . 3 状真菌遗传转化研究概况 . 3 菌原生质体的研究进展 . 4 状真菌转化方法 . 5 择标记和转化载体 . 6 第二章 材料与方法 . 9 验菌株与质粒 . 9 具酶与试剂 . 9 养基及溶液 . 9 生质体的制备与再生 . 10 体培养 . 10 丝体的收集 . 10 生质体制备 . 10 生质体再生 . 10 性标记的筛选 . 11 生素的筛选 . 11 生素敏感性测定 . 11 粒 制备 . 11 菌转化 . 11 粒提取 . 11 粒 化绿僵菌原生质体 . 12 化 . 12 化子抗性标记验证 . 12 化子遗传稳定性测验 . 12 418 转化子的表型分析 . 12 化子生长最适培养基的选择 . 12 长速度的测定 . 13 孢量的测定 . 13 转化子对东亚飞蝗的毒力测定 . 13 第三章 结果与分析 . 15 生质体的制备与再生 . 15 生质体制备 . 15 生质体再生 . 15 性标记的筛选 . 15 生素的筛选 . 15 生素的敏感性测定 . 16 粒 制备 . 17 粒 化绿僵 菌原生质体 . 18 化 . 18 化子抗性标记验证 . 18 化子稳定性测验 . 19 418 转化子的表型分析 . 20 化子生长最适培养基的选择 . 20 长速度的测定 . 22 孢量的测定 . 24 化子对东亚飞蝗的毒力测定 . 26 第四章 讨论 . 31 参考文献 . 33 致谢 . 39 作者简历 . 40 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 铃薯葡萄糖培养基 铃薯葡萄糖 酵母 培养基 氏培养基 乙二醇 甲基亚砜 霉素 B 苄青霉素 杆菌介导转化 制性内切酶介导的整合法 418 新霉素的类似物 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绿僵菌的研究应用与丝状真菌遗传转化的研究进展 1 第一章 绿僵菌的研究应用与丝状真菌遗传转化的研究进展 僵菌概况 绿僵菌属 （ 是由 883年建立的 ， 其分类地位隶属于真菌门 （ 、有丝分裂孢子真菌类 （ 、丝孢纲 （ 、丝孢目 （ 、丝孢科 （ ， 但是随着戴氏绿僵菌 （ 的有性型戴氏虫草 （ 发现 ， 绿僵菌真正的系统分类地位应为 真菌门 ， 子囊菌亚纲 （ 、核菌纲（ 、球壳菌目 （ 、麦角菌科 （ （ 黄勃等 ， 2002） 。绿僵菌是一种广泛应用于农林业害虫防治的昆虫病原真菌，其应用于害虫防治的时间已久 。 据本草纲目记载，我国太湖地区 蚕户就 开始 采集僵病死亡的野蚕，加水捣碎，喷洒在桑叶上，以此来防治一种桑蟥的 为 害（洪华珠，杨红 ， 1997） 。 截止到目前，据记录 绿僵菌可感染 200多种害虫， 包括 蝗虫、蚱蜢、 蛴螬、天牛、蟑螂 、 蚂蚁、 食心虫、白蚁、斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾 、禽壁虱（ 2001） 等，尤其是对蝗虫的防治有特效 。 中国农业科学院生防所（现在已改名为中国农业科学院植物保护研究 所）利用金龟子绿僵菌防治草原害虫，截止 到 2003年为止，其防治面积已逾 200万亩。 绿僵菌 对检疫性害虫稻水象甲、椰心叶甲也具有一定的防治效 果（ 2004； 2005；李宝玉， 2005） 。 2005年 海南椰心叶甲大爆发 ，中国 农 业 科学 院植物保护研究所绿僵菌实验室利用绿僵菌防治椰心叶甲，取得了可喜的成绩 （应月青， 2006） 。所以利用绿僵菌对害虫进行微生物生物防治具有广阔的前景 ， 绿僵菌已被联合国粮农组织（ 荐为环保产品推广应用 （ 1997） 。 从防治规模看 ， 绿僵菌已发展成为仅次于白僵菌的真菌杀虫剂。 绿僵菌 形态接近于青霉菌，产生孢子时为绿色 ，菌落为以绿色为基调的各种色泽 。 由于绿僵菌具有寄主范围广，致病力强， 对人、畜、农作物无毒，菌剂易生产，持效期长等优点，所以有着广阔的应用前景。但是由于自然分离到的菌株往往毒力不强或对环境的适应力较弱，需改良后才能应用于生物防治（农向群等， 1990），所以改变绿僵菌菌株的性状成为 急需 解决的问题。 僵菌防治害虫的作用机理及防治效果 绿僵菌是一种昆虫内寄生菌物，杀虫机理独特 （ 2000） ，既 可横向传播，又可纵向传播 。大量研究 结果 表明，绿僵菌与其他虫生真菌一样，主要侵染部位是寄主昆虫的表皮，经由体壁侵入到寄主昆虫体内（王海川等， 1999）。 绿僵菌 侵 染寄主昆虫时，首先是分生孢子附着在昆虫体表，孢子萌发后产生入侵菌丝，穿过体壁，在虫体内大量繁殖，产生毒素，形成孢子，最终导致寄主死亡。在侵染过程中绿僵菌分泌各种相应的酶（如蛋白酶、几丁质酶、脂酶等），有机酸（草酸、柠檬酸等）以及毒素（李文华等， 2001），形成特殊结构（如附着胞、穿透钉、穿透菌丝、穿透板等），同时要克服昆虫体表某些物质的抑制作用及昆虫体内的一系列免疫活动，侵染过程 是附着胞、表皮降解酶和破坏菌素等物质的生理生化作用的综合结果 （ et 2000，裘辉等， 2004） 。 绿 僵菌孢子 在 触及靶标昆虫后，通过酶的作用进入昆虫表皮，随后侵入血液，导致昆虫感染死亡 ， 被感染后的昆虫尸体依然附着在作物上 ， 新产生的绿僵菌孢子通过昆中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绿僵菌的研究应用与丝状真菌遗传转化的研究进展 2 虫外骨骼的孢子转运体被释放出来 ， 再度感染其它健康虫体。一般情况下只要靶标害虫 10%左右的个体被感染上绿 僵 菌后，便可相继摧毁整个群体 ， 杀虫率 极 高 。 在气候条件适宜的情况下，可连续几年攻击靶标害虫 ， 因此综合防治成本大大降低 。 此外，绿僵菌 是一种高效、低毒、无公害，害虫难以产生抗药性的绿色环保型生物农药 ， 对人、畜、林木和农作物等无害 ， 环保意义突出。但是由于真菌杀虫剂的使用量较 大、生产成本相对较高，分生孢子存活率低，贮存期短等缺点，寻找优良菌株尚需进行深入研究。 随着大量使用化学合成农药所造成的环境污染和害虫抗药性提高等问题日益突出，生物防治越来越受到重视 （冯明光， 1998 ） 。 1992年世界环境与发展大会决议中指出，要在全球范围内控制化学农药的销售与使用，我国已将发展生物农药 与绿色食品列入中国 21世纪议程。 昆虫病原真菌是自然界中昆虫种群数量得以控制的主要因素之一 （ 997 ） 。 昆虫病原真菌具有主动侵染、寄主不易产生抗性和可观的扩散效果等特点，因此 ，昆虫病原真菌作为一种潜力巨大的生物防治工具而倍受关注。为充分挖掘昆虫病原真菌的应用潜力，必须阐明它们致病昆虫的分子机制 （ 1994） 。近年来，昆虫病原真菌特别是金龟子绿僵菌致病机理方面的研究 已经 有了长足的进展。利用基因工程等手段对昆虫病原真菌进行改造，获得安全、高效的真菌杀虫菌剂，已成为可能。 僵菌基因工程研究 提高昆虫病原真菌的毒力是进一步扩大其应用的关键。可以通过如下几个途径来提高毒力： 通 过体细胞工程技术将不同菌株的优良性状集中到同一菌株上；筛选优良 菌株，并通过准性生殖杂交技术得到集多个优良性状于一体的菌株；通过基因工程技术在病原真菌中高效或诱导表达与毒力相关的基因。其中基因工程技术被认为是最有效的途径，而且它还成为研究昆虫病原真菌分子生物学的新工具 （裴炎等， 2003） 。 （ 1988）发现，凝乳弹性蛋白酶（ 致病力决定体，因此，克隆 因及其它致病力的决定体基因，不仅可以澄清致病机制，还将为虫生真菌杀虫剂培育出高毒菌株 。 1996） 通过 穿孔及生物转染法，将带有苯菌灵抗性质粒 入金龟子绿僵菌，以生 物转染法转化率及稳定性最高。带有苯菌灵抗性基因 粒 带有 因的质粒 金龟子绿僵菌 1080 菌株进行共转化试验，经抗性及富营养筛选，得到能够在烟草天蛾的血淋巴中过量表达 工程菌株，该菌株大大提高了杀虫活性 （ ， 1996） 。 （ 1989） 证明用质粒 化 绿僵菌 ，形成的转化子比较稳定并保持对烟草天 蛾幼虫的致病性， 交表明多数转化体是重复载体序列随机染色体中形成的。用绿僵菌防治害虫时会与防治真菌病害的杀菌剂接触并被大 量杀死，降低防治效果。 苯并咪唑类杀菌剂抗性基因在绿僵菌的转化率仅为每微克质粒 生 转化子（ 1990）， 因此，建立工程菌株意义重大。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绿僵菌的研究应用与丝状真菌遗传转化的研究进展 3 状真菌 遗传转化 因标记 的概念 基因标记是指将外源 入到受体细胞的基因组中，使受体细胞产生不同于正常细胞的表型。被引入的 以整合到受体细胞的质粒或染色体中并稳定遗传。由于特殊的设计，被引入的 含能方便地进行检测的基因，即标记基因。基因标记技术已经被广泛用于基因的克隆 及 基因的功能鉴定。此外，还可以利 用基因标记技术进行生防菌的追踪分析。 感受态细胞是指能获得外源 细胞，在外源 入受体细胞时，受体细胞必须处于感受态。感受态细胞直接摄取外源 过程称为转化。原生质体虽然除去大部分细胞壁，但仍然保持完整细胞的遗传特性及生理、生化特性，在适当的条件下能够再生细胞壁进而恢复成完整细胞。原生质体转化技术常利用无壁的原生质体，直接摄取外源 细胞器，与异种原生质体融合形成新的体细胞杂种，从而大大提高育种效率。 因标记技术在真菌的分子遗传学研究中的应用 基因标记技术已经被广泛用于 基因的克隆、基因的功能鉴定。此外，还可以利用基因标记技术进行生防菌的追踪分析。 近年来，由于虫生真菌在害虫持续控制及维护物种多样性方面的特殊优势，其应用及基础研究发展迅速，通过遗传工程改良菌株是今后发展的主要方向， 化技术是菌株改良的主要途径之一，国内外一些专家学者试图将这一技术应用到昆虫病原菌的菌种选育中，以促进病原真菌在害虫控制上的优势及潜力。 该技术的先决条件是建立外源 定导入 真菌 的方法。向丝状真菌中转化 常常 是向含原生质体的氯化钙溶液中加入外源 借助 作用来完成，但形成 稳定转化体的频率较低。 状真菌遗传转化研究概况 虫生真菌的菌株改良大体有 3 种方法。第 1 种：利用突变与诱变育种进行人工改良。方祺霞等（ 1985）用 线和紫外线对座壳孢野生型 自然分离株 行诱变育种，得到高产高毒的诱变菌株。邓春生等（ 1991）对蜡蚧轮枝菌原生质体进行紫外诱变得到产孢量提高10 倍， 并且 致病力提高 30%50%的效果。 1991） 采用从野生群体中分离突变株的富集分离技术分离出二倍体和三倍体突变株。第 2 种：应用细胞工程技术培育优良菌 株 。 早在70 年代，在许多人致力于通过诱变改良菌株的同时，就有人通过原生质体融合即形成异核体来改良菌株。农向群等（ 1988）对金龟子绿僵菌、粉拟青霉原生质体的形成条件、再生、融合及检测等进行了研究探讨。此后，农向群等（ 1990）用 维素酶和 牛酶的混合酶液处理了金龟子绿僵菌的菌丝，可从湿菌丝中获得 5 107个以上的原生质体。第 3 种：利用基因工程技术进行菌株改良。基因工程技术的发展为虫生真菌的遗传学研究提供了极好的手段。 通过遗传工程改良菌株是今后发展的主要方向，它的先决条件是建立外源 定 导入的方法。向丝状真菌中转化 本上是向含原生质体的氯化钙溶液中加入外源 助 作用来完成，但形成稳定转化体的频率较低（高兴喜等， 2005， 2006）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绿僵菌的研究应用与丝状真菌遗传转化的研究进展 4 丝状真菌 是自然界中普遍存在并 且 有重要经济意义 的 一种 真菌，被广泛用于工业、农业、医药等方面，在基础生物学研究中具有重要作用。例如产黄青霉 （ 和 点青霉 （ 等都能大量产生青霉素 ，顶头孢霉 （ 能 分别产生青霉素和头孢菌素，广泛 用于疾病的治疗 ； 工业上如黑曲霉 （ 和米曲霉（ 被广泛用于生产酶类和有机酸；在农业上，丝状真菌是农作物重要的致病菌，并能导致粮食等贮藏过程中的腐败变质，同时有些丝状真菌如白僵菌 （ 、绿僵菌（ 哈氏木霉 （ 等可用于作物病虫害的生物防治 ； 不过 有些丝状真菌 也 能产生对人体有害的物质，如黄曲霉菌 （ 能产生黄曲霉毒素 。由于丝状真菌在经济上和科学中的重要性，多年来一直被广泛 的关注 ， 对其进行研究的报道较多，有利于了解其有益性状，从而控制其不利性状 。丝状真菌遗传转化系统的建立为人们从基因水平研究丝状真菌的遗传背景和进一步的菌株改造提供了条件，通过转化把外源基因导入丝状真菌细胞，利用基因互补、基因破坏和基因替换等原理克隆或表达目的基因、分析基因的表达调控机理乃至改造工业生产菌株（刘朋绢， 2005）。 1979 年将外源 9因导入粗糙脉孢菌（ 色体基因组，建立了 化系统，从 而开创了丝状真菌转化的先河。 1983 年， 构巢曲霉（ 的 化获得成功，为科学家研究丝状真菌的 化技术及以 丝状真菌作为新的基因表达系统的研究奠定了基础。近年来，具有显性选择标记的潮霉素（ ）等抗药性基因的利用，加快了在工农业生产上具有重要意义的各类真菌转化技术的发展。据报道目前已有 100 多种丝状真菌建立了 化系统。随着植物病原菌对杀菌剂 产生 抗性问题的日益严重，国内外学者开始尝试对生物防治微生物进行抗药性的遗传改造，已将包括多菌灵在内的 苯并咪唑类杀菌剂抗性基因转入绿僵菌、木霉 102 中 ，从而 使生物防治菌具有对抗化学农药的性质，使二者能够同时应用于植物病虫害的综合防治，有利于保护农业生产和减少化学农药的使用（李梅等， 2003）。 目前，在丝状真菌中整合型质粒的转化频率远远低于大肠杆菌和酵母菌，一般每微克质粒能产生 1020 个转化子（张惠展， 2000）。苯并咪唑类杀菌剂抗性基因在绿僵菌 中 的转化率仅为每微克质粒 生 转化子（ 1990），木霉菌的转化率仅为每微克质粒 生 转化子（杨谦， 1998），这 给 外源基因的克隆和菌种改造带来很大困难。 但是，通过对目的基因载体的构建、原生质体转化条件、转化子的培养时间等方面进行优化研究，可以提高其转化率。 菌原生质体的研究进展 自 20 世纪 70 年代以来，生物技术迅速崛起，现在已经成为新技术革命的重要组成部分。生物技术可以将理想的异源遗传物质，包括基因、染色体移植到目标生物中去，从而按照人们的要求去改造物种。例如，基因工程可以越过有性杂交的屏障，使基因在远缘物种之间转移，为定向地改变生物遗传性，创造新型的物种提供了有利手段。利用原生质体融合（体细 胞杂交）技术，可以得到有性杂交难以得到的种属间或细胞杂种。原生质体（ 为一个研究体系已备受人们关注（柴容明， 2000）。 原生质体是保留完整细胞质膜而没有细胞壁的细胞，去壁不完全而带有部分细胞壁的细胞叫中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绿僵菌的研究应用与丝状真菌遗传转化的研究进展 5 球状体。最初，人们得到原生质体是通过机械捣碎的方法（ 1892），但由于该方法难以得到大量原生质体，因此实际应用较少。后来许多研究者试图改进和发展这一技术，但是进展甚微。原生质体简便、快捷的制备方法得益于人量工业化酶的制备，酶解细胞壁可以大量获得原生质体，这是原生质体技术 建立和发展的基础。 到了 20 世纪 50 年代，人们开始关注原生质体技术， 1953 年 次利用融菌酶酶解制备了巨大芽孢菌的原生质体 。 受细菌原生质体融合的启发， 1957 年 首次用蜗牛酶酶解制备了酵母菌的原生质体 。 60 年代捷克的 西班牙的 个研究中心对原生质体技术做了大量基础性工作，前者主要应用原生质体研究酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研