血液学第四章--第二节--第三节PPT课件

-,1,第二节细胞化学染色检验,-,2,细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。,-,3,细胞化学染色临床上用于：,辅助判断急性白血病的细胞类型。因为不同细胞系列，其所含的化学物质成分、分布及含量各有不同，且随着细胞的逐渐成熟，化学物质的含量等发生相应的变化。因此根据细胞化学染色结果的不同，可推断所属的细胞系列，如过氧化物酶染色、非特异性酯酶染色、特异性酯酶染色等。故临床上急性白血病细胞类型的判断需要结合细胞化学染色。辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。因为血细胞在病理情况下，其化学物质成分及含量会发生改变，以辅助疾病的诊断，如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。观察疾病疗效和预后。发病机制的探讨。所以，细胞化学染色是诊断血液系统等疾病不可缺少的手段。,-,4,不同细胞化学染色，染色步骤不同，但基本步骤为固定、显示及复染。1、固定为了保持细胞结构及化学成分的不变，需对细胞进行固定。根据染色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。固定的方法有物理法和化学法固定，临床上常用的是化学法固定。物理法包括干燥和火焰固定，化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定，分为蒸气固定和液体固定。,-,5,（1）蒸气固定：甲醛是一种常用的固定剂，甲醛极易挥发、氧化，故常用40%甲醛进行蒸气固定。即在较封闭的玻璃器皿中加入40%甲醛，将涂片血膜朝下，固定510min。（2）液体固定：将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可用两种或两种以上固定液混合面成，如10%甲醛甲醇液、甲醛丙酮液等。,-,6,2、显示通过不同化学反应，最终形成稳定的有色沉淀，显示出被检测的化学物质。常用的化学反应种类有以下几种：（1）偶氮偶联法：含萘酚的底物，在相应酶的作用下释放出萘粉，萘粉与重氮盐结合，偶氮偶联形成有色沉演。重氮盐的种类有坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝B、六偶氮付品红等。如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。,-,7,（2）联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶，能分解过氧化氢释放出新生态氧，使无色的联苯胺氧化形成有色沉淀，如过氧化物酶染色。（3）普鲁士蓝反应：细胞内、外的铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成如亚铁氰化钾蓝色沉淀，如铁染色。（4）雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘酸-雪夫反应。（5）金属沉淀法：金属及其化合物一般都有颜色，故形成的沉淀物为有色物质，如钙钴法中性粒细胞碱性磷酸酶染色。,-,8,3、复染复染的目的在于使各种细胞能显示出来以便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，既能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果。如铁染色复染常用中性红，过碘酸-雪夫反应常用甲基绿。对核着色效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等，使浆着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。复染后，首先要通过显微镜观察染色是否成功（如过氧化物酶染色、碘酸、雪夫反应等可观察中性成熟粒细胞是否呈强阳性），然后观察相应细胞的染色结果并报告结果，结果的报告一般包括阳性率、积分或阳性分布情况。,-,9,细胞化学染色的种类有很多，下面介绍过氧化物酶染色、苏丹黑染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色、铁染色及酯酶染色。酯酶有多种，根据PH不同分为酸性、中性和碱性酯酶；根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶和非特异性酯酶。非特异性酯酶包括酸性非特异性酯酶（即酸性a-醋酸蔡酚酯酶）、碱性非特异性酯酶（即a-丁酸蔡酚酯酶）和中性非特异性酯酶，后者包括a-醋酸萘酚酯酶、醋酸AS-D萘酚酯酶等。下面逐项介绍各种细胞化学染色。,-,10,一、过氧化物酶染色,原理过氧化物酶(peroxidase,POX)染色方法有Washburn法、四甲基联苯胺法和改良的Pereira染色法等。前者曾是最为常用的方法，但由于其底物联苯胺具有致癌性，故现常用后两者，下面分别介绍这两种方法的原理。四甲基联苯胺法粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，POX能分解H2O2而释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。改良的Pereira染色法粒细胞和部分单核细胞中POX能分解H2O2而释放出新生氧，使碘化钾氧化生成碘，碘再与煌焦油蓝作用形成蓝绿色沉淀，定位于酶活性的细胞质内。,-,11,正常血细胞的染色反应,1、粒细胞系统分化差的原粒细胞为阴性，分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性；且随着细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强。中性分叶核粒细胞为强阳性反应，但衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性；嗜酸性粒细胞阳性最强，其阳性颗粒粗大、有折光性；嗜碱性粒细胞为阴性。2、单核细胞系统大多数单核细胞系统的细胞呈阴性或弱阳性，阳性颗粒少而细小。3、其他细胞淋巴细胞系统、红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性，浆细胞、组织细胞也呈阴性，吞噬细胞有的呈阳性。,-,12,临床评价POX染色是临床上辅助判断急性白血病细胞类型首选、最重要的细胞化学染色。但在观察要辨认的细胞POX染色结果前，首先要注意观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。,-,13,1、帮助鉴别急性白血病的类型（1）急性粒细胞白血病，白血病性原始粒细胞可呈阳性反应，阳性颗粒一般较多，较粗大，常呈局限性分布，但阴性时也不能排除本病；急性淋巴细胞白血病时，原始淋巴细胞和幼稚淋巴细胞均呈阴性反应，但可有少许阳性细胞，此系残留的原粒细胞，故FAB分型规定急性淋巴细胞白血病其阳性率10%），并伴有吞噬细胞增加，形成“星空样”图像。巨核细胞增加，但形态正常；嗜酸性和嗜碱性粒细胞有时较多；核分裂象多见，但无病理性核分裂象；间质轻度水肿，出血，网状纤维无异常改变，部分慢粒可发展成或伴有骨髓纤维化，此时网状纤维可增加。8、慢性淋巴细胞白血病骨髓增生极度活跃，正常造血组织部分或完全受抑制，脂肪细胞大部分或完全消失；细胞组成以单型性小圆淋巴细胞多见，大淋巴细胞型较少见，大、小淋巴细胞混合型罕见，形态常较一致，细胞呈弥漫，结节或漫合性浸润；结节一般大于骨髓内的正常淋巴小结且无生发中心；切片可见局限性纤维组织增生；可有骨小梁破坏现象，可见骨碎片，间质充血。,-,75,9、骨髓增生异常综合征骨髓增生明显或极度活跃（约15%的MDS属增生减退型）。切片内除可检出红系病态造血外，多数尚可检出巨核系病态造血现象。切片内出现35个以上原始与早幼粒细胞聚集成簇，位于小梁间区或小梁旁区者，这种现象称之为未成熟前体细胞异常定位，对诊断有较大特异性。骨髓组织学特征之一是切片内检出不典型微巨核细胞，直径1015um，在真空和冷处理的塑包切片上呈a-萘酚醋酸酯酶（ANAE）强阳性。间质水肿，出血，肥大细胞，浆细胞增多。（5）间质内可见嗜酸，嗜碱性粒细胞浸润。10、多发性骨髓瘤骨髓增生明显活跃，脂肪细胞与正常造血组织均减少，以小梁间区不同分化程度的浆细胞弥漫性浸润占优势，正常骨髓结构被破坏。切片以单一性瘤细胞浸润为主，当肿瘤性浆细胞分化较好时，形态类似于正常成熟浆细胞，当瘤细胞分化较差时，异形性大。核仁明显，胞质嗜碱性，胞质及核内常可找到嗜酸性包涵体，为识别浆细胞的特征之一。有人认为骨髓内浆细胞均一性，结节性聚集最具诊断价值。间质水肿，出血，基质增多。,-,76,11、恶性组织细胞病骨髓增生活跃或增生明显活跃，造血组织与脂肪组织容积一般正常，早期骨髓组织结构多数仍保持正常，随病情进展，骨髓正常组织被破坏。幼红细胞岛及幼粒细胞岛增生正常，巨核细胞形态与数量基本正常。肿瘤性组织细胞可分为5种类型：淋巴样组织细胞，单核样组织细胞，吞噬样组织细胞，异常组织细胞及多核巨细胞型组织细胞，其中具有较高诊断价值的是异常组织细胞及多核巨细胞型组织细胞。12、骨髓纤维化骨髓造血组织容量早期正常，晚期减少，脂肪组织容量也减少，骨髓基质增多。造血组织与纤维增生，变性区相互交织，可见成纤维细胞在切片中弥散分布。单位面积内巨核细胞增多或正常，常聚集成簇，且具明显多形性，其他造血细胞数量减少，甚至仅残留少数不典型的幼稚及成熟细胞。,-,77,13、真性红细胞增多症骨髓增生多数（82.4%）呈极度活跃，脂肪细胞消失，血窦受压而狭窄；或增生较活跃(17.6%)，可见少数脂肪细胞。粒、红、巨核三系细胞不同程度增生，呈散在分布。粒系细胞增生活跃，各阶段比例与分布均正常，近骨小梁表面偶见成片的早幼、中幼粒细胞；远离骨小梁区，杆状，分叶核粒细胞较多，嗜酸性粒细胞增多。骨小梁旁常见扩张的血窦，窦内充满粒、红系各阶段细胞。红系细胞增生活跃，各阶段细胞常呈散在分布，