小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案.doc

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。1. 实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等 试剂配比：(1) DMEM 10:10:1 DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)(2) DMEM 5:5:1 DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS（DMEM/F12无血清培养基+生长因子） 25g/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1g/ml putrescine（腐胺），5g/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nM progesterone（孕激素），1P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05胰蛋白酶+0.02EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSSDMEM/F12 containing 25 g/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 g/ml putrescine, 5 g/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at 37C Humidified tissue culture incubator (37C, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (Sterilin) 30 m sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech)2.实验步骤2.1星形胶质细胞的混合培养取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多3050倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。2.2星形胶质细胞的分离和纯化将培养于培养瓶中的混合胶质细胞上清弃去，用0.01mol/L PBS 洗2遍。用无血清培养基0.25%胰酶6 mL 加入培养瓶，37 消化15 min 左右，至镜下观察到大部分星形细胞脱落，将含有星形胶质细胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培养基中止消化，1000 r/ min离心5 min，再用PBS 洗2 遍后，重悬于含10% FBS DMEM/F12 培养基中，种于培养瓶中; 将培养瓶置于37细胞培养箱稳定贴壁1 d 后，再用37恒温定轨摇床，200 r/min 振摇2 h;吸取上清液弃去(其中主要包括一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞) ，贴壁细胞采用0. 25% 胰酶37 消化后立即置于含10% FBS DMEM/F12 培养基中，终止消化后,1000 r/ min离心5 min，弃上清，将沉淀细胞重悬于含10%FBS的DMEM/F12 培养基，计数后调整细胞密度106 /孔接种于6 孔培养板中，稳定24 h 后可用于后续实验。2.3星形胶质细胞的免疫细胞化学染色鉴定本实验建议选择OX42作为小胶质细胞的标志物, 能同时反映小胶质细胞的激活状态，以OX42抗小鼠CD11b/c抗体免疫荧光染色法鉴定星形胶质细胞。具体步骤:(1)待小胶质细胞长成片后, 取出盖玻片, 依次用PBS液清洗3次,每次5 min, 冰丙酮固定15 min, 干燥5 min, PBS漂洗3 次; (2)特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37孵育60min，进行抗体标记。(3)洗涤：1 PBS （pH 7.4 ）洗涤3次/15 分钟，晾干。(4)加入荧光标记抗体，37孵育30min。1 PBS （pH 7.4 ）洗涤3次/15 分钟，晾干。(5)封片：封片剂封片。(6)镜检：荧光显微镜下观察，胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光，细胞核周围尤其明显。注意事项1、选材注意选取新生小鼠（24h内）。取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。2、注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。3、应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。4、严格控制胶质细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。