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第七章吸光光度法 主讲教师 鲁静 光学分析法概述 主要内容 1 基本原理 2 显色反应及显色条件的选择 3 测量条件的选择 4 目视比色与分光光度计 5 吸光光度法应用 6 2 一 电磁辐射的基本特性 一 电磁辐射的二象性 波动性和微粒性 光是一种电磁波 具有波动性 电磁波可以用周期T s 频率 Hz 波长 nm 和波数 cm 1 等参数描述 它们之间的关系为 1 T c 1 c光具有微粒性 光是由光子组成的 光子具有能量 其能量与频率或波长的关系为 E h h c 由以上公式可知 不同波长的光能量不同 波长越长 能量越小 波长越短 能量越大 第一节 光学分析法概述 V 3 二 电磁辐射区 4 吸光光度法 基于物质对上述区间光的吸收而建立起来的分析方法 5 比色分析法 利用比较待测溶液本身颜色或者加入试剂后呈现的颜色的深浅来测定溶液中待测物质的浓度的方法 目视比色法光电比色法吸光光度法 应用分光光度计 根据物质对不同波长单色光的吸收程度不同而对物质进行定性和定量分析的方法 也叫分光光度法 可见分光光度法 380 750nm 紫外分光光度法 200 380nm 红外分光光度法 3 103 3 104nm 6 吸光光度法的特点 7 问题1 硫酸铜溶液时什么颜色的 问题2 蓝色的硫酸铜溶液放在钠光灯下呈现什么颜色 问题3 放在暗处 会有什么现象 溶液的颜色 Diagram2 Diagram3 Diagram2 Diagram3 光照及组成 物质本质 第二节 吸光光度法基本原理 8 一 单色光 复合光和互补光 单色光 具有相同波长的光 复合光 含有多种波长的的光 例如 阳光和白炽灯发出的光均为复合光 可见光 指人的眼睛所能感觉到的光 包括的波长范围为 380 750nm 互补光 将两中适当颜色的光按一定的强度比例混合 如果能形成白光 则这两种光称为互补光 9 不同颜色的可见光波长范围及其互补光 10 1 物质颜色的产生 物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生的 二 物质对光的选择性吸收 11 一种物质呈现何种颜色 与入射光组成和物质本身的结构有关 而溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的吸光质点 离子或分子 选择性地吸收某种颜色的光而引起的 当白光通过某一均匀溶液时 如果各种波长光几乎全部被吸收 则溶液呈黑色 如果入射光全部透过 不吸收 则溶液无色透明 如果对某种色光产生选择性吸收 则溶液呈现透射光的颜色 即溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色 12 溶液的颜色与光吸收的关系 完全吸收 完全透过 吸收黄色光 光谱示意 表观现象示意 复合光 13 例如 硫酸铜溶液选择性地吸收了白色光中的黄色光 所以呈现蓝色 KMnO4溶液能选择吸收了白光中的绿光 与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液 所以KMnO4溶液呈现紫色 练习 K2Cr2O4是什么颜色的 为什么 某溶液呈现红色 是因为什么 14 15 2 物质的吸收光谱曲线 用不同波长 400 750nm 的光 照射某一吸光物质的溶液 测吸光度 A 以波长 为横坐标 吸光度A为纵坐标得到的一条曲线 直观地表示出物质对光的吸收特征 它反映某溶液对不同波长单色光的吸收程度 在最大吸收波长处测定吸光度 则灵敏度最高 不同物质吸收光谱的形状以及 max不同 定性分析的基础 同一物质 浓度不同时 吸收光谱的形状相同 Amax不同 定量分析的基础 16 KMnO4的吸收曲线 17 吸收曲线 absorptionspectrum 的讨论1 同一种物质对不同波长光的吸光度不同 吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 max 2 同一物质不同浓度的溶液 光吸收曲线形状相似 其最大吸收波长不变 但在一定波长处吸光度随溶液的浓度的增加而增大 这个特性可作为物质定量分析的依据 在实际测定时 只有在 max处测定吸光度 其灵敏度最高 因此 吸收曲线是吸光光度法中选择测量波长的依据 3 不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长均不相同 光吸收曲线与物质特性有关 故据此可作为物质定性分析的依据 18 3 分子吸收光谱产生的机理 紫外 可见吸收光谱产生的机理 光子作用于物质分子时 如果光子的能量与物质分子的电子能级间的能级差满足 E h 光子将能量传递给物质分子 分子获得能量可发生电子能级的跃迁 在光吸收过程中基于分子中电子能级的跃迁而产生的光谱 称为紫外 可见吸收光谱 或电子光谱 19 三 光吸收的基本定律 1 透射比和吸光度当一束平行单色光 通过一均匀的溶液后 光的强度会减弱 I0 Ia It 20 透光度T 透射比 Transmittance 定义透光度 T取值为0 0 1 0 全部吸收 全部透射 A lg 1 T lgT 吸光度A Absorbance A取值为0 0 全部透射 全部吸收 二者关系为 定义吸光度 21 如果溶液的浓度一定 光的吸收程度与液层的厚度成正比 A K1b 朗伯定律1760 比尔定律1852 22 朗伯 比尔定律 当一束平行单色光通过均匀的 透明的吸光物质的稀溶液时 溶液的吸光度与吸光物质浓度和液层厚度乘积成正比 即A bc式中比例常数 与吸光物质的本性 入射光波长及温度等因素有关 c为吸光物质浓度 b为透光液层厚度 K可用a 吸光系数 或 摩尔吸光系数 表示 朗伯 比尔定律是紫外 可见分光光度法的理论基础 2 朗伯 比尔定律 23 朗伯 比尔定律不仅适用于溶液 也适用于均匀的气体 固体状态 是各类光吸收的基本定律 也是各类分光光度法进行定量分析的依据 朗伯 比尔定律的应用条件 1 必须使用单色光 应选用 max处测定 2 吸收发生在均匀的介质 3 吸收过程中 吸收物质互相不发生作用 24 比例常数的取值与浓度的单位有关 A kbc 当c的单位用mol L 1时 比例常数用 表示 称为摩尔吸光系数A bc a的单位 L g 1 cm 1 的单位 L mol 1 cm 1 Ma M 物质的摩尔质量 当c的单位为g L 1时 比例常数用a表示 称为质量吸光系数A ab 3 吸光系数 25 摩尔吸光系数的物理意义 单位浓度的溶液 1mol L 液层厚度为1cm时 在一定波长下物质对光的吸收程度 1 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数 2 不随浓度c和液层厚度b的改变而改变 在温度和波长等条件一定时 仅与吸收物质本身的性质有关 与待测物浓度无关 3 同一吸光物质在不同波长下的 值是不同的 在最大吸收波长 max处的摩尔吸光系数 常以 max表示 max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力 26 a或 反映吸光物质对光的吸收能力 也反映用吸光光度分析法的灵敏度 越大 表示改物质对某波长的光的吸收能力越强 测定的灵敏度也就越高 因此测定时 为了提高分析灵敏度 通常选择摩尔吸光系数大的有色化合物进行测定 选择具有最大 值波长的光做入射光 例如 用铜试剂测定钢 436 12800 而用双硫腙测定铜 495 158000 灵敏度较前者高很多 例题讲解 27 3 吸光度的加和性 朗伯 比尔定律不仅适用于紫外光 可见光 也适用红外光 在同一波长下 各组分吸光度具有加和性A A1 A2 An 28 吸光度 A 透光率 T 与浓度 c 的关系 A kbc 线性关系 指数关系 A kbc 29 4 偏离吸收定律的主要因素在实际工作中 经常发现标准曲线向浓度轴弯曲的情况 称为偏离朗伯 比尔定律 引起偏离的原因较多 有来自仪器方面的 有来自溶液方面的 30 1 入射光非单色光引起的偏离朗伯 比耳定律只适用于单色光 但所用的入射光多是复合光 因而导致对朗伯 比尔定律的偏离 设检测器 光电池或光电管 对两种波长的光的灵敏度相同 则可以证明 1与 2相差愈大 吸收池愈厚 则偏离愈严重 入射光的波长范围窄 偏离朗伯 比尔定律的程度小 选择最大吸收波长的入射光 不仅有较高的灵敏度 偏离朗伯 比尔定律的程度较小 31 2 溶液的化学和物理因素引起的偏离 由于介质不均匀性引起的偏离 当被测试液是胶体溶液 乳浊液或悬浮物质时 部分入射光还因散射现象而损失 导致实测吸光度增加 产生正偏差 由于溶液中的化学反应引起的偏离 溶液中的吸光物质常因离解 缔合 形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度 导致偏离朗伯 比尔定律 3 比尔定律的局限性引起的偏离比尔定律有个局限性 只适用于浓度小于0 01mol l的稀溶液 32 第三节显色反应及显色条件的选择 一 显色反应及要求1 显色反应 在分光光度分析中 将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应 显色反应一般分为两大类 一类是配位反应 另一类是氧化还原反应 Fe3 SCN FeSCN Mn2 5e 4H2O MnO4 8H 在这两类反应中 用得较多的是配位反应 33 灵敏度高 对显色反应的要求 1 选择性好 干扰少 2 生成的有色化合物组成恒定 化学性质稳定 3 有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大 4 显色条件要易于控制 以保证有较好的再现性 5 34 二 显色条件的选择 影响因素 酸度显色剂用量温度显色时间溶剂溶液中共存离子 35 酸度对显色反应的主要影响 1 当酸度不同时 同种金属离子与同种显色剂反应可以生成不同配位数的不同颜色的配合物 如Fe3 和水杨酸PH 4 紫红色1 1PH4 7 橙红色1 2PH8 10 黄色1 32 酸度过高会降低配合物的稳定性 弱酸型显色剂 金属离子 3 酸度变化 显色剂的颜色可能发生变化 4 酸度过低可能引起被测的金属离子发生水解 破坏了有色配合物 是溶液的颜色发生改变 1 溶液酸度 36 酸度对显色反应有影响 要控制合适的酸度 通过实验确定 固定c M c R 改变pH pH 选择平坦部分 37 2 显色剂用量 显色剂用量对显色反应主要有有三种情况 如图 a b c 所示 38 3 显色温度 显色反应的进行与温度有很大关系 一般显色反应可在室温下完成 但是有的在室温下进行得很慢 需要加热促使反应迅速完成 有的显色反应所形成的配合物在温度高时发生分解或褪色 有的需放置一段时间才能使反应进行完全 显然 对于不同的显色反应 应选择适宜的温度进行反应 使反应能进行完全 同样 标样和试样显色时 其温度应很近似 以减小其误差 39 4 显色时间 有些显色反应瞬间完成 溶液颜色很快达到稳定状态 并较长时间保持不变 有些显色反应虽能迅速完成 但有色络合物的颜色很快开始褪色 有些显色反应进行缓慢 溶液颜色需经一段时间后才稳定 适宜的显色时间由实验确定 显色时间 显色反应完成所需要的时间稳定时间 显色后有色物质色泽保持稳定的时间 40 5 溶剂的选择 有机溶剂会降低有色化合物的离解度 从而提高显色反应的灵敏度 同时 有机溶剂还可能提高显色反应的速度以及影响有色配合物的溶解度和组成 6 显色反应中干扰及消除 如果共存离子本身有颜色或共存离子与显色剂生成有色络合物 会使吸光度增加 造成正干扰 如果共存离子与被测组分或显色剂生成无色络合物 则会降低被测组分或显色剂的浓度 从而影响显色剂与被测组分的反应 引起负干扰 41 控制溶液的酸度 1 加入掩蔽剂 掩蔽干扰离子 2 改变干扰离子的价态 3 选择适当的波长 4 选用适当的参比溶液 5 干扰消除的方法 分离干扰离子 6 应用双波长 导数光谱法等新技术消除干扰 7 42 与待测组分生成有色化合物的试剂叫显色剂 分为无机显色剂和有机显色剂两大类 三 显色剂 43 无机显色剂无机显色剂在比色分析中应用得并不很多 主要原因是生成的络合物不够稳定 灵敏度和选择性也不高 目前应用较多的主要有硫氰酸盐 测定Fe Mo W Nb等 钼酸铵 测定Si P W等和过氧化氢 测定Ti 44 有机显色剂 大多数有机显色剂与金属离子生成极其稳定的螯合物 而且具有特征的颜色 因此 选择性和灵敏度都较高 不少螯合物易溶于有机溶剂 可以进行萃取比色 这对进一步提高灵敏度和选择性很有利 45 常见的有机显色剂 磺基水杨酸磺基水杨酸可与很多高价离子生成稳定的螯合物 主要用于测定Fe3 丁二酮肟在NaOH碱性溶液中 有氧化剂存在时 试剂与Ni IV 生成可溶性红色络合物 max 470nm 1 3 104 46 1 10 二氮菲是目前测定微量Fe3 的较好试剂 用还原剂先将Fe3 还原为Fe2 然后在pH 3 9的条件下 Fe2 与试剂作用 生成稳定的桔红色络合物 max 508nm 1 1 104 二苯硫腙是目前萃取比色测定Cu2 Pb2 Zn2 Cd2 Hg2 等很多重金属离子的重要试剂 控制酸度及加入掩蔽剂 可以消除重金属离子之间的干扰 提高反应的选择性 47 第四节 测量条件的选择 1 入射光波长的选择 选择被测物质的最大吸收波长作为入射光波长 这样 灵敏度较高 偏离朗伯 比尔定律的程度减小 当有干扰物质存在时 应根据 吸收最大 干扰最小 的原则选择入射光波长 2 控制适当的吸光度范围 一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0 2 0 8范围内 可以从以下两方面来考虑 控制溶液的浓度 选择不同厚度的吸收池 48 浓度测量的相对误差与T 或A 的关系 仪器读数误差 对于给定的仪器 读数误差 T为一常数 49 3 参比溶液的选择 参比溶液是用来调节仪器工作零点的 若参比溶液选得不适当 则对测量读数准确度的影响较大 1 2 3 4 溶液参比 试剂参比 试液参比 褪色参比 为什么需要使用参比溶液 测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度 50 参比溶液的选择一般遵循以下原则 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收 其它所加试剂均无吸收 用纯溶剂 水 作参比溶液 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收 而试液本身无吸收 用 试剂空白 不加试样溶液 作参比溶液 若待测试液在测定波长处有吸收 而显色剂等无吸收 则可用 试样空白 不加显色剂 作参比溶液 若显色剂 试液中其它组分在测量波长处有吸收 则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂 作为参比溶液 参比溶液选择动画演示 51 第五节 目视比色和分光光度计 目视比色法 用眼睛观察 比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法称为目视比色法 测定的准确度较差 相对误差约为5 20 但是由于仪器简单 操作简便 仍广泛应用于对于准确度要求不高的一些中间控制分析中 更主要的是应用在界限分析中 52 一 方法原理将有色的标准溶液和被测溶液在相同的条件下对颜色进行比较 当溶液的液层厚度相同 颜色深度一样时 两者的浓度相同 根据光的吸收定律 As scsbsAx xcxbx 当被测溶液的颜色和标准溶液相同的时候 则As Ax 又因为是同一种物质 同样的光源 所以 s x 且液层厚度相同 即bs bx 因此 cs cx 53 二 测定方法 标准系列法 步骤1 步骤2 步骤3 制作标准色阶 待测组分显色 目视比色 54 1 制作标准色阶 将一系列不同量的标准溶液依次加入各比色管中 再分别加入等量的显色剂及其他试剂 最后稀释至同样体积 2 待测组分显色 将一定量被测试液置于另一比色管中 在同样条件下进行显色 并稀释至同样体积 55 3 目视比色 从管口垂直向下或从比色管侧面观察 若试液与标准系列中某溶液的颜色深度相同 则此两溶液的浓度相等 如果试液颜色深度介于两标准溶液之间 则试液浓度也就介于这两者之间 取其平均值 56 例题解析 例 称取0 4994克CuSO4 5H2O溶于1L水中 移取此标准溶液1 00mL 2 00mL3 00mL 4 00mL 5 00mL6 00mL加入6只比色管中 加浓氨水5mL 用水稀释至25mL刻度 制成标准色阶 称取含铜试样5 0克溶于250mL水中 吸取5 00mL试液放入比色管中 加浓氨水稀释至25mL 其颜色深度与第四个比色管的标准溶液相同 求试样中铜的质量分数 解题思路 先算出标准色阶中第四个比色管溶液的浓度 由于颜色相同 则浓度相同 故 57 三 目视比色法的特点 优点 1 仪器简单 操作简便 适宜于大批试样分析 2 测定的灵敏度高 适宜稀溶液中微量物质的测定 3 某些显色反应不符合朗伯 比耳定律时 仍可用目视比色法进行测定 如浑浊溶液 缺点 主观误差大 准确度较差 相对误差约为5 20 不同人看 结果不同 应用 用于限界分析 58 一 仪器的基本组成部件 分光光度计 59 分光光度法 可见分光光度法 UltravioletVisualSpectroscopy 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 I0 It 参比 样品 未考虑吸收池和溶剂对光子的作用 注意比较 60 1 光源 在可见光谱区可以发射连续光谱 具有足够的辐射强度 较好的稳定性 较长的使用寿命 钨灯作为光源 其辐射波长范围在320 2500nm 最适宜的范围是380 1000nm 作用 提供符合要求的入射光 61 62 2 单色器 作用 从光源的连续光谱分解为单色光 并准确的分出某一波长范围的光 作为吸光光度分析的光源 棱镜 玻璃350 3200nm 石英185 4000nm 单色器 光栅 波长范围宽 色散均匀 分辨性能好 使用方便 63 棱镜分光示意图 64 3 吸收池 比色皿 比色皿用于盛参比溶液和被测试液 一般为长方形 有0 5cm 1 0cm 2 0cm 3 0cm等规格 同样厚度比色皿之间的透光率相差应小于0 5 玻璃 仅适用于可见光区石英 适用于紫外和可见光区问题 在使用比色皿的过程中应该注意哪些事项 作用 用于盛放盛参比溶液和被测试液 且决定透光液层厚度的器件 65 66 4 检测器 常用的是 光电池 光电管 光电倍增管 作用 对透过吸收池的光做出相应 并把它转变成电信号输出 其输出电信号大小与光的强度成正比 67 5 信号显示器 低档仪器 刻度显示 中高档仪器 数字显示 自动扫描记录 作用 放大检测器产生的电信号 经放大处理后 用一定的方式显示出来 以便于计算和记录 68 69 70 71 72 73 分光光度计的使用 预热20min 调节T 0