【毕业学位论文】（Word原稿）普通菜豆抗炭疽病基因分子标记鉴定及抗病种质遗传多样性分析作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 普通菜豆抗炭疽病基因分子标记鉴定 及抗病种质遗传多样性分析 .） .） I 摘 要 本研究以 127 份抗炭疽病 普通 菜豆种质 （包括中国普通菜豆 40 份，来源于 普通菜豆69 份，来源于其他国家的普通菜豆 18 份 ） 为材料， 利用现代生物技术 进行抗炭疽病基因分子标记鉴定和抗病种质遗传多样性分析。 利用 12 个 含 不同抗菜豆炭疽病 基因或基因组合的菜 豆品种 （鉴别寄主） 评价了 7 对 已经报道的 抗炭疽病基因 记 引物的可靠性。 确认 5 个 记 以 分别 用于抗炭疽病基因 分子鉴定；另外 2 个 记 050 对 有特异性扩增 。 在此基础上，以 5 对有效扩增的 物对 127 份抗病种质 和 12 份鉴别寄主 进行了抗炭疽病基因分子标记鉴定， 从127 份抗病种质中 共鉴定出含有 抗炭疽病基因 种质 13 份，含有 种质 13 份，含有 种质 5 份， 含有 种质 10 份， 含有 种质 12 份。 本 研究还 选用 29 对 物， 对 127 份 抗炭疽病 菜豆种质资源的基因组 行扩增，分析其遗传多样性和对今后抗炭疽病育种的利用前景， 获得以下 主要 结果： （ 1） 29 对引物在 127 份抗病材料中共扩增出 95 个等位变异，平均每个位点有 等位变异 ，平均相似系数为 存在显著性差异。 （ 2） 按不同国家和国内不同省份， 将 127 份 抗病种质 分为 11 组， 来源于 黑龙江的 抗病种质 遗传多样性最高 ，多态信息含量（ 为 来源于 日本 的抗病种质 遗传多样性 最低 ，多态信息含量（ 为 黑龙江和云南 的抗病种质遗传 相似系数最大 ， 为 来源于 云南和抗病种质遗传 相似系数 次之， 为 日本和加拿大 的抗病种质遗传 相似系数最小 ， （ 3） 如按 国内材料 、 国外材料和 料 分组分析，其 遗传多样性大小顺序是 ： 国内材料 国外材料 料。 （ 4） 用 件进行遗传相似系数 计算 和聚类分析，将 127 份 抗病种质 分为两大类， 第 I 类 108 份材料， 又可细分为 6 个亚类， 第 19 份 材料 。 来自同一地区的品种较多地聚 为 一 类 ，遗传背景较近。 同时 分析 了 7 个类群的遗传多样性，聚在第 的 19 份材料遗传多样性最高，聚在第 I 类 A 亚类的 5 份材料遗传多样性最低。 关键词： 普通菜豆； 炭疽病 ；抗病基因； 分子标记 ； by 5 27 At 27 by 9 (40 18 9 2 of 3 of 3, ,0, 2 of in by A 5 SR a by of up in on of of on 9 of 录 第一章 文献综述 . 1 普通菜豆的起源与传播 . 1 起源 . 1 传播 . 1 普通菜豆的国内外研究与生产概况 . 1 国内外研究现状 . 1 生产概况 . 2 普通菜豆抗炭疽病基因鉴定 . 3 菜豆炭疽病 . 3 普通菜豆炭疽病病害病症 . 4 病菌培养、接种及品种抗性评价 . 4 普通菜豆炭疽病的综合防治 . 4 病菌的生理分化 . 4 普通菜豆抗炭疽病基因的分子标记 . 6 抗病基因标记的主要方法 . 7 普通菜豆抗炭疽病种质遗传多样性研究 . 8 遗传多样性的概念 . 8 遗传 标记 . 9 分子标记 . 9 普通菜豆遗传多样性研究 . 11 研究目的及意义 . 12 第二章 普通菜豆抗炭疽病基因分子标记鉴定 . 13 材料与方法 . 13 材料 . 13 实验材料总 提取 . 17 引物 . 18 分子标 记鉴定 . 19 扩增体系 . 19 扩增程序 . 19 扩增产物的检测 . 19 特异性 增产物的生物学功能分析 . 20 扩增产物克隆与测序 . 20 扩增产物序列比对分析 . 21 抗菜豆炭疽病种质的杂交 . 21 结果与分析 . 21 对已发表的抗菜 豆炭疽病基因的 记检测 . 21 记在抗炭疽病种质中的扩增 . 22 分子标记鉴定结果分析 . 25 12 份鉴别寄主 记的鉴定结果 . 25 抗炭疽病基因的分子标记鉴定 . 26 不同来源菜豆种质中抗炭疽病基因标记的分布特点 . 26 对菜豆炭疽菌具有多小种广谱抗性种质的筛选 . 27 . 27 回收获得的 质粒扩增产物 . 27 比对结果 . 28 交组合 . 31 讨论与小结 . 31 鉴定抗病基因标记的意义 . 31 记和 记 . 32 抗病种质所含有的抗病基因与地理来源的关系 . 32 抗病基因 子标记 . 32 第三章 普通菜豆抗炭疽病资源遗传多样性研究 . 33 材料与方法 . 33 材料 . 33 实验材料总 提取 . 33 物 . 33 子标记分析 . 35 扩增体系 . 35 扩增程序 . 35 聚丙烯酰胺凝胶电泳 . 35 统计分析方法 . 36 结果与分析 . 37 物 . 37 国内材料、国外材料和 料遗传多样性差异分析 . 40 不同国家和国内不同省份材料的遗传多样性分析 . 41 127 份普通菜豆种质 类分析 . 42 聚类结果 . 42 相似系数分析结果 . 45 聚类后各组间的遗传多样性分析 . 45 讨论与小结 . 47 第四章 全文结论 . 48 参考文献 . 49 致 谢 . 55 作 者 简 历 . 56 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段 长度多态性 离群体分组分析 际热带农业研究中心 cM 摩 氧核糖核苷酸 达序列标签 单序列重复间区 丙烯酰胺凝胶电泳 合酶链式反应 量性状位点 机扩增多态性 制片段 长度多态性 列特异性扩增区域 核苷酸多态性 单重复序列 ,N,N,N联重复变异值 中国农业科 学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 普通菜豆的起源与传播 普通菜豆，学名 .；中文别名有四季豆、芸豆、饭豆，英文名为 色体 2n=22。分类上属豆科（ 蝶形花亚科（ 菜豆族（ 菜豆属（ 菜豆种。 从用途上主要分为两类，即粒用菜豆和荚用菜豆。 普通菜豆是世界上种植面积最大的食用豆类。一年生短日性草本植物，喜 温暖，不耐霜冻，生育期短，一般品种需无霜期 105120 天；植株类型有直立型、半蔓型和蔓生 型；粒色有白、绿、黄、灰、褐、紫、红、蓝、黑和花斑。普通菜豆含有丰富的营养成分，富含碳水化合物、蛋白质、矿物质、多种维生素和 8 种人体所必需的氨基酸，既可作为粮食（粒用菜豆品种）又可作为蔬菜（食荚菜豆品种）， 某些 品种还有药用价值（ M,1979）。对我国部分普通菜豆种质资源分析结果表明，籽粒含蛋白质 脂肪 并含有各种矿物质（郑卓杰 ， 1983； 郑卓杰等， 1995)。 起源 19 世纪以前 ， 普通菜豆一直被认为起源于亚洲， 19 世纪末首先由 1880）提出普通菜豆起源于美洲，考古学、历史学、植物学、语言学等资料证明普通菜豆起源于美洲。有两个独立的起源中心，即 “ 中美中心 ” 和 “ 安第斯中心 ” 。野生菜豆在这两个中心分别被驯化成栽培植物，然后才逐渐被引入世界各地，包括南美、北美、非洲、欧洲和亚洲的一些地区。我国被认为是菜豆的次级起源中心，但尚缺乏直接的有力证据（严小龙等， 1994）。 传播 哥伦布发现美洲以前，普通菜 豆已经在美洲广泛传播，之后由西班牙人传入欧洲、非洲及世界其它地区。有的学者认为，中国栽培的菜豆是 15 世纪直接从美洲引入的 ， 至今已有 500 余年的栽培历史。 1654 年归化僧隐元将菜豆从中国传到日本（ et 1991；郑卓杰等， 1995） 。 普通菜豆的国内外研究与生产概况 国内外研究现状 据联合国粮食与农业组织 （ 1996） 资料，全世界有 30 多个国家保存的菜豆种质资源共计 105,266 份，野生资源 6084 份。世界各国对菜豆资源研究非常重视， 国际热带农业研 究中心中国农业科 学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 （ 对所有的资源进行了农艺性状鉴定，并对大部分资源进行了抗病性、抗虫性、抗旱（涝）性、耐盐性、耐热性、耐酸性等鉴定 ，筛选出抗病 虫、抗（ 耐 ）逆性强 的材料 提 供给全世界的育种单位利用 ， 并 已成功地将野生种抗豆象基因转移到栽培种的高代品系中，获得了抗豆象的优良品系 （ 郑卓杰等， 1995） 。许多国家在普通菜豆种质资源研究上取得很大进展。 （ 1997）对种植在 西班牙西北部 ） 地区四种不同环境下的 56 个菜豆品种的 18 个农艺性状进行了遗传多样性研究，结果表明，品种间所有性状均 有显著差异，多数品种都有明显的基因环境互作现象； 鉴定出 16 个 早熟、高产、长荚、大粒等具有重要育种价值 的品种 。 （ 1998）比较了墨西哥普通菜豆核心资源与基础保存资源的 记和形态性状，比较结果显示两者差异不显著，即核心样品基本代表了基础保存资源的遗传多样性。 （ 2000） 基于 子标记，分析了中美洲起源中心普通菜豆地方种的遗传多样性结构，结果显示， 分组结果 与根据形态性状和农艺性状分组的结果部分一致，中美洲中心普通菜豆种质资源类型多，遗传多样性十分丰富。 近年 来 ， 随着分子生物 学的 迅猛 发展，应用分子标记已经对菜豆的抗病基因做了大量的研究工作。已报道 4 个花叶病毒病抗性基因：抗病基因 I 定位在 色体 上 （ ， 1999）， 位在 色体 上 （ et 1997； ， 1999； et 2000） ， 因定位 在 色体 上 （ et 2000） ， 因定位 在 色体 上 并与 锁 （ et 1999） 。 I、 有 记，分别为 已发现了10 个菜豆抗锈病基因和 3 个未命名的抗锈基因， 10 个已命名抗锈病基因 分别为 和 两个 锈病 基因。 并 已经明确， 因位于色体 上， 于 色体 上， 于 于 色体上 。其中 6 个 基因 （ 2 个 已有 记 ， 分别为 30。已有 2 个 菜豆 抗黄花叶病毒病基因（ 1 个主效 得了 记 70、 效 色体 上。菜豆细菌疫病抗性基因是由多基因控制 的， 也获得了 记 菜豆角斑病基因 得 了 记 中国对菜豆资源的正式研究始于 1978 年，已完成农艺性状鉴定和编目， 编目资源 4935 份；并对部分资源进行了抗逆性和抗病虫鉴定。 关于普通菜豆抗炭疽病基因的研究 ， 国外做了大量 工作，并 取得了很大的成绩，国内在这方面的研究 较少 。 生产概况 据联合国粮食与农业组织的统计（ 2005 年），全世界普通菜豆的总面积为 26,787,892产量为 19,191,304国普通菜豆总面积为 1,103,600总产量为 2,108,500产量高的国家依次为印度、巴西、墨西哥、缅甸、中国、乌干达、肯尼亚、美国、 坦桑尼亚、韩国 等。普中国农业科 学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 通菜豆在我国各省均有栽培，主产区分布在黑龙江、内蒙古、山西、陕西、贵州、云南等省（龙静宜， 1989； et 1991）。 普通菜豆抗炭疽病基因鉴定 菜豆炭疽病 菜豆炭疽病（ 是由菜豆炭疽菌（ 引起的一种真菌性病害，是世界菜豆生产中的主要病害之一。 1875 年在德国初次报道，病菌菌丝体生长发育适温 21 23 ，最高 30 ，最低 6 ，分生孢子在 45 条件下经10死。李永镐等（ 1995）利用 养基培养该菌结果表明：病菌菌丝在 5 以下不能生长，随着温度升高，生长量逐渐增加，适宜生长温度为 20 28 ，最适温度 25 ，在 35 的条件下，生长量明显下降， 35 以上病菌不能生长。 主要以潜伏在种皮下的休眠菌丝越冬，这种休眠菌丝存活力很强，可存活二年以上。菜豆播种后可直接 危 害子叶及子茎，引起初次侵染，然后又在病部表面产生分生孢子再次侵染。病害的潜育期一般为 47 天，当温度在 22 27 时为 5天，在 时为 7 天。菌丝体也可以随病残体留在地 里 越冬，但一般不能长久存活，即使在适宜的环境下存活期也不超过二年。在田间分生孢子借风、雨、昆虫传 播 （ 时全昌， 1983；曹季丹，1988；李传道， 1988） ，从寄主的表皮和伤口侵入。在叶片上先从叶脉侵入；在荚上能穿透荚壳进入种皮。病菌侵入豆荚后，在贮运过程中仍可继续发 育 。 炭疽病在 世界各地 有广泛的 分布，中国菜豆产区均有发生。由于病害发生期长，菜豆产量和品质同时受到严重影响，一般减产 20 30，重者绝产。中国是世界上重要的菜豆生产国之一 ，生产中的病害问题比较突出，其中炭疽病发生地区广泛 ， 危害严重。已有炭疽病发生的地区包括北京、天津、河北、内蒙古、山西、辽宁、吉林、黑龙江、江苏、浙江、福建、江西、河南、 湖南、广东、广西、四川、云南、陕西、台湾等，局部地区极为严重，对生产影响较大。 图 豆炭疽病 图 豆炭疽病 菌 国农业科 学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 普通菜豆炭疽病病害病症 病菌侵染菜豆叶片、荚、茎。叶部病斑多发生在叶背的叶脉上，沿叶脉扩展成小条斑，深褐色。荚上病斑初为长圆形，暗褐色，后期病斑中部凹陷，边缘褐色，空气潮湿时，病斑上布满砖红色分生孢子，在低温高湿条件下危害严重。 病菌培养、接种及品种抗性评价 病菌在 养基上 ， 于 23 黑暗下培养 15 天 ，收集菌落中产生的分生孢子并配置浓度为210 6 孢子 /接种液。在菜豆第一片真叶展开时喷雾接种，然后保湿 2 天 ，充分发病后调查。单株抗感分级以 6 级划分（吴全安， 1991），以 0、 1、 3 级为抗病， 5、 7、 9 级为感病。 表 s 养基的配方 A 材料 量 萄糖 酸镁 酸二氢钾 白胨 豆叶片汁液 少量 琼脂 1000养基 为 7 左右。 普通菜豆炭疽病的综合防治 防治普通菜豆炭疽病的最有效的方法是培育抗病新品种 ， 具体的防治方法包括： 1. 无病荚上采种并粒选种子。 2. 实行 2 年以上轮作，旧架条用 50代森铵 1000 倍液消毒。 3. 发病初期用 50托布津 500 倍液、 75百菌清 600 倍液喷雾。一般苗期喷药 2 次，结荚期 12 次，每次相隔 57 天。 4. 重病区选育抗病品种。 病菌的生理分化 菜豆炭疽病病菌生理分化比较复杂，不同国家和地区的 小种类型差异较大，鉴定研究采用的鉴别寄主除有国际通用的品种外，还有各自选用的品种，因此比较不同国家间生理小种研究结果较为困难。在国际上较早采用的生理小种鉴别寄主为 7 个菜豆品种： 9，并根据在鉴别寄中国农业科 学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 主上的抗感反应类型 ， 以希腊字母命名小种；而经 1988 年菜豆炭疽病国际研讨会上不同国家学者的充分讨论，建议采用含有不同抗炭疽病菌基因的菜豆品种作为国际 统一的菜豆炭疽病病原菌生理分化鉴定的鉴别寄主，同时生理小种的命名采用二进制法。这套统一的鉴别寄主包括 12 个品种： 922， 07262， 一的国际鉴别寄主中分别含有单一或多个不同的抗炭疽病基因，并有固定的小种命名（表 表 12个国际热带农业中心（ 别品种中所含有的 抗炭疽病基因 ( A,1988) to in 别寄主 病基因 因来源 种命名 - 2 4 9A 8 6 32 22 A 64 07262 A 128 A 256 A 512 36 A 1024 G 2333 A 2048 注： 1： 明来源于中美洲地区； A 表明来源于安第斯 (区 2：小种命名为二进制命名法 3： 005;et 005)； 炭疽病基因 et 003) 1： A=of ： n, n is to of 3： a by 1988）用 12 个鉴别寄主对巴西的 201 个病菌分离物进行鉴定，确立了 9 个生理小种 ，即 。 1988） 确定了德国西部有 和 5 个生理小种，优势小种为致病性强的 和 。并根据在鉴别寄主上的不同反应确定小种 为纯一的小种 ,而 ,和 进一步划分亚种为 1d , 1e, 2e, 1, 2, 1 和 2 。 2000）用 12 个鉴别寄主对 60 个病菌分离物进行了鉴定，确定了在西班牙北部 小种的存在，另外一个新的小种被确定为 根据二进制命名法确定 小种为小种 38， 种为小种 7。王晓鸣 等（ 1999） 用 12 个鉴别寄主对 53 个中国病菌分离物进行鉴定，鉴别出的 11 个生理小种，除 17、 81 和 119 小种国外已有报道外 ，其余 8 个小种均为中国特有，表明中国菜豆炭疽菌的致病性分化有其独特的路线。 中国农业科 学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 普通菜豆抗炭疽病基因的分子标记 已知抗炭疽病 11 个基因中， 9 个基因（ 被确认为独立显性基因（ et 2003； et 1999； et 2002； et 2001； et 1996a； et 1996； et 1998；et 1997） , 等位基因， 隐性基因（ et 2003）。 记为 000； 3 个 记 ， 分别为： 050 ； 记为 记为 记为 两个 记为 记为 由此 可知 5 个菜豆抗炭疽病基因已有 记， 3 个菜豆抗炭疽病基因已有 记。关于 普通菜豆抗炭疽病基因 的 子标记未见报道。 关于 等位基因有两个依据： （ 1） 等位性检测和遗传连锁分析表明 ， 因在色体 上与 点 相同 （ et 2004）。 （ 2） 对 普通菜豆品种 毒性的 25