【毕业学位论文】（Word原稿）小麦抗条锈病基因YrSp的分子标记研究植物病理学硕士论文

密级 ： 论文编号 ： 中国农业科学院 学位论文 小麦抗条锈病基因 分子标记研究 of to F of to 要 我国小麦条锈病危害普遍而严重， 培育和应用抗病品种是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。 由于条锈病菌的高度变异性以及生产品种中抗条锈基因较为单一，品种抗病性“丧失”成为小麦条锈病防治中的突出问 题。小麦品种 欧洲小麦条锈菌鉴别寄主，其所具有的抗条锈病基因 有较好的抗性，可抗当前我国大多数小麦条锈菌生理小种，但在我国小麦育种中还很少应用。因此，开展抗条锈病基因 分子标记研究，将促进 因在小麦抗锈育种中的应用， 并有助于实现多基因聚合育种，对于逐步实现小麦生产品种抗病基因多样化具有重要意义。 本研究采用 析方法， 以小麦抗条锈病基因 供体亲本 等基因系 、轮回亲本 及由 和 杂交制备的 分离群体为材料，开展了小麦抗条锈病基因 分子标记研究，取得了如下主要结果： 1采用 225 对 物组合，对 、 三组材料进行分析，发现 12 条稳定出现的多态性 段。经用 10 株感病 单株和 10 株抗病 单株 进行遗传连锁性初步检测， 确定 了 分别由 4 条引物扩增的 6 条多态性片段与 因有连锁性 。 2 将多态性片段 序，并根据序列设计特异性引物。将其中的 记，即 3 用 208 株 和 x 杂交制备的 分离群体，对获得的 3 个 记 间的 遗传关系进行了检验。 用 件计算各个标记与目的基因间及各个标记间的遗传距离 及相互关系，绘出了 4 个标记的遗传连锁图， 4个标记 位于目的基因的一侧，其中 目的基因相距最近（ 2.9 其余 3 个标记由近到远依次是 3.8 和 18.6 关键词 ：小麦，条锈病，抗病基因， 子标 记 f. is is to “of of a in of of of of in is of to of in of of be to of in In as as as 1. A 25 of , NA to 2. NA 34in T to of of i. e. 3. SR 08 2 a . by on of to 2.9 3.8 18.6 录 第一章 引 言 . 1 麦条锈病的防治及抗病基因的研究和利用 . 1 麦条锈病的发生和防治 . 1 麦抗条锈病基因的研究和利用 . 3 子标记技术的发展和应用 . 5 子标记技术的发展 . 5 子标记在小麦遗传学研究中的应用 . 7 麦抗条锈病基因的分子标记研究进展 . 10 记 . 10 记 . 12 记 . 12 记 . 12 记 . 13 项研究的选题依据及意义 . 14 第二章 材料与方法 . 15 验材料 . 15 麦材料 . 15 麦条锈菌菌种 . 15 剂及仪器 . 15 剂 . 15 器设备 . 16 究方法 . 16 因组 提取 . 16 验程序 . 17 物的电泳检测 . 18 态性 段的克隆 . 19 列测定及特异引物合成 . 21 传连锁性检验及遗传作图 . 21 第三章 结果与分析 . 24 麦基因组 提取 . 24 析及多态性 段的遗传连锁性初步检测 . 24 态性分析 . 24 传连锁性初步检测 . 28 麦抗条锈病基因 记的建立 . 29 态性 段的克隆 . 30 列测定及引物设计 . 30 V 记的遗传连锁性检验 . 32 传作图 . 34 记的品种检测 . 35 第四章 讨论 . 37 麦抗条锈病基因 分子标记研究 . 37 记向 转化 . 37 态性分析中值得注意的问题 . 38 第五章 结论 . 40 参考文献 . 41 致 谢 . 46 作者简历 . 47 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 1 第一章 引 言 麦条锈病的防治及抗病基因的研究和利用 麦条锈病的发生和防治 麦条锈病的发生概况 小麦条锈病（ f. 一种常见的小麦叶部病害，可造成严重的产量损失。由于小麦条锈菌喜凉怕热，主要在纬度较高或海拔较高的地区越夏，因此该病在高纬度或高海拔地区危害尤为严重。 但小麦条锈病是一种典型的气传病害， 所以它能够在越夏区和与之毗邻的小麦种植区间流行，危害范围遍布世界各地。截至目前，全球几乎所有小麦种植区均有小麦条锈病的发生。在国外，此病害在西欧被认为是 20 世纪中期发生和危害最大的作物病害之一。由于成功地利用小麦的成株抗性、持久抗性和高效药剂，近几十年来，此病害在西欧已不是生产上的主要问题。伊朗自 1991 年以来，条锈病发生流行比较频繁，特别是由于气候条件适宜造成了 1993 年和 两次大流行；在土耳其的安纳托利亚高原东部冷凉地区，此病害是最严重的病害；小麦条锈病于 1979 年和 1980 年在澳大利亚和新西兰 被发现后，现已成为危害小麦生产的重要病害（万安民， 2000）。 我国是一个产麦大国，同时也是小麦条锈病发生最为广泛的国家之一，小麦作为我国主要的粮食作物，每年都在遭受不同程度的条锈病害的侵袭。据记载，上世纪 50 60 年代，条锈病分别于 1950 年和 1964 年发生两次大的流行，发病面积均在亿亩以上，分别造成小麦减产 60 亿 32 亿 70 80 年代，小麦条锈病又在甘肃、四川、陕西、青海、河南、湖北等省的越夏、越冬关键地区频繁流行。据不完全统计，此期间条锈病在上述地区引发的中等以上流行就多达 6 9 次，受害面 积 2,000 3,000 万亩；比较大的有 3 次，分别发生在 1975、 1983 和 1985 年，并波及黄淮麦区，三次损失都造成了小麦减产 10 多亿 入 90 年代，由于新优势小种上升，导致当时的主栽品种抗锈性部分或全部丧失，条锈病的发生更加频繁。 1990 年，西北和黄淮麦区经历了一次条锈病大流行，发病面积 (含部分叶锈病 )近 亩，直接造成的小麦产量损失达 1991 年在山东、河南、湖北、陕西、甘肃、宁夏 6 省继续流行，发病面积达 9,800 多万亩(含部分叶锈 )，因防治及时，损失为 振岐， 1998）。 2002 年，条锈病再次在中国小麦主产区大流行，虽防治及时，但仍造成十几亿 小麦减产（万安民等， 2003）。近几年，小麦条锈病发生面积每年都有几千万亩，主要在四川、重庆、甘肃、云南、陕西南部、湖北西北部、河南南部等地，并威胁着东部广大麦区。 麦条锈病的防治及存在的问题 小麦条锈病可籍气流作高空远距离传播，分布范围广，流行性强，发生历史悠久，危害严重。对该病的防治必须采用“以种植抗病品种为主，药剂防治和栽培防治为辅”的综合防治策略和措施。化学防治具有立竿见影的效果，能在短期内对大 面积发生的病害进行有效的控制。但化学药中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 2 剂的大面积使用会给人类健康和环境带来严重后果，因此在使用农药的过程中，必须注意要根据病害的预测和经济阈值的研究结果合理用药，同时注意防止病菌、寄主抗药性的产生和增长。合理应用栽培措施可减少越冬越夏菌源，巩固和提高品种的抗锈性，增加产量。但必须考虑到由于农田生态系统的改变，可能会导致田间有害生物类群及数量的变化，从而造成新的病害或原先的次要病害上升为主要病害。 应用抗病品种是控制小麦条锈病的一项经济有效的措施，也是小麦育种的主攻目标之一。 20世纪 50 年代以来几次大的条锈病 流行，都以大面积抗性品种的推广而得以较长时期控制。加强小麦抗病品种的选育和加大抗病品种的推广力度是持续控制条锈病的一项重要措施。 新中国成立以来 ，我国各地先后分别育成一批又一批的抗锈良种，其中在不同时期推广面积较大的有碧蚂 1号、农大 183、石家庄 407、济南 2 号、北京 8 号、石家庄 54、丰产 3 号、泰山 1 号、徐州 15、东方红 3 号、农大 139、北京 10 号、丰抗号 系列 、鲁麦号 系列 、绵阳号 系列 、陕 7859、冀麦 30号、豫麦 13 号 、繁 6源 11 系 等， 这些品种 对控制条锈病流行和稳定小麦生产都起过重大 作用（李振岐和 曾士迈， 2002）。 然而，由于传统育种中对抗病材料的筛选借助于表型鉴定，对不同抗病品种所含的抗病基因缺乏有效的基因鉴别手段，导致在同一时期大面积推广的品种中，抗病基因单一化。而生产上抗病基因的单一化，加速了病原菌的定向选择和优势生理小种的形成，从而 哺育新小种的 发生 和流行 ，使抗病基因迅速丧失抗性（牛永春和吴立人， 1997）。 截止目前，我国已有七批品种的条锈病抗性相继丧失。第一批发生在 1957 1963年，条中 1号 (出现使以碧蚂 1号为代表的抗病品种丧失抗性；第二批发生在 1960 1964年，条中 8号（ 条中 10号 (出现，使玉皮和甘肃 96号等品种丧失抗性；第三批发生在 1961 1964年，条中 13号 (出现使南大 2419等抗病品丧失抗性；第四批发生在 1972 1975年，条中 17号 (、条中 18号 (北京 8号、阿勃系列品种丧失抗性；第五批发生在 1976 1985年，条中 19号 (、条中 23号 (条中 25号 (出现使以丰产 3号、泰山 1号和阿夫为代表的品种丧失抗性；第六批发生在 19861992年，条中 28号 (条中 29号 (的出现使洛夫林 10号、洛夫林 13号等品种丧失抗性（李振岐和曾士迈， 2002）。近几年，随着毒性谱更宽的新的生理小种条中 30号（ 条中31号（ 条中 32号（ 出现及其频率的迅速增加，强致病菌系 1类群的迅速扩展，使原本抗条锈病的“繁 6”及其衍生系以及“水源”衍生系品种丧失抗性。当前我国小麦生产上的主栽品种仍是以“洛类”衍生系、“繁 6”衍生系、水源系和扬麦系为主。一旦条件适宜可能引起条锈病大爆发，给小麦生产造成重大损失（吴立人和牛永春， 2000）。 由于条锈菌某一特定生理小种的产生和发展依赖于一定面积的哺育品种，只有当某一品种大面积地单一化种植或某一抗病基因的大面积单一化应用，才会有病菌优势小种的形成和发展，最终导致品种大面积丧失抗性。因此，只有在生产上实现小麦品种抗病基因的多样化，病菌少数毒性变异菌系的产生和发展才会受到抑制，小麦与条锈菌互作的生态体系就会比较稳定。根据这一寄主 持续控制我国的小麦条锈病，保证我国小麦生产的持续稳步发展，其中最重要的措施之一就是要做到生产上小麦品种抗病基因 的多样化。 而 要实现小麦品种抗条锈病基因的多样化， 就 必需 对现有 的抗源 材料中的 抗病基因 有足够的认识 。只有了解抗源的基因背景和抗病基因的特点，才能对其充分与合理 的加以 利用。 另外从当前的育种实际看，仅携带一个主效抗病基因的抗性品种很容易丧失其抗病性，因此聚合育种将中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 3 成为今后小麦育种的重要发展方向之一。然而， 传统上育种材料的筛选 都是基于植株的表 型 性状进行的 ，依靠 自然发病或者借助繁琐的接种鉴定，不仅时间长，而且环境影响因素多，可靠性差，不能鉴定单基因，更无法鉴定和筛选含两个以上抗病基因的材料，因而极大地限制了抗病基因鉴定 和抗病品种选育的进程。 麦抗条锈病基因的研究和利用 麦抗条锈病基因的研究现状 小麦抗条锈病基因包括主效基因和微效基因，主效基因是抗条锈病的主要武器。 截止到目 表 1已正式命名的小麦抗条锈基因 to 因 连锁基因 染色体位置 起 源 抗性类型 代表品种 2. 66 7B T. 1B T. 3 1B T. 6 1B T. 6B T. 6B T. 6 2. T. 7. . M/2D . 7/51 1. T. T. T. T. 1. T. 2. e. . 3R 5B 6D T. 1B T. 4D T. 6D T. 1. 1D T. 1. . T. 4. . 3. 5 . 2. . 5. 注：据 et 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004； S:苗期抗性； A：成株期抗性 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 4 前， 已正式命名的 小麦抗条锈病 主效 基 因位点共 34 个（表 1这些基因 绝大多数来自普通小麦，只有一少部分来源于小麦的近缘属（种） (et 1998)。如， 于六倍体斯卑尔脱小麦 （ ，这个种现已归为普通小麦（ T. .）； 自顶芒山羊草（ T. 前称 于黑麦，通过染色体代换或易位而转移到普通小麦中； 于四倍体二粒小麦（ T. 于偏凸山羊草 （ T. 前称为 ； 能是来自在顶芒山羊草与普通小麦中 表 1分暂定名小麦抗条锈病基因 to 因 染色体位置 基因来源 B A A D B A A 6 . A A B A B B B D A D B ： 据 et 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004 表 1麦抗条锈主效基因的染色体定位 of 染色体 抗病基因 染色体 抗病基因 染色体 抗病基因 1A B D A 2B D A B D 4A 4B D A B D A B D 7A 7B ,7D ： 据 et 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004 国春杂交过程中用来干扰同源染色体配对的斯卑脱戴斯山羊草 T. 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 5 以前称为 我国的八倍体小麦中四和远中 8 号携带的抗条锈基因可能是来自天兰偃麦草 ( 李振岐和曾士迈 ， 2002） 。这 34 个抗条锈病基因中， 苗期抗病基因 ； 成株期抗病基因 ， 条锈基因的抗病类型不详。 除了已经正式命名的抗条锈病基因外，还有一部分暂命名抗条锈病基因， 如 。部分暂命名的抗条锈基因见表 1 目前已有 50 多个抗条锈病基因被定位在染色体上（表 1个别基因已经被确定在染色体臂上。其中， B 组染色体中存在的抗条锈基因较多，有的染色体上多达十几个。 A 组和 D 组染色体中所含的抗条锈基因较少。 麦抗条锈病基因在生产中的应用 我国的抗锈育种中曾经 利用的小麦抗条锈病基因有 。其中含 因的品种有碧蚂 1 号、西北 54 号、北京 8 号、金光、抗引 655 等；含 因的品种有清山 782、川麦 26 等；含 因的品种有丹麦 1 号、里勃留拉、 811(3)和 ；含 因的有水源 11、天选 38 和天选 40 等；含 因的有金光、小偃 6 号、 利亚、特德和 ；含 因的如阿夫；含有 因的品种最多，有洛夫林 10、洛夫林 13、 偃师 9 号、丰抗 8 号、京核 1 号、京农 79麦 23、秦麦 9 号、天选 37 号、成良 6 号、兰天 1 号等；另外早熟 3 号含有 核 1 号除含 可能还有（王风乐等， 1994）。 近几年 部分含 品种已经育成，如贵农 21 和贵农 22，但数量较少。 由于在同一时期大面积使用单一品种或单一抗源，增强了病菌致病基因变异的定向选择压力，使新的小种不断产生。绵阳系列虽然聚合了诸多不同抗源，其中包括一些其它麦区未使用过的抗源如 ，能抗更多小种。但随着其播种面积的不断扩大，及毒性 谱更宽的新的生理小种条中 30 号（ 条中 31 号（ 条中 32 号（ 出现及强致病菌系 群和水源 11 类群的迅速扩展，该系列品种也丧失了抗性。当前我国小麦生产上的主栽品种仍是以“洛类”衍生系、“繁 6”衍生系、水源系和扬麦系为主，面临严重的抗性危机，一旦条件适宜可能引起条锈病大爆发，给经济造成重大损失（吴立人和牛永春， 2000）。 要改善小麦生产中的这种状况，重要的措施之一就是提高生产品种中抗病基因的丰富度。目前，有不少有效的抗条锈基因尚未在我国小麦生产上很好利用， 如 （吴立人和牛永春， 2000）。合理地利用这些优秀的抗病资源，实现抗病基因的多样化，将会阻止病菌的繁殖和积累，从而减少病原菌的适应机会，使抗病品种的抗性得以持久化（ et , 1993）。 子标记技术的发展和应用 子标记技术的发展 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 6 遗传标记是指可以明确反应遗传多态性的生物特征，可以帮助人们更好的研究生物的遗传与变异规律。分子标记 作为遗传标记的一种， 是 平 上遗传多态性的直接反应，表现为核苷酸序列的任何差异，在数量上几乎是无限的。与以往的遗传标记相比，分子标记有许多特殊的优点 。 如 ： 不受环境影响和基因表达与否的限制；变异丰富，标记数量多；表现为显性或共显性遗传，有利于对隐性基因的选择等。 （ 1980）首先提出了 制性片段长度多态性（ 以作为遗传标记，从此开创了分子标记的新纪元。 一种利用放射性同位素（通常用 某些非放射性标记（如 地高辛等）探针，与转移于支持膜上经限制性内切酶消化的基因组 交，通过显示酶切片段的大小，来检测不同遗传位点等位变异的一种技术。 记具有共显性的特点，可以区别纯合基因型和杂合基因型，能够提供单个位点上的较完整的资料，而且稳定 性 、重复性强 。但是 析 对 求量较大（ 5 10g），操作也比较繁琐，接触放射性存在一定危险性，且费用高。另外 ,普通小麦的 态性非常低，一定程度上限制了该技术在小麦遗传研究中的有效利用。 1990 年， 明了一种快速、有效的分子标记体系 。 术为基础 ， 通过单引物扩增在全基因组水平上检测 异。 其原理是利用寡核苷酸随机引物对基因组 行 增，产物通过凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，从而显示扩增产物 段的多态性。如果基因组在这些区域发生 段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定位点分布发生变化，从而使 物增加 、 减少或分子量变化。通过对 物分析得到基因组 这些点的多态性。 与 记相比， 记无种属特异性 ， 不需要 制备克隆、探针标记和分子杂交 ， 且 量少，因此被广泛应用于各种生物的基因组学研究 (et 1999)。 但 定性差， 而且由于采用的引物 较低，扩增结果易受外界条件的影响，重复性 较 低。另外由于 显性标记，不能区分杂合和纯合基因型 。 荷兰 司的科学家 1993 年发明了一种 纹技术 , 后来由 展起来（ et 1995）。 记技术 的原理是，用两种能产生 粘 性末端的限制性内切酶将基因组 成分子量大小不等的限制性片段，然后将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头连接，所形成带接头的特异片段用作随后的应的模板。所用的 物 5端与接头和酶切位点序列互补， 3端在酶切位点后增加 13 个选择性碱基，使得只有一定比例的限制性片段被选择性的扩增，从而保证 应产物可经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分辨。 与 记相比， 记更能高效的揭示基因组中的变异。一般，每对 物可扩增产生 50 100 条片段 ， 且大部分 段与基因组中的特定位点对应。另外， 记呈典型的孟德尔遗传 ， 多态性高 ， 稳定性好 ， 可在短时间内对大量的 品进行检测（ et 1996）。目前， 记已广泛应用于抗病基因的分子标记、遗传