拟丝孢镰刀菌侵染对马铃薯块茎生理生化特性的影响

拟丝孢镰刀菌侵染对马铃薯块茎生理生化特性的影响 摘要：马铃薯干腐病是马铃薯贮藏期主要病害之一，已经成为马铃薯产业发展的一个主要限制因子，确定病原菌的侵染特性对于早期预报和防治干腐病具有重要的意义。对马铃薯干腐病主要致病菌拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides）侵染马铃薯过程中薯块的生理生化特性进行研究。结果表明，不同抗性的马铃薯被拟丝孢镰刀菌侵染后，丙二醛（MDA）含量都出现出下降的趋势，而超氧化物歧化酶（SOD）活性对薯块抵抗病原菌的侵染起到了一定的作用，可溶性蛋白质含量和过氧化物酶（POD）活性和抗病性密切相关。 关键词：马铃薯抗性；拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides）；超氧化物歧化酶；过氧化物酶；丙二醛 中图分类号：S435.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2380-04 DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.08.019 马铃薯是粮食、蔬菜、饲料和工业原料兼用的主要农作物，具有丰产性好、适应性强、经济效益高和营养丰富的特点，为解决中国经济欠发达地区的温饱问题和粮食安全问题做出了重要贡献，在促进农业结构调整、优化区域布局和抗灾救灾中发挥了重要作用1。近年来，中国马铃薯种植面积不断扩大，种植面积和总产量均占世界的1/4，已成为中国的第四大粮食作物，中国已成为世界马铃薯第一生产大国2。在北方地区，马铃薯无论作为商品薯还是种薯，冬季储藏方式都是以窖藏为主，在储藏期间由于储藏条件的不适宜，常会导致某些病害的加重，如晚疫病、环腐病、干腐病、黑心病及软腐病等发生，严重的会出现烂窖，极大地影响了马铃薯的产量和品质，对马铃薯的生产和销售都带来很大的影响3-5。随着种植面积不断扩大，马铃薯的各种病害日趋严重，成为限制马铃薯产业发展的主要因素，其中马铃薯干腐病是马铃薯贮藏期主要病害之一，因马铃薯干腐病导致窖贮损失率可高达60%6，该病已成为马铃薯产业进一步发展的瓶颈问题7。 前人对马铃薯干腐病的研究大部分集中在病原菌的分离鉴定和防治上8，对于马铃薯干腐病和马铃薯二者互作机制尚不是十分清楚，对于镰刀菌（Fusarium sp.）侵染马铃薯过程中的细胞、生理生化变化特点及遗传特性等方面报道较少9-11。对马铃薯干腐病的防治目前主要采用化学农药进行化学防治，主要目的是减轻马铃薯干腐病的危害程度，难以有效控制病害发生，使用不当还会导致食品安全、马铃薯药害和环境污染问题，尚未找到防治干腐病的有效方法，究其原因是对于防治缺乏理论基础，存在较严重的盲目性。解决马铃薯干腐病防治问题行之有效的方法是在充分掌握马铃薯与镰刀菌互作机制的基础上12，13，了解马铃薯的感病实质，从而选择切实有效并且可行的防治方法对马铃薯干腐病进行防治14。 马铃薯干腐病是由镰刀菌引起的，病原菌为镰刀菌属（Fusarium）的多种真菌。适宜发病的温湿度范围较宽，530 均能导致马铃薯发病。高温、高湿有利于发病，在贮藏条件差、通风不良环境利于此病的发生15，早熟品种比晚熟品种易发病16。黑龙江省马铃薯干腐病主要病原有6个种及变种，分别为接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides）、茄病镰刀菌蓝色变种（Fusarium solani var. coeruleum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporatrioides）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）。其中致病力较强的为接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌和拟丝孢镰刀菌17，18。本试验以拟丝孢镰刀菌为致病菌，对马铃薯与拟丝孢镰刀菌的互作过程中块茎主要防御物质超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白质变化进行测定，探讨拟丝孢镰刀菌侵染过程中马铃薯的抵御作用，阐述马铃薯与镰刀菌的互作机理，为科学防治马铃薯拟丝孢镰刀菌病害、选育和培育具有广谱抗病性的马铃薯品种提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 马铃薯选用黑龙江省马铃薯主栽品种克山1号（K1，抗性品种）、大西洋（Altantic，感病品种）的脱毒薯块（原原种）为寄主材料。供试病原菌为东北农业大学生命科学学院实验室保存的拟丝孢镰刀菌，保存于PDA培养基上。 1.2 方法 用打孔器在拟丝孢镰刀菌活化培养基上将菌体做成菌饼待用。在无菌操作台中将马铃薯块茎表面消毒，去皮后用刀将其切成5 mm的薄片，薄片直径为3 cm。然后将菌饼放在马铃薯薄片中心位置，放入平皿中，以不接种的为对照。 25 恒温培养。6、12、24、48、72 h取样，每次取样1.0 g，3个重复。所取样品迅速用锡纸包上，做好标记后放入液氮中速冻，保存于-80 冰箱中。采用酶-蛋白联合测定法19测定生理生化指标。 2 结果与分析 2.1 拟丝孢镰刀菌侵染过程中可溶性蛋白质含量变化 采用拟丝孢镰刀菌对大西洋和克山1号的薯块进行侵染，测定不同时间可溶性蛋白质含量，结果见图1。由图1可见，拟丝孢镰刀菌侵染大西洋薯块后，薯块可溶性蛋白质含量仅在9 h时略高于对照，其余时间均明显低于对照，表现出含量随侵染时间延续呈降低趋势。受拟丝孢镰刀菌侵染的克山1号薯块可溶性蛋白质含量除了在6 h时明显低于对照外，其他时期含量与对照比较接近。可见，不同抗性马铃薯品种被拟丝孢镰刀菌侵染后薯块内可溶性蛋白质含量变化趋势存在差异，可溶性蛋白质含量可能与马铃薯品种对拟丝孢镰刀菌的抗性呈正相关。 2.2 拟丝孢镰刀菌侵染过程中SOD活性变化 采用拟丝孢镰刀菌侵染大西洋和克山1号薯块，测定不同时间的SOD活性，结果见图2。拟丝孢镰刀菌侵染马铃薯后，大西洋和克山1号薯块内的SOD活性在3 h时都表现为降低，然后出现了快速升高，其中克山1号在6 h达到了最高，大西洋在9 h时达到了最高值；在948 h抗病品种克山1号薯块中的SOD活性上升，而感病品种大西洋薯块中的SOD活性处于下降的趋势，表明在拟丝孢镰刀菌侵染马铃薯薯块后，不断上升的SOD活性对于薯块抵抗病原菌的侵染起到了一定的作用。 2.3 拟丝孢镰刀菌侵染过程中POD活性变化 采用拟丝孢镰刀菌侵染大西洋和克山1号薯块，测定不同时间的POD活性，结果见图3。拟丝孢镰刀菌侵染后大西洋和克山1号薯块内POD活性在06 h呈下降趋势，大西洋内POD酶活性变化较大。在6 h后，2个品种的POD活性都开始呈现出上升趋势，在012 h抗性品种克山1号POD活性始终高于感病品种大西洋，表明这个阶段POD酶活性与抗病性强密切相关。 2.4 拟丝孢镰刀菌侵染过程中丙二醛含量变化 采用拟丝孢镰刀菌侵染大西洋和克山1号薯块，测定不同时间的丙二醛含量，结果见图4。拟丝孢镰刀菌侵染后，侵染组相对对照组丙二醛含量都出现下降趋势，其中克山1号中的丙二醛含量的下降幅度较小，只是在24 h时出现了较大幅度下降，而感病品种大西洋薯块中的丙二醛含量下降的幅度较大，在12 h时已出现了较大幅度下降。丙二醛含量下降的原因可能是在病原菌侵染过程中薯块中产生了大量的抗氧化酶。 3 小结与讨论 活性氧对植物的防御反应十分重要，它能够诱导局部植物细胞程序性死亡，启动细胞壁蛋白的氧化交联，使病原限制在自杀性的寄主细胞内，从而减缓病原的侵染20。植物处于逆境下，也会产生自由基反应。胡景江等21对元宝枫进行模拟胁迫处理，发现在干旱胁迫条件下元宝枫的SOD活性先下降后逐渐回升至接近正常水平。耐干旱、霜冻、高盐碱、有毒物质等适应性强的植物内SOD活性明显较高，SOD与植物耐逆境能力有关，通过对植物SOD的分析有助于了解植物抗逆性，可用于培养抗逆能力强、有经济效益的新品种22。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物代谢及抗逆性都有密切关系23，24。它的作用具有双重性，一是过氧化物酶可在逆境或衰老初期表达，表现为保护效应；二是过氧化物酶也可在逆境或衰老后期表达，参与活性氧的生成，是植物体衰老的产物，甚至可作为衰老指标25。丙二醛是最常用的膜脂过氧化指标26。植物在逆境下遭受伤害或衰老，与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烯等。其中丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一，可以通过测定丙二醛了解膜脂过氧化的程度以间接了解膜系统受损程度以及植物的抗逆性。 本研究中不同抗性马铃薯被拟丝孢镰刀菌侵染后薯块内可溶性蛋白质含量变化趋势存在差异，在感病品种中可溶性蛋白质表现出下降趋势，可溶性蛋白质含量可能与马铃薯品种对拟丝孢镰刀菌抗性呈正相关。948 h抗病品种克山1号薯块中的SOD活性上升，感病品种大西洋薯块中的SOD活性处于下降的趋势，说明SOD对薯块抵抗病原菌的侵染起到了一定的作用。不同抗性马铃薯品种受拟丝孢镰刀菌侵染时薯块内POD活性变化差别较大，POD活性与马铃薯抗拟丝孢镰刀菌侵染有密切相关性。相对于未被侵染薯块，染病的马铃薯MDA含量出现了大幅度的下降。马铃薯在抵抗拟丝孢镰刀菌所引起的干腐病过程中防御酶起到了至关重要的作用，被拟丝孢镰刀菌侵染后抗性品种的各指标测定结果均不同程度地高于未被病原菌浸染时期，表明病原菌侵染后诱导马铃薯体内与抗干腐病有关的防御酶活性升高。本研究从防御酶活性变化方面阐明马铃薯抗病情况，为马铃薯抗病选种提供了理论依据。 参考文献： 1 谢建华.我国马铃薯生产现状及发展对策J.中国农技推广，2007（5）：4-7. 2 孙东升，刘合光.我国马铃薯产业发展现状及前景展望J.农业展望，2009（3）：25-28. 3 宋伯符.充满朝阳的中国马铃薯产业A.马铃薯产业与高新技术C.哈尔滨：哈尔滨工程大学出版社，2002. 4 屈冬玉，谢开云，金黎平，等.中国马铃薯产业发展与食物安全J.中国农业科学，2005，38（2）：258-262. 5 田 芳.北方地区马铃薯窖藏病害的发生及防治J.科技致富向导，2012（27）：378-379. 6 CARNEGIE S F，RUTHVEN A D，LINDSAY D A，et al.Effects of fungicides applied to seed potato at harvest or after grading on fungal storage diseases and plant developmentJ. Ann Appl Biol，1990，116：61-72. 7 赵生山，牛乐华.马铃薯贮藏期病害调查及药剂防治研究J.农业科技与信息，2008（11）：44-46. 8 彭学文，朱杰华.河北省马铃薯真菌病害种类及分布J.中国马铃薯，2008，22（1）：31-33. 9 刘程惠，胡文忠.不同贮藏温度下鲜切马铃薯的生理生化变化J.食品与机械，2008，24（2）：38-42. 10 李国龙，吴海霞，温 丽.作物抗旱生理与分子作用机制研究进展J.中国农学通报，2010，40（23）：1