【毕业学位论文】（Word原稿）CELO禽腺病毒载体的构建及fiber 1部分片段的原核表达预防兽医学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 及 部分片段的原核表达 A of 摘 要 即鸡胚致死孤儿病毒 ，是 目前进行病毒载体研究的主要工具 之一 。 和 基因表达的两个纤突蛋白与该病毒的毒力和免疫原性相关 。 缺失 基因后病毒依然能复制，但 失去野生型病毒 特有 的特异性转导 作用 。本试验就是利用这一特性构建了复制型重组 外根据 的 根据 序列号 毒的基因 组 序列 ， 利用 计 一 对 特异性 引物， 以 毒基因组 模板，用 增出了 长度 3611 段 （位于 基因组序列 的 27150中包括 全基因和侧翼序列 ）， 克隆到 体上，获得 利用双酶切位点 理 切处理 到增强式绿色荧光蛋白表达盒 二者补平，然后连接得到转移质粒 毒基因组 转染 293胞，用转染产物感染 胞，拯救重组病毒，最后通过荧光、 镜检测重组病毒。 根据 毒的 基因序列， 选取了 蛋白的 免疫 优势区域 ，利用计 一 对 特异性 引物， 以 模板， 扩增 了其中 807 目的 片段 （ 位于 的， 克隆入 体中，转化大肠杆菌 后用 导外源基因的 表达 ，获得 目的蛋白；薄层扫描显示，重组蛋白占菌体总蛋白高达的 验表明 ， 目的 蛋白 具有较好的抗原活性。 本研究构建了 望能在体内外基因治疗中发挥作用，并为今后禽类腺病毒载体疫苗的进一步研究奠定了基础。另外表达了 蛋白的免疫活性片段，可以为进一步建立 行现地的血清学监测提供技术支撑。 关键词： 毒 ，载体， ，原核表达 is as a （ is of it is as a of to on a . A 611 27 150bp 0 760 （ c） of CR in a 92NA to 93-T by or to a by 07bp c a to by . in of of be in in be as ， I 目 录 1 引言 1 毒概述 1 毒的分类地位及发展历史 1 毒的形态、理化特性 1 毒 生物学特性 2 毒的自然宿主和实验室宿主 3 毒的感染和复制机理 3 毒的检测 4 毒分子生物学研究 4 毒基因组结构及其编码蛋白 4 毒与其他腺病毒基 因结构和功能的比较 4 毒与基因工程载体 6 究目的 7 2 研究报告 8 毒毒株、质粒和细胞 8 要仪器 8 剂及其他材料 8 毒载体的构建 8 毒的复制增殖 8 毒在鸡胚肾细胞和鸡肾细胞传代 8 毒的粗提纯和病毒 提取 9 物的设计与合成 9 c 片段的 增及克隆 9 裂解法提取质粒 9 粒鉴定与测序 10 组质粒 构建与鉴定 10 毒 转移质粒共转染 10 毒的 基因部分片段的原核表达及抗原性鉴定 12 物的设计与合成 12 基因部分片段的 增及克隆 12 组质粒的构建 12 达载体的鉴定 12 基因片段的诱导表达 12 组蛋白的 析 13 果 13 毒细胞传代和鸡胚接种 13 c 片段的 增及克隆的鉴定 13 组质粒 构建与鉴定 16 毒 转移质粒共转染 16 蛋白功能区分析 17 组原核表达载体的构建 18 测重组蛋白 19 组蛋白的 测结果 20 论 20 3 结 论 23 参考文献 24 附 录 28 致 谢 32 作者简介 33 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 1 1 引言 1954 年 人首次报告从鸡胚中分离到一种新病毒，并于 1957 年命名为鸡胚致死孤儿病毒 （ ， 简称 毒 （ et 1957）。该病毒可以引起鸡的包涵体肝炎（ 1963 年， 早报道了鸡包涵体肝炎，发生该病后的一大特点就是病原复杂、感染率高，常与引起禽类呼吸道疾病的病原微生物混合感染， 毒的主要器官是肉用鸡的肝脏，引起肝尖出血。 但是，对于本病毒的研究是从该病毒小仓鼠体内有致瘤性和作为作为病毒载体的研究上深入的。 历史 根据宿主范围，腺病毒大家族可以分为哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。 毒属于腺病毒科，禽腺病毒属，鸡腺病毒 I 型，归于腺病毒 A 群。 毒第一次被发现是在增殖牛皮肤病因子过程中于孵化的鸡胚内分离到的疾病因子（ ， 1949）， 1957 年将其确定为感染致病因子（ et 1957） 。 由于 毒具有禽腺病毒属 内 各种的主要生物学特性及抗原特性， 1982 年国际病毒学分类委员会（ 四次报告把 毒确定为禽腺病毒属的代表种 。此后的研究发现 毒在小仓鼠体内有致瘤性（ et 1965），这是 化特性 毒粒子形态与组成 毒粒子与哺乳动物腺病毒相似， 具有所有腺病毒共有的特性。病毒粒子无囊膜 ，核衣壳的直径约 70二十面体立体对称。线状的双股 et 1971； Li et 1984）。 子每条链的 5端共价结合一个分子量 55 000 的末端蛋白 ；病毒衣壳 是由二十面体上的壳体单位组成的，每个壳体均由衣壳蛋白五联体（ 位和六联体（ 位排列形成，电镜下 252 个壳体单位排列清楚可见（ et 1970）。 毒编码的两个纤突蛋白 和 合在五联体基座上（ et 1996）。 其形态见图 1。 理化特性： 毒对外界不良环境抵抗力较强，对脂溶剂有抵抗力，可耐 热抗酸能力较强，易被甲醛灭活。 度梯度离心发现 毒主要集中在 +/g/密度带上（ et 1971） 。 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 2 图 1 物学特性 或 37 可以凝集仓鼠红细胞 （ I， 1964） 。毒粒子与仓鼠红细胞的吸附是由病毒的涡上突起 凝素主导的 毒的抗血清所抑制（ 度 1:320）， 抗血清 对血凝活性没有影响（ 度 1:10）。 毒的致瘤性 ： 在小仓鼠体内 ， 毒能够诱导产生肿瘤 （ et 1998） 。 且对体外培养的仓鼠肾细胞和人源细胞具有转化能力（ 1972） 。皮下接种和脑内接种均可诱导仓鼠产生肿瘤，这些肿瘤呈现组织学上的脉络丛癌症状，以排列成索状、折叠和乳头装突起的嗜碱性细胞的浸染为主要特征。处于高度有丝分裂期的单个细胞发生缩短、柱状到立方形的变化。 毒的抗原性 ： 毒 六联体组分中的 抗原对禽类来说是血清型特异的，不是群特异的，与禽腺病毒其他血清型不产生交叉反应， 这对于临床诊断过程中 毒的确诊有着很重要的现实意义 。 毒不具有哺乳动物腺病毒共有的群特异性抗原，但含有禽腺病毒共有的群特异性抗原。试验表明， 毒的感染性和 补体结合特性， 具有热稳定性，而血凝活性却对热敏感，说明 毒吸附红细胞的位点与吸附易感宿主细胞的位点不同（ et 975） 。放射性免疫沉淀反应分析显示，热变性的六联体蛋白酶消化片段完全失去了天然蛋白的抗原性，而天然的 胰岛素、胰凝乳蛋白酶和 联体核心能够被六联体特异性抗体沉淀（ et 1986） 。 纤突 （ 五联体（ 六联体 （ 末端蛋白 病毒基因组 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 3 从鸡、鹌鹑、环脖野鸡及海燕的体内均可分离到 et 1989） 。实验室常以仓鼠、鸡等为实验动物进行实验，体外可以感染 人源癌细胞（ et 1964） 、 大鼠的上皮宿主细胞（ et 2003）、 鸡肾细胞 et 2000）、鸡肝细胞和鸡胚成纤维细胞（ 1978） 。研究证明1975） ，并发现 et 1974）， 1993）研究发现 毒主要在禽类的消化道和呼吸道内进行复制，在细胞内复制往往形成包涵体。 、绒毛尿囊膜、尿囊腔接种培养，引起鸡胚死亡或生长迟缓。也可以用鸡胚肾细胞、肝细胞或鸡肾细胞、肝细胞培养，病变细胞表现为细胞变圆、折光性增强、细胞脱落（ 1971）。现在已经培养出适应 毒生长的禽源性细胞系 胞系（ et 1987） ，但主要用于重组腺病毒的构建。 毒感染细胞并进行复制的过程同一般腺病毒一样包括以下几个阶段： （ 1）黏附 ： 腺病毒进入宿主细胞是通过受体介导的胞吞作用完成的。感染过程的第一步是：病毒的晶状结构的纤突球部靠近易感细胞膜上的特异 性跨膜受体 柯萨奇病毒 并与其表面域结合形成高度亲和的复合物，该过程即为病毒吸附过程。 体是一个糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，由两个胞外免疫球蛋白域、一个疏水 螺旋跨膜域和一个胞内区组成，是腺病毒感染易感细胞不可缺少的结构（ et 1999）。 （ 2）病毒进入易感细胞及其 释放：病毒吸附到易感细胞上以后，病毒与质膜的相互作用可诱导许多信号途径。有证据表明，病毒与细胞的吸附激活了 3酸肌醇激酶（ 径，反过来刺激 族、肌动朊的多聚合作用和重组装，从而促进细胞吞粒作用。通过胞吞作用，病毒进入易感细胞，开始是以受体内体或核内体形式存在于宿主胞质内。随后在宿主细胞蛋白酶的作用下，随着 赖性的胞吞囊泡的破坏，病毒粒子进入细胞质，宿主蛋白酶解离五联体降低衣壳的稳定性，六联体衣壳蛋白在细胞中可能存在的胰岛素、胰凝乳蛋白酶或作用下水解成为不同大小的片段（ et 1986） ，其他的相关蛋白也发生分离，病毒衣壳分解，释放 （ 3）病毒 转录和复制 ： 毒复制的方式是半保留复制；释放出来的病毒 毒基因组的早期基因转录翻译成的早期蛋白，与启动子顺式元件共同调控晚期基因的表达及 复制，随之进行结构蛋白等的转录和 制。病毒80K 的末端蛋白与 制起始有关（ et 1983） ； 病毒复制中起重要作用，主要激活宿主与 白的热激反应（ et 2000） 。 （ 4）病毒粒子的成熟与释放 ： 病毒包装过程是在细胞质中完成的 。细胞核内早期蛋白与启中国农业科学院硕士学位论文 引 言 4 动子顺式元件共同调控晚期基因的表达，病毒利用细胞酶合成所需要的包装蛋白，在细胞转运系统的共同作用下，包装蛋白和增殖的子代病毒 细胞核内转到胞质内。在这里，包装蛋白与增殖的子代病毒 包装为子代病毒粒子，最后以细胞裂解或胞吐的方式释放病毒粒子。 目前用于检测 毒存在的方法主要有包涵体检查、病毒分离、电镜检查、病毒中和试验、聚合酶链式反应（ 术、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验（ 前五种方法只能用于实验室检测，对于大型养殖 场的现地检测不适应，发展新的特异性抗原建立快速简单有效的 剂盒检测方法是消除健康鸡体及生物制品中污染的 毒的有效途径。 毒的 列全长 43 804人腺病毒 约 8et 1996） 。病毒 基因组线状双链 有一个 cba 型的独特末端倒转重复序列 （ 确切功能还不知道 ， 据认为其在 制中起着重要作用 （ et 1983） 。基因组 3端序列是保守序列，保守区长度为 50核苷酸序列 （ Li et 1983） 。 毒主要结构蛋白 （如图 2） 有 、 和 、 、 、52K、 100K，其中 和 两种蛋白是 毒独有的 。 图 2 2 of E 区序列 ： 毒与人腺病毒 同的是，它没有可以识别的 。2k 00k B P A 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 5 在 人腺病毒 调控病毒基因表达、 制和病毒 1 区缺乏是 毒的一大特点， 对病毒的转化能力起到主要作用，对于 毒基因组中的其它 否有代替 的功能 还有待 通过基因缺失试验 来证明 。 毒没有与人腺病毒基因组 源的序列的另外一种可能是基因组末端序列发生重排，使 不能检测到 ，并认为是 毒与辅助性腺 联 病毒相互作用的结果 （ et 1996） 。 毒基因组中 含 有许多新的或未注册的 些 0 31000码 22 个 大于 99 个氨基酸残基的蛋白，其功能有待于缺失分析进一步研究，这些新的可能存在与 能相似的读码框 （ et 1998） ，因此，深入研究这些新的读码框就显得非常重要。 毒两端的 毒 间段与哺乳动物腺病毒的序列同源，而两端的22 个 哺乳动物腺病毒的 无任何同源序列。这 22 个 只有 经研究过了。 通过对 筛选研究发现 ， 毒基因 组中右端的 码一种 30该蛋白 具有 与 其他腺病毒 似的生物学特性，即抗凋亡活性，但是与之却没有同源序列 （ et 1979） ； 码一种与视网膜神经胶质瘤蛋白（ 互作用的蛋白，这种蛋白与人腺病毒 白相似 （ et 1997），具有诱导凋亡的活性； 毒的 亡蛋白和 物能激活 径促进细胞从 向 S 期的转化，从而对病毒基因组的有效复制起着至关重要的作用 （ 1999）。 除了上述两个 ，在 因组的两端还有其他几个颇有特色的 中最引人注目的就是 它与细小病毒 因同源，但是它的功能尚不清楚。 通过蛋白水平分析 毒基因组序列， 对 9 等十几个读码框的功能作了推测（ 2003），为进一步研究这些基因的功能有着极为重要的指导意义。同时，他们还发现了两个新 认为它们 能够编码蛋白，为其 它 毒毒力基因 究发现 编码纤突蛋白的基因区与禽腺病毒的毒力和抗原性有关（ et 1996） 。 毒的两个 因在每个涡上表达两个 白 ， 一个长 的 ，一个短 的 ，而且这两个蛋白的多肽图谱是不同的 （ 1995）。 对 毒 纤突蛋白功能分析表明， 基因 对病毒增殖、组装或扩散的某个阶段是必须的，因为缺失 基因 不能产生病毒粒子；而 基因 则对 毒的体 内生物学的表现至关重要，缺失 基因 后会造成病毒产量下降，导致柯萨奇病毒和腺病毒受体（ 特异性转导作用消失，使毒只能感染禽类细胞，不能感染哺乳类动物细胞 ， 失去野生型病毒表现出的特异性转化作用 （ 2001） 。 在腺病毒结构中 纤突蛋白在病毒扩散中是重要结构蛋白，也是病毒刺激宿主产生抗体的主要蛋白，能诱导产生血清中和性抗体 ，在纤突头部还具有血凝素（ 殷震 等，1997） 。 毒 端倒转重复序列 毒 端 具有末端倒转重复序列（ 哺 乳动物腺病毒的 （ et 1982； et 1983）。 有资料证明 ， 腺病毒 制起始发生在末端 75 个 末端附近 （ et 1983）；对 毒来说 ，中国农业科学院硕士学位论文 引 言 6 其基因组两端末端倒转重复序列 54是病毒 制的起始点 ， 也是复制包装必需的顺式作用元件。 可以利用 毒两端包装信号、 腺联病毒（ 末端重复序列（ 建成腺病毒微载体（ 这是一种新型的无病毒基因的载体 （ et 2000）。 毒的 因 和 白： 毒 因序列已经报道（ et 1986）， 重要的 翻译调控因子 ， 它通过封闭细胞 内的由 干扰素诱导的蛋白 激 酶 （ 性 来 中和干扰素抗病毒 作用 （ et 1996） 。 毒的 白在病毒 装过程中起到重要作用 ， 并且这种作用是型特异性的 （ 2001）。 近年来，腺病毒载体成为基因治疗和重组疫苗研究方面的热点。随着分 子生物学的进一步深入，腺病毒基因组结构、复制、转录的特征也已研究得相当清楚，一些人腺病毒特别是 为载体的研究表明在腺病毒基因组特定区域插入外源基因，不影响病毒复制而能使外源基因良好表达，腺病毒作为活载体应用较为安全。已经发展为基因免疫和基因治疗的转移载体（ et 1999； et 2000； et 2000）。动物腺病毒如牛、绵羊、猪、犬和禽类等腺病毒已开始进行深入研究，并取得较大进展（ et 1999； et 999； et 2000）。禽腺病毒 基因组结构、复制、转录的特征大部分也已经研究清楚（ et 1996 ； et 1998）。 随着对 毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识的不断深化， 对 该病毒 的研究 逐渐 转 向实用 型 载体 开发工作上。 腺病毒载体研究过程中存在的问题是载体的安全性、靶向性和有效性 。 毒的 与 柯萨奇病毒和腺病毒受体（ 特异性转导作用 的关系表明，可构建 具有靶向特异性的载体，使疫苗具有更好的安全性和靶向特性；而较大的基因组确保可以插入较长的外源目的片段。病毒及载体可在鸡胚中增殖，这样在临床应用的过程当中更简便节省。 毒 作为基因工程载体在基因水平上的研究： 重组腺病毒的构建方法通常有三种，第一种方法是于真核细胞内在两段重叠的病毒 段之间同源重组，这个过程较难，且重组病毒 量稀少。第二种方法是在真核细胞中两个质粒之间应用同源重组，一个含有完整的病毒基因组，并且有足够的外源 止它包装；另一个带有经过预期的修饰（插入、缺失）的同源序列经两 侧到病毒基因组必须修饰的区段。第三种方法是直接通过体外分子克隆的方法构建嵌合病毒。 毒载体的构建策略可以按照第二种方法，先构建带有多克隆位点（ 报告基因和 毒基因组某段早期序列的穿梭质粒，将外源基因的表达盒插入右侧 之间；再构建含非必需区基因缺失后的环状腺病毒 粒；最后外源基因的穿梭质粒与带有环状腺病毒 粒共转染包装细胞，同源重组获得重组腺病毒。 大肠杆菌内同源重组法获得 的 毒的基因缺失重组突变体 的研究发现 ，缺失 基因组左端 938可 从辅助菌中得到复制所需的多种调节因子；右端 40065（ et 1999） ；带有荧光表达单位 （如达单位 ） 具有复制能力的 体已经研制成功， 首次在鼠肿瘤细胞中表达携带在 毒载体上的 因，并且首次在 体感染的鸡胚尿囊液中检测中国农业科学院硕士学位论文 引 言 7 到人的 因的表达及该蛋白的富集 （ et 2002） 。有人利用柯斯质粒构建腺病毒载体的方法构建的重组病毒也 具有产生感染性粒子的能力，并且估计其基因组在 胞中是稳定的。缺失 毒右端 间 3620片段，插入约5外源 影响 毒载体的复制。将 两段基因分别插入 毒的右端 D 片段，并且使该基因与 合 ， 由 动子调控感染 胞，结果证明重组 重组蛋白也能从 体中表达并且具有完全的功能 （ et 2001）。 毒作为基因工程载体的应用前景： 利 用 毒载体重组表达肿瘤抑制因子 测其在体外人的肿瘤细胞内和体内异种移植物内的活性，结果显示该载体可以携带外源基因进入各种器官，而这些器官往往对人的腺病毒产生免疫反应。同时重组腺病毒 然保存了 肿瘤抑制活性（ et 2004） 。 毒能插入的外源基因是有限的，而构建只含有腺病毒末端倒转重复序列、包装信号及中间的转基因表达盒的重组腺病毒载体的产生 ， 对发展新的基因治疗方法的载体有极其重要的意义。 禽类疾病防治中，基因工程载体疫苗的制备可以应用 制型 病毒 或复制缺陷性病毒作为载体，该病毒可感染禽源性细胞并在其中增 殖 ，研究表明 毒及突变载体能够在来源于禽类细胞的 胞系上复制增殖 ，最新的研究表明利用 毒重组表达感染性法氏囊病病毒的 白可以在鸡体内诱导产生对传染性法氏囊病病毒的保护（ et 2004）。因为 毒右端区段 （ 40 06584允许插入较大的外源片 段，已经成为当前研究的热点之一 ， 利用这一区域构建 毒基因转移载体，为 毒作为基因转移工具提供 了 条件，毒及 其 载体可在廉价的鸡胚中得到大量复制，因此， 可以预 料 毒 载