科研平台与科研方法

检验平台对科研的支撑作用,科研模式,人体,器官,组织,细胞,蛋白,RNA,DNA,转录因子,转录,反转录,合成,信号通路,调控,动物,动物器官,组织,细胞,蛋白,RNA,DNA,转录因子,转录,反转录,合成,信号通路,调控,检验支撑平台,一、核酸提取平台,二、核酸检测平台,（一）微量核酸、蛋白定量仪,（二）PCR(聚合酶链式反应)扩增PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95）下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（3755）情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下,以引物3端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以53方向延伸,合成DNA新链.这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子.如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍。,（三）DNA重组与分子克隆,1、目的基因的获取,2、克隆载体的选择与改建,3、外源基因与载体的连接,4、重组DNA导入受体细胞,大肠杆菌,6、重组体的复制,7、目的基因提取、纯化,5、重组体的筛选,细菌培养,破坏细菌，提取DNA，电泳,DNA分子克隆过程,8、电泳,（四）荧光定量PCR,（五）电泳,P=0.006*,P=0.014*,P=0.199,BE:BEAS-2Bcell,-actin,IL-6,（六）基因芯片,GeneExpressionofCellSurfaceAdhesionMoleculesonEpithelialCells,BE,BE+TNF,ICAM1,BE+TNF,BE,-actin,Control,TNF-,ICAM-1,BE:,BEAS-2Bcell,BE+EOS,BE+EOS+LPS,BE+EOS+TNF,Control,IL-8,IL-8,IL-8,IL-8,IL-6,IL-6,IL-6,IL-6,BE,（七）DNA倍体分析,G0/G1期DNA含量为2C,1、正常细胞DNA含量2C水平,2、性细胞DNA含量为1C,3、处于增殖期至分裂期细胞由2C增加至4C,4、凋亡细胞DNA断裂,90%Reiters综合征阳性率70-90%银屑性关节炎阳性率50-60%眼色素层炎阳性率40-50%溃疡性结肠炎伴关节病阳性率5-10%,2.细胞周期分析,G1,Sphase,G2,M,G1,1,21,DNA含量,G0-G1,S,G2-M,FluorescenceIntensity(DNAcontent),#ofEvents,2C,4C,细胞周期分析用于化疗药物选择及预后分析：通过DNA含量分析的细胞周期分布，可反映肿瘤细胞的增殖状态，有的放矢使用细胞周期特异性和非周期特异性药物，最大程度杀死肿瘤细胞保留正常细胞。急性白血病患者S期细胞越多，化疗后肿瘤细胞减少越明显，化疗药物有效的病例，在血液学和临床显效前，S期细胞增多，这对于早期预报临床疗效有一定价值。,临床应用,细胞DNA倍体分析用于肿瘤诊断：DNA非整倍体的出现率和癌变与不典型增生程度密切相关。DNA非整倍体可能是癌前病变发生早期癌变的一个早期标志。208例不同类型癌前病变细胞DNA倍体分析，在45例为DNA非整倍体病例中，22例发生癌变。DNA非整倍体的出现率和癌变与不典型增生程度密切相关。DNA非整倍体可能是癌前病变发生早期癌变的一个早期标志。,临床应用,有人对组织学证实的慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和晚期胃癌组织做流式细胞仪DNA分析，结果显示三者DNA非倍体率分别为0（0/10例）、20%（2/10）和90%（36/40）；同时三者在S期细胞比率和细胞增殖指数也顺序增加。,临床应用,流式细胞技术发展小结,从定性分析进入