高分辨率溶解曲线HRM(精选PPT)

SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线 HighResolutionMelting 突变筛查和基因分型系统 北京思博全科技有限公司 1 2 内容提示 高分辨熔解曲线 HighResolutionMelting 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 筛查突变 mutationscanning 基因分型 MutationGenotyping 小片段 内标法 SmallAmpliconGenotyping 非标记探针法 UnlabeledProbeGenotyping LunaProbe SSR分析 检测甲基化HRM仪器 3 4 HighResolutionDNAMelting HRM 是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的Tm值差异 通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测 比如 5 PCR LightScanner突变检测原理 6 Lightscanner高分辨溶解曲线结果 7 Saturatingdye LCGreenplus 高分辨溶解曲线专用荧光染料 8 内容提示 高分辨熔解曲线 HighResolutionMelting 的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变 mutationscanning 基因分型 MutationGenotyping 小片段 内标法 SmallAmpliconGenotyping 非标记探针法 UnlabeledProbeGenotyping LunaProbe SSR分析 检测甲基化HRM仪器 9 MutationScanning 未知SNP扫描 10 M H Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描 筛查其潜在SNPs 11 BernhardJ HoWnger Hai ChunJing KimE Hammond Kosack KostyaKanyuka BarleyApplication TheorApplGenet 2009 119 851 865DOI10 1007 s00122 009 1094 2数据来自英国洛桑农业实验站 Bernhard等对Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E eIF4E gene基因外显子进行突变扫描结果 12 13 内容提示 高分辨熔解曲线 HighResolutionMelting 的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变 mutationscanning 基因分型 MutationGenotyping 小片段 内标法 SmallAmpliconGenotyping 非标记探针法 UnlabeledProbeGenotyping LunaProbe SSR分析 检测甲基化HRM仪器 14 SmallAmpliconGenotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定 15 使用已知Tm值的双链DNA做温度内标 低温内标Tm 61 高温内标Tm 92 内标能够实现96 384孔板的温度均一矫正 PCR片段的Tm值范围 70 88 优点 不需要探针 直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型 16 17 18 19 为何要使用温度内标 20 A TSNPwithoutCalibration 72bp 21 ApplyTemperatureCalibration 22 A TSNPwithCalibration 23 SmallAmpliconGenotyping M H Ye等对北京油鸡A FABP基因进行小片段法基因分型 扩增片段为56bp 灰色曲线显示的是杂合型 CT 蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT 24 内容提示 高分辨熔解曲线 HighResolutionMelting 的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变 mutationscanning 基因分型 MutationGenotyping 小片段 内标法 SmallAmpliconGenotyping 非标记探针法 UnlabeledProbeGenotyping LunaProbe SSR分析 检测甲基化HRM仪器 25 HRM Lunaprobegenotyping 26 HRM Lunaprobegenotyping 27 1Probe 1SNP AllPossibleSNPs 28 1Probe 1SNP AllPossibleSNPs 29 1Probe 2SNPs 1Amplicon 30 2Probes 2SNPs 1Amplicon ApoE 31 2Probes 2SNPs 2Amplicons HFE 32 AmpliconScanning 发现新的突变 33 DavidDe YongSongatel Applicationoghigh resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding 2010 25 67 90 rr RR Rr MixRr rrby1 1Rrrr MixRR Rrby1 1RRRr 34 内容提示 高分辨熔解曲线 HighResolutionMelting 的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变 mutationscanning 基因分型 MutationGenotyping 小片段 内标法 SmallAmpliconGenotyping 非标记探针法 UnlabeledProbeGenotyping LunaProbe SSR分析 检测甲基化HRM仪器 35 RosarioMuleo 2009 等用HRM方法对三个品种的SSRDCA4进行分析 DCA4的等位基因有131bp的重复序列 杂合等位基因的序列为131 133bp 分析结果如图8所示 HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分 其中一个等位基因只相差2bp 三种颜色 浅灰 深灰 黑色 表明3种不同的品种 RosarioMuleo等得出结论 HRM是一种快速 重复性高 成本低 操作简单 且可以应用于其他物种的SNP检测及SSR基因分型的方法 RosarioMuleo MarirChiaraColao DarioMianoatel 2009Genome52 252 260 36 内容提示 高分辨熔解曲线 HighResolutionMelting 的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变 mutationscanning 基因分型 MutationGenotyping 小片段 内标法 SmallAmpliconGenotyping 非标记探针法 UnlabeledProbeGenotyping LunaProbe SSR分析 检测甲基化HRM仪器 37 38 39 40 内容提示 高分辨熔解曲线 HighResolutionMelting 的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变 mutationscanning 基因分型 MutationGenotyping 小片段 内标法 SmallAmpliconGenotyping 非标记探针法 UnlabeledProbeGenotyping LunaProbe SSR分析 检测甲基化HRM仪器 41 2005LightScanner96 38496 384孔板 8分钟 板 2 6秒 样品温度均一性 0 15oC数据采集速度 大于100pts 秒升温速度 0 1oC 秒 2010LS3232样品转盘 玻璃毛细管HRM检测60分钟内完成定量PCR和HRM检测HRM检测升温速度可以在0 05 0 90oC 秒之间调节在升温速度小于 0 3 秒时 温度均一性 0 05oC数据采集速度 20pts 秒 400pts 秒 与升温速度有关 0 3oC 秒升温速度 67pts 0 05oC 秒升温速度 400pts 42 LightScanner高分辨溶解曲线应用 LunaProbes非标记探针基因分型 未知SNP扫描 SmallAmplicon小片段基因分型 43 HRM分析流程 在PCR反应前加入LCGreen荧光染料时间大约2小时 包含试剂准备 在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析大约需要5 10分钟数据分析和处理大约需要5 10分钟PCR产物可以直接进行下游的测序分析等 如需要 大约需要30 60分钟 44 LightScanner适于SNP分析 速度 通量 LightScanner5 10分钟完成96 384孔板的PCR产物检测 20000个SNP 天