【毕业学位论文】（Word原稿）小麦耐盐相关性状的QTL分析作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小麦耐盐相关性状的 析 TL TL I 摘 要 土壤盐渍化是影响作物产量和品质的自然逆境之一，培育耐盐品种是有效利用盐渍化土壤的一条根本途径。 中国有盐渍化和次生盐渍化土地 4 千万 我国耕地的 1/10 左右 ， 严重影响了粮食产量，成为限制农业生产的主要因素。 小麦是我国第二大粮食作物 ， 对耐盐相关基因进行精确定位对于培育耐盐碱品种起着非常重要的作用。 本研究选用耐盐性达一级的品种德抗 961(高产品种太空 6 号 (行杂交 ， 以杂交形成的 186 个 株 、 160 个 家系 为试验材料，其中 家系 及其双亲 为耐盐性评价群体。采用 子标记构建部分遗传连锁图。使用水培法对 家系 通过发芽率、苗高、根长及鲜重四个性状进行苗期耐盐性鉴定， 在此基础上 对这四个性状进行 初步 位分析， 研究结果如下： 1. 对 发芽率、苗高、 根长及鲜重耐盐指数进行正态分布检验， 这四个性状均符合正态分布。因此这四个性状均符合 图的要求。 2. 对 发芽率 、 苗高 、 根长及鲜重耐盐指数这 四个耐盐性状进行相关性分析，结果 表明两两之间都存在极显著的 正 相关性。 3. 用 54 个 点对 186 个 失数据共 96 个，占整个群体基因组成的 德抗 961 基因占整个群体基因组成的 太空 6 号基因占整个群体基因组成的 在 平下进行 合 1： 1 的比例，表明该群体是一个随机群体，适合进行 位的遗传分析。 4. 使用 件 对杂交组合德抗 961 和太空 6 号的 86 个单株的 54 个 异位点进行分析， 构建了一张包含 42 个 点，覆盖小麦基因组 8 条染色体共 记间平均间距为 16.8 遗传连锁图。 5. 用单一标记法和复合区间法对 4 个性状进行 析。采用单一标记法在 5A、 5B、 5D、3B 和 4D 上检测到显著或极显著位点 。 采用复合区间法共检测到 6 个 别位于 55色体上。基因作用方式以显性为主，显性效应较大，加性效应较小。在染色体 5D 上检测到的 多，共有 3 个 中 记 相邻 的遗传距离小于 5种检测方法得到 的结果 具有 一致性。 本研究 所检测到的与 离 较近的 一步小麦 耐盐分子标记 提供参考信息 。 关键词 ：小麦 ， 耐盐 性 ， to in in is of of is to TL to to TL in F2 2:3 K6 2 86 to a i.e to of 2:3 as be to 3. 21 2 of 4 in of 2 2 4 :1. So of SR be to 4. A 2 to a 04.5 cM an 6.8 to TL on A,5B,5D,3B D. of 6 on BL in of of TL is a of as in be in 录 第一章 绪论 . 1 究的目的意义 . 1 麦耐盐机理及鉴 定方法 . 1 麦的耐盐机理 . 1 盐性鉴定的方法 . 2 麦基因定位方法 . 4 用非整倍体定位 . 4 光原位杂交 . 5 子标记 . 5 位分析 . 9 麦耐盐相关基因的定位及克隆 . 13 子标记辅助选择的应用及展望 . 14 究内容及方法 . 15 第二章 材料与方法 . 16 验材料 . 16 验方法 . 16 间种植 . 16 2:3家系耐盐性鉴定 . 16 体单株基因型分析 . 16 据统计分析 . 18 第三章 结果与分析 . 19 本德抗 961 及太空 6 号和 家系耐盐性表现 . 19 2:3家系耐盐性状正态分布检验 . 19 状间的相关性分析 . 20 传连锁图谱的构建 . 20 物的筛选 . 20 记位点在 . 21 麦部分遗传框架图的构建 . 23 位及基因效应分析 . 25 一标记分析法 . 25 合区间作图法 . 25 第四章 讨论 . 30 麦苗期耐盐性鉴定 . 30 分 锁图谱构建中存在的问题 . 30 位分析 . 31 要进一步研究的问题 . 31 第五章 结论 . 33 参考文献 . 34 致谢 . 40 作者简历 . 41 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究的目的意义 世界上存在着大面积的盐渍化土地 ， 据不完全统计 ， 盐胁迫是植物主要的非生物胁迫之一，目前全世界耕 地接近一半的灌溉地受到盐碱的威胁。 中国有盐渍化和次生盐渍化土地 4千万 占我国耕地的 1/10 左右 ， 严重影响了粮食产量 ， 成为限制农业生产的主要因素 。 土壤盐害可通过合理的水土管理和化学改良措施得以缓解 ， 但成本太高 ， 而采用培育耐盐作物品种是改良和利用盐碱地资源最经济、最有效的措施之一 ， 这对盐碱地区尽快建立合理的地貌结构 ， 提高作物产量都具有重要的意义 ， 也是长远而有效地利用盐碱化土壤资源的一条根本途径 。 我国的盐碱地主要分布在长江以北的黄河流域 ， 盐碱地受季风气候的影响 ， 春、秋两季降雨少 ， 而蒸腾蒸发强烈 ， 盐分大 量积累在耕作层中 ， 目前 ， 小麦是盐碱地主要栽培作物之一 ， 秋季正是冬小麦播种期 ， 这个时期返盐造成小麦出苗难 ， 而春季返盐往往造成小麦个体生长发育不良 ， 以上是造成盐碱地小麦产量低而不稳的主要原因 。 在耕地有限、人口不断增长的今天 ， 开发和有效利用盐渍化土壤资源更具有重要的现实意义 ， 而研究小麦的耐盐机理将为培育耐盐小麦品种提供重要的理论依据。 麦 耐盐机理及鉴定 方法 麦的耐盐机理 培育耐盐作物品种是改良和利用盐碱地资源最经济、最有效的措施之一 。而对植物耐盐机理的认识对于培育耐盐作物品种起着非常重要的作用 。不同的植物具有不同类型的耐盐途径或盐适应方式，甚至同一种植物有几种不同的耐盐方式。 耐盐小麦抵抗盐胁迫的主要机理包括耐盐和拒盐作用，拒盐作用现在报道的较少，而耐盐作用的研究开展的十分活跃。 耐盐小麦的耐盐机理主要是渗透调节作用，渗透剂来源主要包括合成有机物质和积累无机盐两种方式。 1)合成有机物质。耐盐小麦在盐生环境下，有机物合成增加，使细胞渗透势等于或低于环境渗透势，从而保证了植物体从环境中吸收足够的水分，同时维持细胞正常膨压以保持细胞正常生长。 脯氨酸和 甜菜碱是大家现在比较公认的一种渗透剂 。 2)积累无机盐。植物在盐胁迫下，可以通过在液泡中积累无机离子进行渗透调节，根据实验证明，在盐胁迫下，小麦原生质体中的绝大多数 都集中在液泡中。在相同条件下， 耐 盐品种比不 耐 盐品种液泡中盐含量高出 20%左右。这说明无机盐积累也是小麦适应盐胁迫的一种方式。 所谓拒盐是指不让外界盐分进入植物体中，从而避免盐分胁迫。 （ 1986）报道，不同品种的小麦在同一盐浓度下，耐盐性强的品种较不耐盐的品种 量要小得多。这说明耐盐品种对盐离子透性小，它主要依靠质膜的选择透性或利用其 他方式将盐离子拒之中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 门外，从而减轻了盐离子对植物体的伤害 (段显德 ， 2001)。 盐性鉴定的方法 耐盐性是一个数量性状，对于耐盐性的鉴定现在还没有一个统一的方法。不同的育种工作者根据实验及经验在工作中使用不同的鉴定方法。 期耐盐性的鉴定方法 翁跃进（ 1999） 在 2%浓度下 对芽期耐盐性进行鉴定 ， 评价相对盐害率： 相对盐害率（ %） =（ 对照发芽率 100% 刘旭（ 2001）等使用 以下方法进行芽期耐盐性的鉴定和筛选。在培养皿中铺垫一层滤纸，加入一定 浓度的 进行处理 ， 并以蒸馏水处理作为对照，于 20 培养箱中发芽，其间及时补充盐水。 3d 后调查发芽势， 7d 后调查发芽率 (以芽长超过种子长度 1/2者为发芽标准 )。计算相对盐害指数 ， 依据盐害指数对耐盐性评级。盐害指数按下列公式计算 : 0 1级 ， 2级 ， 3级 ， 4级 ， 5级。 盐害指数随材料对盐的敏感性增大而增大。 盐害指数 (%)=(对照发芽率 100% 期耐盐性鉴定方法 为了对每一个体的苗期抗性作出准确判断，同时便于 刘旭等（ 2001） 使用以下鉴定方法。将种子用蒸馏水浸泡， 25 培养，萌动发芽后，置于泡沫塑料板上，在 养液中培养。在分蘖初期选取苗高和根长基本一致的材料，测量根的平均长度、苗高，调查根量，然后剪掉所有的老根和新根；在培养液中加入一定量的盐， 3d 更换一次溶液，逐渐提高盐浓度，同时调查单株平均根长、株高、根量、分蘖数以及叶片盐害症状，对抗性水平作出判断 (标准见表 。 表 小麦苗期耐盐性分级标准 of to at 盐级别 盐害表现 0 级 植株生长正常，没有盐害症状。 1 级 植株的生长轻微受到盐抑制，仅叶尖焦。 2 级 植株 30%的叶片枯黄或失绿。 3 级 植株 50%的叶片枯黄或失绿。 4 级 植株大部分枯黄仅心叶绿。 5 级 植株完全枯死。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 化水平的鉴定 赵勇等（ 2005）等实验证明小麦叶和根中甘氨酸甜菜碱含量与小麦盐胁迫成正相关，是小麦体内抵御盐胁迫的渗透调节物质之一，可作为小麦耐盐性鉴定指标。 齐志广等（ 2002）证明耐盐性最好的小麦品种 变 化周期较长 ， 表明其机体的适应能力和对超氧自由基的反应能力强。而耐盐性差的 度小，可能是因为其机体内对超氧自由基的反应能力较差 ， 对盐胁迫的适应性也较差。 陈洁等（ 2003）利用电导法可以测定植物抗逆性。 由于植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温、干旱、盐渍，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。 所以 膜透性增大的程度与 植物抗逆性强弱有关。 生育期鉴定 全生育期在 壤盐的盐胁迫条件下综合评价对盐害敏感的性状，如株高，分蘖数，穗粒数，穗粒重和小区产量，测定耐盐系数（盐胁迫性状表现 /对照性状表现 100%）。根据相对比值的大小将鉴定对象分类： 1级为高耐（芽期相对盐害率， ; 2级为耐盐（ ； 3级为中耐（ ； 4级为敏感（ ；5级为高度敏感（ （翁跃进， 1999）。 对于耐盐级别的划分，赵瑞堂等（ 1995）等提出以下方法。 1） 单株盐害分级标准： 生长发育正常，不表现任何盐害症状为 0级；生长发育基本正常，叶尖略有沿害表现为 1级；生长发育接近正常，基部叶片干枯，中上部叶片 1/3表现盐害为 2级；生长发育受抑制，基部及中部叶片干枯，上部叶片 1/2表现盐害为 3级；生长发育严重受抑制，只上部顶端有绿叶为 4级；植株死亡或临近死亡为 5级。 ） 依单株盐害级别和株数计算相对盐害指数（ %） 相对盐害指数（ %） =分级记载的株数与该级别数值乘积的总和 /调查总株数 5（最高一级的盐害级 别） 100 ） 依单株盐害级别和株数计算相对盐害级别 相对盐害指数在 0为 1级； 为 2级； 为 3级； 为 4级； 00%的为 5级。 ） 计算单个农艺性状的相对盐害率 相对盐害率（ %） =盐池中性状数值 /对照池中性状数值 100% 综上所述，关于植物耐盐性的鉴定方法很多，从形态，性状，到生化指标都有很多研究，但目前还没有形成权威的统一的方法。从形态，性状上进行鉴定，可操作性不强，这需要鉴定者有多年的工作经验，对鉴定者的要求条件比较 高。而很多生化指标未能得到大家的公认，可信度不高 。 用测定相对电导率的方法对耐盐性进行鉴定是一个传统的鉴定方法，是一个可行方法。 目前，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 盐胁迫下植物体内甜菜碱的积累是一种有利于植物在盐胁迫下生长的观点得到大家认可。赵勇 等（ 2005）实验证明小麦叶和根中甘氨酸甜菜碱含量与小麦盐胁迫成正相关，是小麦体内抵御盐胁迫的渗透调节物质之一，可作为小麦耐盐性鉴定指标。因此，除了用形态，性状作为基础的耐盐指标之外，用 甘氨酸 甜菜碱作为耐盐指标是比较可信的。但总的来说，耐盐性的鉴定还没有形成成熟统一的方法，对植物耐盐性的鉴定方法还 需进行进一步的研究。 麦基因定位方法 用非整倍体定位 利用单体，缺体和端体进行基因定位，是基因定位的传统技术。大多数可观察到区别的性状，其基因定位都可以单体分析为主，同时利用其他非整倍体的遗传分析得到的。 单体分析的遗传学原理是：如果携带某一位点的那条染色体处于单体状态，那么这位点上的基因成杂和状态时，其自交后代的遗传分离比例就必然会偏离整倍体时所观察到的正常的分离比例。根据这种分离比例的受扰就可以把有关基因定位到特定的染色体上。 基因定位中，利用缺体来鉴定基因所在染色体位置比单体更直接 。因为普通小麦缺少 21 对染色体中的任何一对时，在表型上往往有明显的区别。 在 20 世纪 50 年代就根据中国春缺体性状的异常表现，把一些控制质量性状的基因定位于具体染色体上。 缺体分析基因定位，有以下几个优点：缺体与待测二体杂交， 必镜检 ； 缺体系既可作父本 ，又可作母本，对于雄性不育基因定位，可以利用缺体而不能利用单体； 稳定自交结实缺体，自交后代基本上全是缺体，而且各缺体系标记性状典型，很容易区分，保存和利用也很方便 (张正 斌 ， 2001)。 单体和缺体分析虽然能把待测基因确定于各自的染色体 上，但均不能将待测基因定位于染色体的某一臂上，端体分析比较完满克服了以上缺点。 刘秉华等 (1986)年将小麦显性雄性不育单基因 位于 4D 染色体上。 991) 对小麦耐铝性基因进行了研究，表明小麦的耐铝型是由几个基因控制的显性性状，并进一步使用中度耐铝的小麦 “中国春 ”的一套双端体 材料 对其部分耐铝基因作了定位研究。结果表明，中国春中至少有三个控制耐铝性的基因，它们 分别 位于 52 4色体上。 沈光华等 (1992)年以普通小麦 “中国春 ”的单体系和多子房小麦杂交，并结合 双端体分析，将控制多子房性状的基因定位于染色体 5 6 。 谢晓玲 等 (2001)以小麦新种质材料 241 为测定系，中国春单体系及双端体系作为测验系，对控制千粒重的基因进行了定位研究。结果表明，小麦新种质材料 241 的 3A、 2B、 7B、和 6D 染色体上具有控制千粒重的基因，其中 3A、 7B 和 6D 染色体上的基因表现为强效， 2B 染色体上的基因表现为弱效。通过双端体分析，进一步将控制千粒重的基因定位于 37 6，其中 6可能是控制 241 千粒重的新基因。 谢晓玲 等 (2003)应用单体分析和双端体分析方 法对 241 材料进行了遗传学研究。结果表明，小麦新种质材料 241 的 1A 、 3A 、 5A 和 4B 染色体上具有控制株高的隐性基因， 6B 染色体上具有控制株高的显性基因，其中 3A、 5A 和 6B 染色体上的基因表现为强效， 1A 和 4B 染色体中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 上的基因表现为弱效。通过双端体分析进一步将控制株高的基因定位到 135 4 众多学者已使用非整倍体对小麦的众多性状进行了基因定位，但还未 见 到使用非整倍体对耐盐相关基因进行定位的报道。 光原位杂交 荧光原位杂交技术 (n 原理非常简单，它利用荧光标记的 子，根据 基的配对原则与染色体上相对应的序列杂交。进行原位杂交时，先用高温或碱处理 子，使之发生变性；当温度下降或 性的 按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只有它们之间的碱基序列是同源互补或部分同源互补时，才能全部或部分复性，产生分子杂交。由于探针带有荧光物质，因此杂交的位点可直接在显微镜下观察。 构建 子图谱时，所用的分辨率是指两个不同的 针能够检测到的最小距离，它决定了图谱的准确性和精密程度。 术发展至今，已可以在不同水平上进行染色体定位，即在中期染色体上用 术构建染色体分子图谱，这一水平的分辨率大约为 13用离心机械力将中期染色体拉长 520 倍，从而提高分辨率；在减数分裂的粗线期染色体上用术构建染色体分子图谱，由于该期分离到的染色体长度通常比中期染色体长 1020 倍，这一水平的分辨率大约为 100间期核的染色质上用 术构建染色体分 子图谱，由于染色质凝缩程度很低， 分辨率可达 50右；在游离的染色体上用 术构建染色体分子图谱，也就是对间期核进行处理，使其释放出游离的染色丝，这种染色丝已失去原有的细胞空间结构，故 缩程度进一步降低，其 辨率接近 12 维上用 游离的染色体基础上，进一步处理染色体，使 子完全从蛋白质中分离出来，制备 维，分辨率能达到 12分辨率的 快速准确地得到探针序列之间的顺序、方向及真实的物理距离，因而被广泛地应 用于 理图谱的构建。 尽管如此， 存在一些固有的缺点： 维的随机断裂可能导致同一探针的信号长度不一致； 维伸展的程度不一，影响定量分析；紧密连锁的探针与大基因组的物种纤维杂交时，散在分布的重复序列会导致杂交信号的不连续，这一点在小麦上尤其突出；从 结果不能判断探针究竟在哪条染色体上， 还需与分带技术等其他技术结合起来，这对实验人员的技术要求很高； 在分辨率为 情况下（ 于 3探针杂交信号 约长 1 12 个 “珍珠点 “组成，在没有其它探针参考的情况下，不可能决定着一两个信号是否在 维上。由此可见，此技术更适合定位和分析大的重复探针和 以上的 片段，如 ，在小麦中要利用这种技术来定位几个 基因尚有困难 。 子标记 遗传学的发展在很大程度上是建立在遗传标记的发现和发展基础上的。遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征，是代表一个位于染色体上已知座位的基因或一种清晰的表型性中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 状。遗传标记在经历了以基因表达产物为基础的形态标记、细胞学标记和生化标记 后，随着分子生物学技术的发展又产生了一类重要的直接以基因为基础的遗传标记，即分子标记。与传统遗传标记相比，分子标记具有不受环境影响和基因表达与否的限制，且标记数量多，可遍及整个基因组。目前，已发展了多种类型的分子标记且它们在图谱构建、基因定位、基因克隆、标记辅助选择、比较基因组学研究、遗传资源保存、遗传多样性和物种亲缘关系以及进化研究等方面得到广泛应用。 根据研究对象和方法，分子标记技术主要分为以下四类 (表 基于 交的分子标记，如 制性酶切片断长度多态性 )； 以 基础的分子标记 ， 如 列标签位点 )， 单重复序列 )；基于限制性酶切结合 分子标记，如 增片断长度多态性 )， 解扩增多态性序列 )；基于单核苷酸多态性，如 核苷酸多态性 )。其中用于植物遗传图谱构建的主要分子标记有 。 表 要的分子标记技术 of 子标记 英文名称 基于 交的分子标记 限制性酶切片段长度多态性 单链构象多态性 变性梯度凝胶电泳 以 基础的分子标记 随机扩增多态性 单链构象多态性 锚定简单重复序列 简单重复序列 相关序列扩增多态性 反转录转座子间扩多态性 反转录转座子插入多态性 序列标签位点 限制性酶切结合的 分子标记 扩增片段长度多态性 酶解扩增多态性序列 特定序列扩增的多态性 选择性微卫星多态性 of 单核甘酸多态性 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 记 限制性片段长度多态性，是最早应用于图谱构建和基因定位的 子标记。它是由于基因组 制性内切酶识别位点序列内的点突变、插入、缺失、重排等所造成的限制性片段数目和长度的变异。原理是利用限制性内切酶酶解产生的大量长度不等的 段，通过凝胶电泳技术，将其按大小分离开来。再经 迹、 针分子杂交和放射自显影，检测到与探针杂交的特定的 段。若不同个体间在与该探针同源的 段长度不同，就会表现出限制性片段长度的多态性，这个探针就是一个分子标记 (郑康乐等， 1991)。 曹卫东等（ 2004）以 亲本通过一粒传而获得包含 111 个株系的 据该群体构建了包含覆盖整个染色体组的 918 个 记的遗传图谱。 与传统的遗传标记相比， 记具有以下优点： (1)普遍。从病毒到高等真核生物，该类标 记普遍存在，它是自然发生的，数量大，同一位点上有较多的等位基因。 (2)共显性。该类标记直接在 平上检测，通常具有共显性，在任何分离群体中能区别所有的基因型。 (3) 中性。大多 记表型中性，对植物本身无害，对重要农艺性状也很 少有次级效应。 (4)在非等位基因之间不存在上位效应，因而互不干扰。 (5)同时具有可靠性和稳定性等优点。但是 术复杂，检测费时、费力，且需要放射性同位素，故难以广泛应用于以分子标记为基础的植物育 种。 记 记，又称微卫星 (记，简单序列长度多态性（ 记，是以 16 个核苷酸为单位组成的长达几十个核苷酸的 串联重复序列。由于重复次数或重复程度不完全相同而形成每个座位的多态性(1992； 1993)，称为简单序列长度多态性。一般认为微卫星多态性是由于 配或减数分裂过程中姊妹染色单体的不均等交换产生的。利用重复子两侧单拷贝序列设计 物， 位基因间的差异就表现为 增产物的长度差异，扩增后可得到丰富的等位基因多态性 (， 1993； ， 1997)。自 1989 年 被广泛应用于品种保护