【毕业学位论文】（Word原稿）主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体的构建及其抗肿瘤作用探讨-医学临床医学博士论文

博 士学位论文 主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体的构建及 其抗肿瘤 作用探讨 （ 本课题受 国家 863计划 资助，项目编号 2008 姓 名：孟淑燕 学 号： 0710110029 所在院系：医学院 学科门类：临床医学 学科专业：内科 指导教师：周彩存 教授 二 一年五月 A in 2010 0710110029 of by a 863 （ 主动 靶向 肿瘤的紫杉醇脂质体的构建及其抗肿瘤作用探讨 孟淑燕 同济大学 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关 于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年 月 日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月 日 同济大学 博士学位论文 摘要 I 摘要 背景 化疗 是晚期肿瘤主要的治疗手段之一， 紫杉醇由于其具有独特的稳定微管作用而被广泛应用于 肺癌 、头颈癌、 卵巢 癌、 乳腺 癌、子宫颈癌等的治疗。但 紫杉醇是一种脂溶性药物，在水和一般药用溶酶中溶解度都极低，市售紫杉醇制剂多采用聚氧乙基代蓖麻油（ L）和无水乙醇作为混和 溶媒 ，因此导致严重过敏反应的发生。即使采用大剂量的激素和抗组胺药物进行化疗前 的 预处理，还是不能杜绝此类不良反应的发生。目前的制剂还 存在缺乏靶向性及相容性 、稳定性等问题， 因此迫切需要研制出一种紫杉醇 的 新 剂型克服上述不足 。 目的 本 课题旨在研发一种新型的具有主动靶向肿瘤能力的紫杉醇脂质体，在改善紫杉醇物理溶解度的同时，增强其特异性的抗肿瘤作用，降低药物对正常组织的损伤。 方法 1. 采用 记了 20 个针对肿瘤新生血管和肿瘤细胞的短肽，与细胞孵育后采用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪检测相对荧光强度，筛选多肽。 2. 设计并合成了三种靶向多肽接枝物，制备了主动靶向的荧光脂质体，与血管内皮细胞和肿瘤细胞孵育后采用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和荧光分 光光度计检测相对荧光强度，筛选接枝物。 3. 建立 测紫杉醇浓度和包封率的方法，采用专属性实验、精密度实验和回收率实验证实该法的稳健性和可靠性。同时根据紫杉醇包封率的高低筛选紫杉醇脂质体的最佳配方。 4. 采用薄膜超声分散法合成主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体，确定粒径控制和保存工艺，并进行理化性状的表征。 5. 采用细胞组化、免疫组化及 测 胞、 裸鼠移植瘤中整合素 V 和 表达，采用细胞摄取实验、细胞毒性实验和体内抑瘤实验观察主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体的抗肿 瘤疗效；并行血液分布检测，观察其体内缓释效果。 6. 采用细胞生长抑制实验、划痕实验及组织芯片行移植瘤微血管表达情况检测观察多肽 16 抑制肿瘤及血管生成能力的强弱。 结果 1. 荧光倒置显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪检测结果均显示 记的多肽 有最佳的与细胞特异性识别力和结合力。 2. 荧光倒置显微镜、同济大学 博士学位论文 摘要 式细胞仪和荧光分光光度计检测结果均显示，采用 为接枝物的靶向脂质体具有最佳的生物学活性，其中 。 3. 专属性实验、精密度实验和回收率实验证实 测紫杉醇浓度的方法稳健可靠，最佳色谱条件为 甲醇 ： 水（ V/V 80： 20） ；紫外 检测波长 ： 227流速 ： 1ml/究还表明超滤离心法可作为检测紫杉醇脂质体的包封率的方法，紫杉醇脂质体配方为 :1:杉醇与总脂的摩尔比为 1： 33 时紫杉醇包封率最高。 4. 构建的主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体采用挤出法控制粒径，真空冷冻干燥法进行保存。粒度分析示脂质体粒径均在 100下，复溶后第 90 天紫杉醇的包封率仍在 95%以上，稳定性良好，且无菌、无热源。 5. 胞、 裸鼠移植瘤中整合素 V 和 表达均呈阳性，细胞摄取实验显示紫杉醇摄取率 杉醇脂质体组； 色法显示 杉醇脂质体组；体内肿瘤抑制实验显示抑瘤率 杉醇脂质体组；血液分布示 紫杉醇脂质体 均具有良好的体内缓释作用。 6. 细胞抑制率实验显示 胞的抑制率多肽 肽 肽 2 与 相对较强的抑制肿瘤细胞生长的能力，但两者间的差异不大，多肽 细胞的抑制力较弱。组织芯片检测显示 子表达减少，提示多肽 能具有较强的抑制新生血管形成的能力。 结论 本研究制备的主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体 改善了紫杉醇的溶解度，增强了其特异性抗肿瘤作用，是一种极有前景的紫杉醇新剂型。本研究采用的多肽双靶点策略较之传统的单靶点策略具有更好的肿瘤细胞识别能力和亲和力，该策略可被进一步应用于肿瘤的早期诊断和靶向治疗领域 。 关键词： 肿瘤，紫杉醇，脂质体， a in of a of to of is in a EL L to be a of a a of in a to by at 1. 0 or 549 by to to 2. of by to 3. of to of in to 4. of of 5. of V 549 of in to V to in of 6. of 2, P4 16 by 1. 16 to 549 2. to be a of 3. of to be an to of in C: :1:in 4. by to of 00of in 5% 0 of in to be be 5. V 549 in in of in L 6. 16 2 4 in in of 16be a of of 16. of as a in be a to 济大学 博士学位论文 目录 V 目录 第 1章 绪论 . 1 . 1 性 . 1 媒对紫杉醇药代动力学的影响 . 2 媒对紫杉醇疗效的影响 . 3 媒的稳定性和相容性问题 . 3 瘤主动靶向载药纳米粒的研究现状 . 3 米、纳米技术的定义和纳米药物的优势 . 3 药纳米粒性能相关参数 . 4 用载药纳米粒的种类与特性 . 5 向给药系统定义与分类 . 7 动靶向肿瘤表面修饰药物载体的常用靶分子 . 8 杉醇新剂型的研究现状 . 11 文研究内容 . 12 第 2章 靶向肿瘤的特异性多肽设计、合成与筛选 . 13 验材料 . 13 胞和试剂 . 13 液配制 . 13 器设备及耗材 . 14 验方法 . 14 瘤靶向多肽序列设计 . 14 光标记肿瘤靶向多肽的合成 . 15 胞传代、冻存和复苏 . 16 光倒置显微镜观察多肽与细胞结合力 . 16 式细胞仪初筛多肽与细胞结合力 . 17 式细胞仪观察多肽（ 细胞的结合力 . 17 光酶标仪观测多肽（ 细胞结合力 . 17 验结果 . 17 瘤靶向多肽的合成 . 17 光倒置显微镜观察多肽与细胞结合力 . 18 同济大学 博士学位论文 目录 流式细胞仪初筛多肽与细胞的结合能力 . 19 式细胞仪结果 . 20 光酶标仪检测结果 . 21 论 . 22 章小结 . 26 第 3章 脂质多肽的设计、合成与筛选 . 27 验材料 . 27 剂和细胞 . 27 器设备和耗材 . 27 验方法 . 27 质多肽设计与合成 . 27 胞传代培养 . 28 光脂质 体的合成 . 28 光脂质体与细胞结合实验 . 28 验结果 . 29 质多肽接枝物的筛选 . 29 光脂质体与细胞结合力检测 . 31 论 . 33 章小结 . 35 第 4章 紫杉醇脂质体包封率的检测及配方筛选 . 36 验材料 . 36 品、试剂和细胞 . 36 器设备和耗材 . 36 验方法 . 36 白脂质体及紫杉醇脂质体的制备 . 36 测紫杉醇浓度方法的建立 . 37 果 . 38 属性实验 . 38 杉醇标准曲线 . 39 内变异率、日间变异率和回收率 . 39 杉醇脂质体包封率 . 39 论 . 40 章小结 . 43 第 5章 主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体的构建及表征 . 44 同济大学 博士学位论文 目录 验材料 . 44 剂、药品和细胞 . 44 器设备和耗材 . 44 液配制 . 44 验方法 . 45 紫杉醇脂质体的制备 . 45 速银染法检测多肽 . 46 紫杉醇脂质体表征 . 46 计学分析 . 48 验结果 . 48 动靶向紫杉醇脂质体示意图 . 48 干样品外观图 . 48 速银染 . 49 射电镜形态表征 . 49 描电镜形态表征 . 50 径检测 . 50 紫杉醇脂质体包封率及稳定性检测 . 51 动靶向紫杉醇脂质体无热原检测 . 51 动靶向紫杉醇脂质体无热原检测 . 52 外释放实验 . 52 论 . 53 章小结 . 55 第 6章 主动靶向肿瘤的紫杉醇脂质体抑瘤作用评估 . 56 验材料 . 56 剂、药品和细胞 . 56 验动物 . 56 器设备和耗材 . 56 液配制 . 57 验方法 . 58 胞免疫化学 . 58 瘤组织免疫化学 . 58 白检测 . 59 胞内吞实验 . 61 胞毒性试验 . 61 同济大学 博士学位论文 目录 体内抑瘤作用评估 . 62 液分布 . 62 计学分析 . 62 验结果 . 62 胞免疫化学 . 62 织免疫化学 . 63 . 64 胞内吞实验 . 65 胞 测 . 65 内抑瘤实验 . 66 液分布检测 . 68 论 . 69 章小结 . 71 第 7章 靶向多肽功能检测 . 72 验材料 . 72 剂、药品和细胞 . 72 验动物 . 72 器设备和耗材 . 72 液配制 . 72 验方法 . 73 胞生长 抑制率检测 . 73 胞划痕实验 . 73 向紫杉醇脂质体抑制肿瘤血管生 成 能力 检测 . 73 验结果 . 74 胞生长抑制率 . 74 胞划痕实验 . 75 织芯片检测 . 76 论 . 78 章小结 . 80 第 8章 结论和展望 . 81 论 . 81 续工作展望 . 82 致谢 . 84 参考文献 . 85 同济大学 博士学位论文 目录 录 A 中英文缩略词表 . 94 附录 B 氨基酸缩写表 . 96 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果 . 97 第 1 章 绪论 1 第 1 章 绪论 近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率呈明显上升趋势，已经成为威胁人类健康和生命的主要疾病。国际癌症研究机构的报道显示， 1975 年到 2000 年间，全球癌症病例数增长了一倍，每年新发病例约 1200 万，死亡患者超过 700 万。2010 年癌症将跃居为全球的首要死因， 2030 年肿瘤患者人数将为现在的三倍，新发病例数将增至 2000。 化疗是恶性肿瘤综合治疗中的主要手段之一，合理的化疗策略可显著延长肿瘤患者的生存时间，极大改善患者的生存质量。 但目前常用的各种化 疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也可造成巨大的损伤。毒副反应的出现是往往是限制药物剂量和使用的直接原因，其产生主要与化疗药物缺乏靶向性有关，某些毒副反应的产生也与药物的药代动力学和药效动力学行为欠佳及药物辅剂毒性相关。因此新型化疗药物的